Name: Isolatie van endotheliale cellen van gezonde vrijwilligers en hun trekkende Potential Beïnvloed door Serum monsters na Hartchirurgie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer een betrouwbare methode om endotheliale progenitorcellen uit perifeer bloed te isoleren en hun migratie naar serum van hartchirurgiepatiënten te evalueren. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar neovascularisatie na ischemische letsels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen bevestigingen.

Bloed voor de isolatie van EBV werd verkregen van gezonde vrijwilligers na geïnformeerde toestemming overeenkomstig de lokale ethische commissie. Serummonsters gebruikt in migratie assays werden verkregen van patiënten die conventionele hartchirurgie ondergingen met behulp van cardiopulmonaire bypass (CPB). Uitsluitingscriteria waren noodoperaties, bekende of vermoedelijke zwangerschap, patient`s leeftijd jonger dan 18 jaar, en het niet geïnformeerde toestemming te verkrijgen. Serummonsters werden getrokken naast klinische routinemetingen (onmiddellijk voor de operatie en vlak na myocardiale reperfusie / opening van aorta kruis-klem) en vervolgens bij -80 ° C totdat uiteindelijk opgeslagen. De Institutional Review Board (ethische commissie, RWTH Aachen University) goedgekeurd deze studie. De patiënten vertoonden een gemiddelde leeftijd van 68,6 jaar en een gemiddeld gewicht van 81,7 kg. Reeds bestaande ziekten omvatten: hypertensie (65%), chronische longziekten (19%), extra cardiale arteriopathie (16%), cerebrale stoornissen (6%), instabiele angina (3%), recent hartinfarct (28% binnen 90 d), chronische nierziekte (14%), leverziekte (2%) en diabetes (34%). 1. Coating van T75 Fles: <ol><li> Bereid 5 ml fibronectine-oplossing (1 mg menselijk fibronectine verdund in 15 ml ultrapuur water) per T75 fles. </li><li> Voeg de oplossing voor een T75 kolf en wachten tot het water is verdampt. Om onnodige onderbrekingen tijdens de isolatiewerkwijze door de verdamping te voorkomen, mag dit proces vooraf (bijvoorbeeld &#39;s nachts) en bij kamertemperatuur. Deze oplossing geeft 4,44 g fibronectine / cm 2. </li><li> Bereid de endotheliale celgroei medium MV2 door daaraan MV2 basaal medium met groeifactor leverden de fabrikant. </li></ol> 2. Isolatie van endotheliale voorlopercellen (EPC&#39;s) van 60 ml bloed: LET OP: Als de CD34-positieve selectie cocktail and de magnetische kralen zijn commercieel verkrijgbaar in een kit gecombineerde selectie, er geen concentraties van de fabrikant. Echter, ongeveer 100 pl van het antilichaam voldoende voor verwerking tot 5 x 10 8 cellen. De magnetische korrels worden opgelost in water, dextran beklede en ongeveer 5,000x kleiner in vergelijking met andere commercieel verkrijgbare parels. Voor meer informatie, zie instructies van de fabrikant. <ol><li> Meng het bloed (met of zonder anticoagulantia) 1: 1 met Ca 2+ Mg 2 + -vrij PBS. </li><li> Voeg 15 ml dichtheidsgradiënt oplossing per 50 ml buis. Voor meer informatie, zie instructies van de fabrikant. </li><li> Langzaam laag het verdunde bloed bovenop de dichtheidsgradiënt oplossing. </li><li> Centrifuge monsters bij 2500 g gedurende 30 min met langzame acceleratie en zonder remmen. </li><li> Zorgvuldig verzamelen bufferlaag van elke buis (figuur 1) met een steriele pipet van kunststof en het in een andere buis.Vermijd collectie van de dichtheidsgradiënt oplossing. De verwachte PBMC opbrengst bedraagt ongeveer 3-4 x 10 6 cellen / ml bloed. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig1.jpg" /> Figuur 1: dichtheidsgradiëntcentrifugatie van Coat op Ficoll Solution Bbuffy. Getoond wordt het resultaat van de dichtheidsgradiënt centrifugatie bij 2500 xg gedurende 30 min op de dichtheidsgradiënt oplossing. Afgebeeld zijn erytrocyten en granulocyten (rood), de fractie mononucleaire cel (witte laag), plasma (geel), en de dichtheid gradiënt-oplossing (wittig). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="6"><li> Verdun het perifere bloed mononucleaire celfractie met ten minste 3 volumina PBS en meng. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min bij 200 x g. </li><li> Herhaal stap 2.6 twee keer. &lt;/ Li&gt; <li> Zuig het supernatant en resuspendeer celpellet in 5 ml MV2 medium. </li><li> Voeg 100 ul van humaan CD34 antilichaam (voldoende voor verwerking tot 5 x 10 8 cellen) per gebruikte bufferlaag en roteer gedurende 15 minuten bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Voeg 50 ul van dextran-beklede magnetische korrels per gebruikte bufferlaag en roteer gedurende 10 minuten bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Na incubatie de suspensie in FACS buisjes met een maximum van 3 ml per buis. Hogere bedragen zal niet toegestaan ​​met de magneet. </li><li> Plaats FACS buis (s) in de magneet (s) en wacht 5 min. </li><li> Gooi supernatant zonder uit de magneet trekt de FACS buizen. </li><li> Resuspendeer de cellen in elk FACS buis met 3 ml MV2 medium buiten de magneet. </li><li> Herhaal stap 2,12-2,14 tweemaal. </li><li> Trek de FACS buizen uit de magneten en resuspendeer de cellen in 3 ml MV2 medium. </li><li> Breng de celsuspensie in pre-gecoate T75 flasks en voeg 17 ml MV2 medium per fles. OPMERKING: Het medium moet worden veranderd na 3 dagen. Na een week, cellen vertonen spindel-achtige structuren (figuur 2) en zijn klaar voor gebruik. Voor een over het hoofd van de isolatie zie figuur 3. