Name: A Simple Red Blood Cell Lysis Methode voor de oprichting van B lymfoblastoïde cellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het opzetten van B-lymfoblastoïde cellijnen met behulp van erytrocytenlyse en Epstein-Barr virus. Deze techniek vereist slechts 0,5 milliliter bloed en bespaart aanzienlijk tijd.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de belangrijkste projecten van de Chinese Academie van Wetenschappen (KFZD-SW-205), strategisch ondersteuningssysteem voor biologische bronnentechnologie van de Chinese Academie van Wetenschappen (CZBZX-1).

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Instituut voor Genetica en Developmental Biology, en het protocol volgt de institutionele richtlijnen voor het menselijk welzijn. 1. Bereiding van EB Virus <ol><li> Op dag 1, ontdooien B95-8 cellen en kweek in 6 ml compleet RPMI 1640 medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine en antibiotica (100 pg / ml streptomycine, 100 U / ml penicilline) in een T25 kolf. Plaats de kolf in 5% CO2 incubator bij 37 ° C. </li><li> Op dag 2, acht de cel morfologie onder een microscoop. Cellen zijn in goede conditie als ze zijn licht en rond. Voeg 10 ml compleet RPMI 1640 medium. </li><li> Op dag 4, voeg 10 ml vers compleet RPMI 1640 medium, en vervolgens over een T75 kweekfles. </li><li> Op dag 8, voeg 20 ml compleet RPMI 1640 medium. </li><li> Handhaaf de cellen gedurende 8 dagen zonder toevoeging van vers medium, dat wil zeggen, verhongering. </li><li> Op dag 16, acht cellenWaargenomen onder de microscoop. Verzamel de cellen in een 15 ml centrifugebuis, 12 ml / buis. </li><li> Cryo-behouden bij -80 ° C gedurende 1 uur, en vervolgens snel ontdooien bij 37 ° C. Herhaal 3 totdat het virusdeeltjes vrijkomen uit de cellen. </li><li> Centrifugeer bij 240 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,22 urn filter, portie, 12 ml / buisje en bewaar bij -80 ° C. </li></ol> 2. Behandeling van volbloed met rode bloedcel lysisbuffer <ol><li> Voeg 0,5 ml volbloed antistolling door EDTA · K 2 tot 15 ml buis. </li><li> Zet 1 ml rode bloedcellen lysis buffer (gefiltreerd door 0,22 urn filter en ontdooid tot kamertemperatuur vóór gebruik) het bloed en meng goed. Plaats het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 4 min. snel 7 ml 1x PBS aan de aanslag reactie - voeg dan 5. </li><li> Centrifugeer bij 240 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Witte bloedcellen neerslaan op de bodem van de buis. </li><li> Verwijder het supernatant, en was de neerslag door toevoeging van 7 ml 1640 basisch medium. Centrifugeer 5 min bij 240 xg bij kamertemperatuur. Herhaal dit twee keer. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 300 ul transformatie medium (RPMI 1640 medium dat 20% foetaal runderserum en 10 pg / ml fytohemagglutinine (PHA)). </li></ol> 3. EBV-infectie <ol><li> Voeg 60 ul van 20 ug / ml cyclosporine A (CsA) aan de celsuspensie. </li><li> Snel ontdooien een hoeveelheid EBV bij 37 ° C. Voeg 240 ul EBV aan de celsuspensie. </li><li> Meng goed en zet de celsuspensie op een 96-well plaat, 200 ul per putje. Verdamping plaatsvindt, voeg 200 ul 1x PBS aan elke well wordt rond de 96-well plaat. Plaats de plaat in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C. </li></ol> 4. Uitbreiding en cryopreservatie van B-LCL <ol><li> Verander de helft van het medium eenmaal per week gedurende de eerste maand na EBV infectie. Alleen een dikke layer uit celfragmenten zichtbaar onder de microscoop op dag 7 (Figuur 2). Na een maand van EBV infectie lymfoblastoïde celclusters zichtbaar onder een dikke laag celfragmenten onder de microscoop (Figuur 2). </li><li> Verander de helft van het medium om de 3 dagen tot de celgroepen duidelijk zichtbaar onder de microscoop (Figuur 2). Meestal is dit proces duurt 10 tot 20 dagen. </li><li> Na mengen Pipetteer de cellen en overbrengen naar de 24-well plaat. Het dubbele van het volume van het kweekmedium met volledig RPMI 1640, terwijl het geel wordt. Dit proces is afhankelijk van de snelheid van celgroei. </li><li> Vervolgens brengen de cellen T25 kweekfles. Het dubbele van het volume van het kweekmedium zo blijkt gele totdat het volume van het medium uit tot 10 - 15 ml. </li><li> Verander medium 24 uur voor het invriezen. Centrifugeer celsuspensie gedurende 5 minuten bij 240 x g. Aantal cellen met een celteller en bevriezen bij een dichtheid van 5-10 x 10 6 / mL in frozen voorraadoplossing die 90% FBS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Invriezen bij een snelheid van 1 ° C per minuut tot -80 ° C en breng onmiddellijk in vloeibare stikstof. </li></ol> 5. 3- (4,5-dimethylthiazool-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay 17 <ol><li> Bereid een B-LCL enkele celsuspensie met 1640 medium dat 10% foetaal runderserum. Zaad 3 x 10 4 cellen per putje op 96-well plaat, 100 ul per putje. </li><li> Plaats de plaat in 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 12-16 uur. </li><li> Voeg MTT (5 mg / ml) aan putjes die cellen groeien en weg te houden van licht gedurende 4 uur bij 37 ° C. </li><li> Centrifuge cel plaat gedurende 10 minuten bij 168 x g. </li><li> Verwijder supernatant en voeg 100 ul DMSO per putje. LET OP: Wees voorzichtig. Raak de naaldvormige kleurstof kristallen. </li><li> Schud de plaat gedurende 10 minuten bij lage snelheid om de kristallen volledig te ontbinden. </li><li> Meet absorptie bij 570 nm doormet behulp van een microplaat spectrofotometer. </li></ol>

