A Simple Red Blood Cell Lysis Methode voor de oprichting van B lymfoblastoïde cellijnen

Het algemene doel van deze eenvoudige methode is om B-lymfoblastoïde cellijnen, of B-LCL's met hoge immortalisatie-efficiëntie te vestigen met behulp van slechts een kleine hoeveelheid bloed en tijd te besparen tussen initiatie en cryobewaring. Dit is een nieuwe methode voor het immortaliseren van menselijke B-cellen uit volbloed door rode bloedcellen te lyseren. B-LCL's biedt een waardevolle bron van biomaterialen om verschillende studies uit te voeren.

Het grote voordeel van deze methode is dat slechts 0,5 milliliter bloed voldoende is om B-LCL's te verkrijgen met immortalisatie-efficiëntie en hoge celviabiliteit. Om B-LCL's te vestigen door Epstein-Barr-virus, of EBV, om B-lymfocyten te transformeren, wordt de veelgebruikte methode gescheiden in perifere mononucleaire cellen of PBMC, door Ficoll-dichtheidsgradientcentrifugatie. Echter, wanneer het monster minder dan een milliliter rode bloedcellyse is, zal de toevoeging mislukken.

We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we ontdekten dat het iseisoleren van de PBMC van kleine rode bloedcellen moeilijk is met behulp van een dichtheidsgradientscheidingsmethode. Om EBV te bereiden, begin op dag een met het ontdooien van B95-8 cellen en kweek ze in een T25 kweekfles in zes milliliter compleet RPMI 1640 Medium gesupplementeerd met 10%FBS, twee millimolar van L-glutamine en antibiotica. Incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Op dag twee, observeer onder een microscoop de celmorfologie. Cellen zijn in goede conditie als ze helder en rond zijn. Voeg 10 milliliter compleet RPMI 1640 Medium toe aan de cultuur.

Op dag vier, voeg 10 milliliter vers medium toe en breng de cellen over naar een T75 kweekfles. Breng vervolgens op dag acht nog 20 milliliter medium toe en houd de cellen acht dagen lang zonder vers medium toe te voegen. Controleer de cellen op dag 16 onder de microscoop.

Verzamel vervolgens 12 milliliter cellen in 15 milliliter centrifugeerbuizen. Cryopreserveer vervolgens de cellen gedurende één uur bij min 80 graden Celsius en ontdooi snel de culturen bij 37 graden Celsius. Herhaal het invriezen en ontdooien nog drie keer totdat de virusdeeltjes uit de cellen zijn vrijgekomen.

Centrifugeer de culturen bij 240 keer g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Filter vervolgens de supernatant door een 0,22 micron filter. Verdeel 12 milliliter van het filtraat per buis en bewaar de buizen bij min 80 graden Celsius.

Voeg in een 50 milliliter buis 0,5 milliliter volbloed toe dat is geanticoaguleerd door EDTA K2.Voeg een milliliter lyse-buffer voor rode bloedcellen toe aan het volbloed en meng goed. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende vier minuten. Voeg vervolgens snel vijf tot zeven milliliter 1x PBS toe om de lyse-reactie te stoppen.

Na het toevoegen van rode bloedcellyse-buffer aan bloed, zorg ervoor dat het goed wordt gemengd. Inverteren zorgt ervoor dat de reactie tijdig wordt beëindigd. Centrifugeer vervolgens de buis bij 240 keer g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

De witte bloedcellen zullen aan de bodem van de buis bezinken. Gooi de supernatant weg en was het bezinksel door zeven milliliter 1640 Basis Medium toe te voegen. Centrifugeer vervolgens de oplossing voordat u de wasstap herhaalt.

Resuspendeer het cellijnsediment met 300 microliter transformatiemedium. Voeg vervolgens 60 microliter van 20 microgram per milliliter Cyclosporine A toe aan de celsuspensie om EBV-infectie uit te voeren. Ontdooi snel een aliquot van EBV bij 37 graden Celsius en voeg 240 microliter van het virus toe aan de cellen.

Meng de suspensie grondig en breng 200 microliter per putje over naar een 96-wellsplaat. Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Gedurende de eerste maand na EBV-infectie, ververs de helft van het medium in de celcultuur eenmaal per week.

Op dag zeven is er alleen een dikke laag celfragmenten zichtbaar onder de microscoop. Na een maand infectie zijn lymfoblastoïde celclusters zichtbaar onder een dikke laag celfragmenten. Vanaf dit punt ververs de helft van het medium elke drie dagen totdat de celclusters duidelijk zichtbaar zijn onder de microscoop.

Na het resuspenderen van de cellen, breng de suspensie over naar de putjes van een 24-wellsplaat. Breng vervolgens, afhankelijk van de snelheid van celgroei, de volume van compleet RPMI 1640 Medium dubbel wanneer het kweekmedium geel wordt. Wanneer lymfoblastoïde celclusters met het blote oog zichtbaar zijn, breng de cultuur over naar een T25 kweekfles.

Naarmate het kweekmedium geel wordt, verdubbel het volume van het medium totdat het volume 10 tot 15 milliliter is. Ververs het medium 24 uur van tevoren voor het invriezen. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie en gebruik een celteller om de cellen te tellen.

Met de bevroren stockoplossing die 90%FBS en 10%DMSO bevat, pas de suspensie aan tot een dichtheid van vijf tot tien keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Vries vervolgens de suspensie in met een snelheid van één graad Celsius per minuut tot min 80 graden Celsius voordat u de bevroren cellen direct in vloeibare stikstof overbrengt. Tijdens het transformatieproces zijn de morfologische veranderingen van cellen zichtbaar onder een lichtmicroscoop.

Na zeven dagen infectie zijn kleine celclusters duidelijk zichtbaar met behulp van de dichtheidsgradientscheidingsmethode, terwijl er alleen een dikke laag celfragmenten zichtbaar is van de rode bloedcellyse-methode. 30 dagen na infectie zijn lymfoblastoïde celclusters zichtbaar onder de dikke laag celfragmenten. Met meer frequente mediumverversingen wordt het celdebris verminderd en zijn de celclusters duidelijk zichtbaar en lijken ze op de cultuur die is gevestigd door middel van dichtheidsgradientscheiding.

Ten slotte werd de MTT-test gebruikt om de levens