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig2.jpg" /> Figuur 2: Microscopisch Beeld van Geïsoleerde EPC&#39;s. Getoond wordt een representatief beeld van de geïsoleerde vroeg EPC&#39;s in een T75 kolf voorafgaand aan de onthechting. Schijnbaar is de spil-achtige structuur van het EPC. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig3.jpg" /> Figuur 3: Stroomschema Het tonen van de EPC Isolation Procedure. Afgebeeld is een regeling, tonening de afzonderlijke stappen van de EPC-isolatie protocol. Voor een meer gedetailleerd protocol zie punt 2 in de sectie protocol. 3. Migratie Assay <ol><li> Verwijder het medium uit EBV in de T75 kolf. </li><li> Was met 5 ml PBS door het voorzichtig schudden. </li><li> Verwijder PBS en voeg 5 ml commerciële cel onthechting oplossing. Wacht tot de cellen zijn vrijstaand (check onder een microscoop). Versnel het losmaken door voorzichtig de bodem van de fles te tikken. </li><li> Wanneer de cellen losgemaakt, snel voeg 5 ml MV2 compleet medium en breng de celsuspensie in een andere buis. </li><li> Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer cellen in 5-10 ml PBS en centrifugeer opnieuw bij 2000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Herhaal stap 3.6. </li><li> Resuspendeer de cel pellet in MV2 uitgehongerd medium (50.000 cellen in 75 ul per transmigratie ook nodig zijn). OPMERKING: Welke migratie systeem nodig is afhankelijk van het type cel en assay. Er zijn diff<html> Erent poriediameters en plaat maten (aantal putten). Voor EPC een poriegrootte van 5 urn 96 bronsysteem optimaal. </li><li> Bereid de migratie plaat door toevoeging van 235 pi van de serum monster (serum verdund 1: 5 in MV2 uitgehongerd medium) in de onderste kamer (figuur 4). </li></ol><img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig4.jpg" /> Figuur 4: Migratie Assay in een gewijzigde Boyden Kamer. Getoond wordt het algemene ontwerp van een gemodificeerde Boyden-kamer. De celkweek inserts (= bovenste kamer) zijn aangegeven in donkerblauw en in de onderste kamer zijn geplaatst. De onderste (maar niet de wanden) inleggen vertegenwoordigt het filtersysteem met inbegrip van de poriën. (A) Geeft de setup op tijdstip nul. (B) Na een gekozen tijdstip, worden cellen gemigreerd door het filter naar een stimulus.fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <ol start="10"><li> Voeg het inzetstuk kort voor het toevoegen van de celoplossing. </li><li> Voeg 75 ul van de cel-oplossing (= 50.000 cellen) in de bovenste kamer. </li><li> Laat de EPC migreren gedurende 3 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 (migratie is afhankelijk van celtype en systeem). <ol><li> Serum auto-fluorescentie artefacten te voorkomen, te kwantificeren gemigreerd cellen door het nemen van foto&#39;s van de put onder een microscoop en tel de cellen met behulp van de semi-automatische software &quot;ImageJ&quot;. </li></ol></li><li> Verwijder de bovenste kamer (dat alle niet-gemigreerde cellen). </li><li> Voeg 70 ul 3,6% paraformaldehyde oplossing, met inbegrip van Hoechst kleurstof (verdund 1: 1000). De plaat kan worden opgeslagen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende de nacht. </li><li> Centrifugeer de plaat kort om alle cellen in dezelfde focal plane krijgen bij 2.000 xg gedurende 1-2 min. </li><li> Take 5 beelden per well (Figuren 5 en 6) met een 100x vergroting. </li></ol><img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig5.jpg" /> Figuur 5: Regeling die de positie van de genomen foto&#39;s. Het schema geeft de plaats van de vijf gemaakte beelden, die nodig zijn voor het bepalen van gemigreerde cellen ten opzichte van de put. De foto&#39;s zijn genomen om de cellen te tellen en het berekenen van een gemiddelde waarde voor elke goed. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig6.jpg" /> Figuur 6: Microscopische Image for Cell kwantificering. Getoond wordt een representatief beeld, dat is gemaakt voor mobiele kwantificering. De cellen werden gekleurd en gefixeerd USIng Hoechst kleurstof in 3,6% paraformaldehyde. De stippen stellen gefixeerd en endotheliale progenitorcellen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="17"><li> Tellen de gemigreerde cellen met behulp van de semi-automatische software &quot;ImageJ&quot; door het National Institute of Health. </li></ol>