<ol><li>Mohyuddin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+in+EBV-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).</li>
<li>Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+lymphoblastoid+cell+lines+from+monozygotic+twins+discordant+in+severity+of+autism+reveals+differential+regulation+of+neurologically+relevant+genes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes.</a> BMC Genomics. 7, 118(2006).</li>
<li>Toda, T., Sugimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Epstein-Barr+virus-transformed+B-lymphoblasts+and+the+proteome+database%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).</li>
<li>Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Epstein-Barr+virus-transformed+B+cell+lines+for+the+generation+of+immunoglobulin-producing+human+B+cell+hybridomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas.</a> J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+%26+characterization+of+lymphoblastoid+cell+lines+from+patients+with+multiple+primary+neoplasms+in+the+upper+aero-digestive+tract+%26+healthy+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals.</a> Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).</li>
<li>Neitzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Routine+Method+for+the+Establishment+of+Permanent+Growing+Lymphoblastoid+Cell-Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines.</a> Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).</li>
<li>Oh, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+rapid+establishment+of+Epstein-Barr+virus+immortalization+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes.</a> Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).</li>
<li>Louie, L. G., King, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel-Approach+to+Establishing+Permanent+Lymphoblastoid+Cell-Lines+-+Epstein-Barr-Virus+Transformation+of+Cryopreserved+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes.</a> Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).</li>
<li>Tremblay, S., Khandjian, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+use+of+long-term+frozen+lymphocytes+for+the+establishment+of+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines.</a> Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).</li>
<li>Reidy, J. A., Wheeler, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+age+and+Epstein-Barr+virus+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).</li>
<li>Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBV+immortalization+of+human+B+lymphocytes+separated+from+small+volumes+of+cryo-preserved+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood.</a> Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).</li>
<li>Lacelle, C., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+lymphoblastoid+cell+lines+from+frozen+blood+of+extremely+old+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals.</a> Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).</li>
<li>Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greatly+simplified+method+of+establishing+B-lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines.</a> Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).</li>
<li>Ventura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Simple+Method+for+the+Epstein-Barr+Virus+Transformation+of+Lymphocytes+from+Members+of+Large+Families+of+Reunion+Island%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Hered%22%5BJournal%5D)">Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island.</a> Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).</li>
<li>Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoblastoid+Cell-Lines+from+Frozen+Whole-Blood+-+a+Quick+and+Economical+Safeguard+for+Linkage+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis.</a> Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).</li>
<li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-Examination+and+Further+Development+of+a+Precise+and+Rapid+Dye+Method+for+Measuring+Cell-Growth+Cell+Kill%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill.</a> J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).</li>
<li>Bogoslovsky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+enumeration+of+endothelial+progenitor+and+endothelial+cells+from+peripheral+blood+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials.</a> Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).</li>
<li>Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+flow+cytometric+immuno-staining+of+T-cell+perforin+is+preserved+using+diethylene+glycol+for+erythrocyte-lysis+but+lost+by+the+use+of+ammonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride.</a> Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).</li>
<li>Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%3A+A+resource+for+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).</li>
<li>Tosato, G., Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+Virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22(2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Wij rapporteren de ontwikkeling van een nieuwe werkwijze voor het onsterfelijk maken van humane B cellen uit bloed door lyseren van rode bloedcellen en de cellevensvatbaarheid van gevestigde B-LCL werd geëvalueerd door de MTT-bepaling. De resultaten toonden aan dat de cellevensvatbaarheid van de bij de rode bloedcel lysis methode B-LCL veel hoger dan die van de dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze. Het grote voordeel van de rode bloedcellen lysis methode is dat het eenvoudig en vereist een klein volume (slechts 0,5 ml...

Rustende B-cellen kunnen worden getransformeerd door het Epstein-Barr virus (EBV) in vitro in actief proliferende B-lymfoblastoïde cellijnen (B-LCL's). B-LCL's zijn vergelijkbaar met kiemcellen in differentiatie en ontwikkeling, en de somatische mutatiesnelheid van B-LCL's was slechts 0,3%1, met verwaarloosbare genetische en fenotypische veranderingen. Daarom hebben B-LCL's, als surrogaat voor perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's), de voortgang van genomics, transcriptomics en proteomics studie van EBV-geassocieerde ziekten2,3 aanzienlijk versneld. Bovendien hebben B-LCL's ook een belangrijke toepassing bij het screenen van monoklonale antilichamen4,5. 
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld voor het immortaliseren van B-lymfocyten door EBV. De meest voorkomende procedures omvatten de isolatie van B-lymfocyten en het gebruik van B95-8-cellijnen om infectieus EBV te produceren. Van isolatie tot transformatie zijn deze methoden onderverdeeld in drie strategieën. Lymfocyten worden gescheiden van vers bloed door dichtheidsgradientcentrifugatie en directe EBV-transformatie6-8, genoemd dichtheidsgradientscheidingsmethode in deze studie. Andere technieken overwinnen echter de moeilijkheid van het verzenden van vers bloed en gebruiken een procedure voor het invriezen van gezuiverde lymfocyten en daaropvolgend ontdooien en EBV-infectie9-11. Geconserveerd volbloed kan ook worden gebruikt voor de isolatie van B-lymfocyten en transformatie12,13. Naast dichtheidsgradientcentrifugatie om B-lymfocyten te scheiden, gebruiken sommige onderzoekers een magnetische celscheider om B-lymfocyten te selecteren12. Magnetische scheiding is echter een dure, complexe en tijdrovende procedure. Hoewel deze methoden nuttig zijn om B-lymfocyten te immortaliseren met een hoge succesratio, vereisen de behandeling van een groot aantal klinische monsters en het relatief kleine bloedvolume een eenvoudigere methode voor de oprichting van een permanente cellijn.
Een andere, minder vaak gebruikte methode is het gebruik van volbloed als bron van gekernde cellen voor EBV-infectie en de oprichting van B-LCL's. Deze methoden vereenvoudigen de techniek door de scheidingsprocedure weg te laten. Slechts een kleine hoeveelheid volbloed, vers14 of bevroren15,16, is voldoende om de cellijnen te verkrijgen. Helaas is er veel variabiliteit in succes vanuit documenten15,16 en verschillende van onze validatietests. Bovendien zijn getransformeerde kolonies nauwelijks onder de microscoop te herkennen vanwege de grote verontreinigende onzuiverheden. Daarom is een betrouwbaardere methode voor transformatie vereist.
Op basis van de bovenstaande overwegingen hebben we een nieuwe methode ontwikkeld om B-LCL's op te richten zonder voorafgaande zuivering van de lymfocyten, genoemd de rode bloedcel-lyse-methode. Deze methode is handig, tijdbesparend en toepasbaar op een groot aantal monsters. Zo weinig als 0,5 mL volbloed was voldoende om B-LCL's te verkrijgen die gemakkelijk verkrijgbaar zijn van baby's en ouderen zonder hun gezondheid aanzienlijk te schaden.

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Centrifugation</td></tr><tr><td>Automated Cell Counter&nbsp;</td><td>Countstar</td><td>&nbsp;IC 1000&nbsp;</td><td>Voor celtelling&nbsp;</td></tr><tr><td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td><td>BioTek Instruments</td><td>SN263839</td><td>Voor het meten van de absorptie</td></tr><tr><td>96 well cell culture cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3599</td><td>Polystyreen platen</td></tr><tr><td>24 well cell culture cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Polystyreen platen</td></tr><tr><td>25 cm2 cell culture flask</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Polystyreen&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Onderdeel van B-LCLs medium</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td>Voor B-LCLs medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp;&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0374</td><td>Onderdeel van B-LCLs medium</td></tr><tr><td>100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Onderdeel van B-LCLs medium</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE&nbsp; Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Voor in vitro isolatie van lymfocyten</td></tr><tr><td>PHA-M</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>Voor het stimuleren van lymfocytproliferatie</td></tr><tr><td>Cyclosporin A</td><td>Cayman&nbsp; Chemical</td><td>12088</td><td>Voor het remmen van het cytotoxiciteitseffect van T-cellen</td></tr><tr><td>Red cell lysis buffer</td><td>Tiangen</td><td>RT122-01</td><td>Voor het lysen van rode bloedcellen</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Amresco</td><td>0793</td><td>Voor de detectie van cellevensvatbaarheid</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Voor het bevriezen van cellen</td></tr></tbody></table>

a simple red blood cell lysis methode voor de oprichting van b lymfoblastoïde cellijnen

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Er zijn een aantal methoden voor de transformatie van B-lymfocyten door het Epstein Barr-virus in vitro in geïmmortaliseerde cellijnen. We hebben een nieuwe methode ontwikkeld met een krachtige en eenvoudige strategie voor de oprichting van B-LCL's, de rode bloedcel lyse methode. Deze methode vereenvoudigde de PBMC-scheidingsprocedure met verwijdering van rode bloedcellen en gebruikte slechts 0,5 ml vol bloed voor het opzetten van EBV-geïmmortaliseerde cellijnen, die kunnen prolifereren tot grote celnummers in een relatief korte tijd met een succespercentage van 100%. De methode is eenvoudig, betrouwbaar, tijdbesparend en toepasbaar op een groot aantal klinische monsters.

Tijdens het transformatieproces worden de morfologische veranderingen van de cellen gevisualiseerd door lichtmicroscopie (figuur 2). Kleine clusters van cellen waren duidelijk zichtbaar met de dichtheidsgradiënt scheidingsmethode 7 dagen na infectie, terwijl slechts een dikke laag celfragmenten zijn zichtbaar vanaf de rode bloedcellen lysismethode. Echter, lymfoblastoïde cel clusters zijn zichtbaar onder de dikke laag celfragmenten 30 dagen na infectie. Met frequentere m...

Een eenvoudige rode bloedcel lysis methode voor het vaststellen van B-LCL werd ontwikkeld met hoge efficiency immortalisatie, die een kleine hoeveelheid bloed en tijdsbesparing van initiatie tot cryopreservatie.

A Simple Red Blood Cell Lysis Methode voor de oprichting van B lymfoblastoïde cellijnen

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Het algemene doel van deze eenvoudige methode is het opzetten van B-lymfoblastoïde cellijnen, of B-LCL's, met een hoge immortalisatie-efficiëntie met behulp van slechts een kleine hoeveelheid bloed, waarbij tijd wordt bespaard tussen de initiatie en de cryopreservatie. Dit is een nieuwe methode voor het immortaliseren van menselijke B-cellen uit volbloed door middel van lysis van rode bloedcellen. B-LCL's vormen een waardevolle bron van biomaterialen voor het uitvoeren van diverse studies.Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat slechts 0,5 milliliter bloed voldoende is om B-LCL's te verkrijgen met een immortalisatie-efficiëntie en een hoge cellevensvatbaarheid. Om B-LCL's te vestigen door B-lymfocyten te transformeren met het Epstein-Barrvirus, of EBV, wordt de veelgebruikte methode toegepast om afzonderlijke mononucleaire cellen uit perifeer bloed of PBMC te isoleren via Ficoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Echter, wanneer de monsterhoeveelheid minder dan één milliliter is, zal de toevoeging van het lysaat voor rode bloedcellen mislukken.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we merkten dat het isoleren van PBMC uit kleine rode bloedcellen moeilijk is met behulp van een dichtheidsgradiëntscheidingsmethode. Om EBV voor te bereiden, begin op dag één met het ontdooien van B95-8 cellen en kweek deze in een T25-kweekfles in zes milliliters compleet RPMI 1640-medium aangevuld met 10% FBS, twee millimol L-glutamine en antibiotica. Incubeer de kweek bij 37 °C en 5% CO₂.Observe op dag twee de celmorfologie onder een microscoop. Cellen zijn in goede conditie wanneer ze helder en rond zijn. Voeg 10 milliliters compleet RPMI 1640 Medium toe aan de cultuur.Voeg op dag vier 10 milliliters vers medium toe en breng de cellen over naar een T75-kweekfles. Voeg vervolgens op dag acht nog eens 20 milliliters medium toe en houd de cellen acht dagen lang in stand zonder vers medium toe te voegen. Controleer de cellen op dag 16 onder de microscoop. Verzamel vervolgens 12 milliliters cellen in 15 milliliter centrifugebuizen. Cryopreserveer de cellen daarna gedurende één uur bij minus 80 degrees Celsius en ontdooi de culturen snel bij 37 degrees Celsius. Herhaal deze vries-dooi cyclus nog drie keer totdat de viruspartikels uit de cellen zijn vrijgekomen.Centrifugeer de culturen bij 240 ×g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Filter vervolgens het supernatant door een 0,22 micron filter. Verdeel het filtraat in aliquaten van 12 milliliter per buis en bewaar de buizen bij -80 °C.Voeg 0,5 milliliter volbloed dat is anticoaguleerd met EDTA K2 toe aan een buis van 50 milliliter. Voeg één milliliter lysebuffer voor rode bloedcellen toe aan het volbloed en meng goed. Incubeer het mengsel vier minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens snel vijf tot zeven milliliter 1x PBS toe om de lysereactie te stoppen.Meng goed nadat de lysisbuffer voor rode bloedcellen aan het bloed is toegevoegd. Door te inverteren wordt gewaarborgd dat de reactie tijdig wordt beëindigd. Centrifugeer de buis vervolgens 5 minuten bij 240 ×g op kamertemperatuur.De witte bloedcellen zullen bezinken op de bodem van de buis. Verwijder het supernatant en was het precipitaat door zeven milliliters Basic Medium 1640 toe te voegen. Centrifugeer vervolgens de oplossing voordat u de wasstap herhaalt.Resuspendeer de celpellet met 300 µL transformatiemedium. Voeg vervolgens 60 µL van 20 µg/mL Cyclosporine A toe aan de celsuspensie om de EBV-infectie uit te voeren. Ontdooi een aliquot EBV snel bij 37 °C en voeg 240 µL van het virus toe aan de cellen.Meng de suspensie grondig en breng 200 µL per put over naar een 96-wellplaat. Incubeer de plaat vervolgens bij 37 °C en 5% CO2. Ververs gedurende de eerste maand na EBV-infectie één keer per week de helft van het medium in de celkweek.Op dag zeven is onder de microscoop slechts een dikke laag celfragmenten zichtbaar. Na één maand infectie zijn lymfoblastoïde celclusters zichtbaar onder een dikke laag celfragmenten. Ververs vanaf dit punt elke drie dagen de helft van het medium totdat de celclusters onder de microscoop duidelijk zichtbaar zijn.Breng na het resuspenderen van de cellen de suspensie over naar de wells van een 24-wellplaat. Verdubbel vervolgens, afhankelijk van de groeisnelheid van de cellen, het volume van het complete RPMI 1640-medium zodra het kweekmedium geel wordt. Wanneer lymfoblastoïde celclusters met het blote oog zichtbaar zijn, dient de kweek te worden overgebracht naar een T25-kweekfles.Zodra het kweekmedium geel wordt, wordt het volume van het medium verdubbeld totdat het volume is uitgebreid naar 10 tot 15 milliliters. Vervang het medium 24 uur voorafgaand aan het invriezen. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie om de cellen te kunnen invriezen en tel de cellen met een celteller.Pas de suspensie met de bevroren voorraadoplossing die 90% FBS en 10% DMSO bevat aan naar een dichtheid van vijf tot 10 × 10⁶ cellen per milliliter. Vries de suspensie vervolgens af met een snelheid van één graad Celsius per minuut tot -80 °C, voordat de bevroren cellen direct in vloeibare stikstof worden overgebracht. Tijdens het transformatieproces zijn de morfologische veranderingen van de cellen zichtbaar via lichtmicroscopie.Na zeven dagen infectie zijn kleine celclusters duidelijk zichtbaar met de methode van dichtheidsgradiëntscheiding, terwijl bij de methode van erytrocytenlyse slechts een dikke laag celfragmenten zichtbaar is. 30 dagen na infectie zijn lymfoblastoïde celclusters zichtbaar onder de dikke laag celfragmenten. Bij frequentere mediumverversingen wordt het celpuin verminderd en zijn de celclusters duidelijk zichtbaar, waarbij ze vergelijkbaar lijken met de cultuur die via dichtheidsgradiëntscheiding is opgezet.Ten slotte werd de MTT-assay gebruikt om de levensvatbaarheid van B-LCL's te evalueren. De hier getoonde resultaten geven aan dat de B-LCL-cellen die zijn gekweekt met de methode van hemolyse significant levensvatbaarder waren dan de cultuur die is opgezet met de methode van dichtheidsgradiëntscheiding. Zodra men hiermee bekend is, kan het proces van EBV-virale transformatie in 30 minuten worden voltooid mits dit correct wordt uitgevoerd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe B-LCL's kunnen worden gevestigd met een eenvoudige en tijdbesparende methode voor hemolyse, zonder voorafgaande zuivering van lymfocyten. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de voortgang van genomische, transcriptomische en proteomische studies naar EBV-geassocieerde ziekten versneld, evenals de toepassing hiervan bij de productie van monoklonale antilichamen. Vergeet niet dat het werken met menselijke pathogenen, zoals EBV, uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden getroffen bij het uitvoeren van deze procedure.

a-simple-red-blood-cell-lysis-method-for-establishment-b

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een efficiënt systeem van de structuur en functie analyse van een gen in...

Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen

We beschrijven een methode voor het genereren van getransformeerde B cellijnen met behulp van Epstein-Barr virus. We hebben ook illustreren een nieuwe test die kan identificeren B-cellen die zijn bestemd om de transformatie te ondergaan al drie dagen na de infectie.

Oprichting van Epstein-Barr Virus Growth-getransformeerde lymfoblastoïde cellijnen

In this video, we describe a method to study the organelle dynamics in B lymphocytes following their activation with antigen-coated microbeads.

Organelle Dynamics in B Lymphocytes following Activation with Antigen-Coated Beads

This video demonstrates an in vitro technique to stimulate lymphocytes via non-typeable Haemophilus influenzae (NTHi) and to assess the immune response. Incubating isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with NTHi causes the bacterial cells to stimulate T lymphocytes, leading to cytokine production. Upon inhibiting the secretion of cytokines, immunofluorescence staining is performed to detect the accumulated intracellular cytokines in stimulated T lymphocytes.

An In Vitro Technique to Stimulate Lymphocytes via Pathogenic Bacteria

This video demonstrates an assay investigating the role of neutrophil-like cells in safeguarding lymphoma cells against the cytotoxicity of chemotherapeutic agents. A 3D co-culture, consisting of lymphoma and neutrophil-like cells, is established and exposed to vincristine—a chemotherapy drug. Direct contact with the neutrophil-like cells induces an upregulation of anti-apoptotic proteins in the lymphoma cells, thereby promoting their survival in the presence of vincristine.

Determining the Role of Neutrophil-Like Cells in Lymphoma Cell Sensitivity to a Test Drug

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

T-lymfocyt-mitogenese gaat gepaard met blastogene transformatie, waarna het celvolume groter wordt voordat celdeling plaatsvindt. Hier beschrijven we een methode om blastogenese in T-lymfocyten te kwantificeren met behulp van een geautomatiseerde celteller met de mogelijkheid om celdiameters te meten.

Rapid Kwantificering van Mitogen geïnduceerde blastogenesereactie in T-lymfocyten voor het vaststellen van Immuunmodulerende Drugs

Een eenvoudige methode voor het verkrijgen van T-cel en NK klonen van CAEBV patiënten werd ontwikkeld met hoog rendement, een kleine hoeveelheid van perifeer bloed en een lage dosis van IL-2.

Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie

Chronische lymfatische leukemie (CLL) is de meest voorkomende leukemie in de westerse wereld. NFAT transcriptiefactoren zijn belangrijk regulatoren van ontwikkeling en activering in vele celtypes. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van chromatine immunoprecipitation (ChIP) in menselijke CLL cellen te identificeren roman doelgenen van NFAT2.

Een chromatine Immunoprecipitation Assay te identificeren van roman NFAT2 doelgenen in chronische lymfatische leukemie

Hier beschrijven we een nieuwe methode om de mechanismen van cellulaire immuniteit tegen Plasmodium tijdens het bloedstadium van infectie op te helderen. Dit is een in vitro test die geïnfecteerde rode bloedcellen dodental door cytotoxische lymfocyten meet.

In vitro Bepaling van plasmodium-geïnfecteerde rode bloedceldoding door cytotoxische lymfocyten

Leer een efficiënte methode voor het opzetten van B-lymfoblastoïde cellijnen met behulp van erytrocytenlyse en Epstein-Barr virus. Deze techniek vereist slechts 0,5 milliliter bloed en bespaart aanzienlijk tijd.

A Simple Red Blood Cell Lysis Methode voor de oprichting van B lymfoblastoïde cellijnen

Meer video's verkennen