<ol><li>Emontzpohl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+MIF+in+the+migration+of+endothelial+progenitor+cells+in+patients+during+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery.</a> Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).</li>
<li>Smadja, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+8+is+differently+expressed+and+modulated+by+PAR-1+activation+in+early+and+late+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells.</a> J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).</li>
<li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275 (5302), 964-967 (1997).</li>
<li>Simons, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+endothelial+secretion+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+and+role+in+endothelial+progenitor+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment.</a> J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).</li>
<li>Dernbach, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidative+stress-associated+genes+in+circulating+progenitor+cells%3A+evidence+for+enhanced+resistance+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress.</a> Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+factors+secreted+by+endothelial+progenitor+cells+prevent+oxidative+stress-induced+apoptosis+of+mature+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells.</a> Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).</li>
<li>Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Circulating+endothelial+progenitor+cells+for+vascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine.</a> Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).</li>
<li>Schmidt-Lucke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+number+of+circulating+endothelial+progenitor+cells+predicts+future+cardiovascular+events%3A+proof+of+concept+for+the+clinical+importance+of+endogenous+vascular+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair.</a> Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Human endothelial progenitor cells.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692(2012).</li>
<li>Ito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+as+putative+targets+for+angiostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin.</a> Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).</li>
<li>Hill, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+progenitor+cells%2C+vascular+function%2C+and+cardiovascular+risk%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk.</a> N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).</li>
<li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li>
<li>Rohde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes+mimic+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).</li>
<li>Rohde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+mimic+the+morphology+of+endothelial+progenitor+colonies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro.</a> Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).</li>
<li>Prokopi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+reveals+presence+of+platelet+microparticles+in+endothelial+progenitor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures.</a> Blood. 114 (3), 723-732 (2009).</li>
<li>Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+endothelial+cells+based+on+their+increased+uptake+of+acetylated-low+density+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein.</a> J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).</li>
<li>Koch, S., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+by+vascular+endothelial+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502(2012).</li>
<li>Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+identity%2C+phenotype%2C+and+fate+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).</li>
<li>Hur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+two+types+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+different+contributions+to+neovasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).</li>
<li>Tagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Early+and+Late+Endothelial+Progenitor+Cells+in+Peripheral+Circulation+and+Their+Clinical++Association+with+Coronary+Artery+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Vasc+Med%22%5BJournal%5D)">Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease.</a> Int J Vasc Med. , 2015(2015).</li>
<li>Bernhagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).</li>
<li>Stoppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+MIF+Family+Proteins+in+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion+Damage+and+Their+Influence+on+Clinical+Outcome+of+Cardiac+Surgery+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).</li>
<li>Kanzler, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+angiogenic+chemokines+in+endothelial+progenitor+cell-induced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis.</a> Basic Res Cardiol. 108 (1), 310(2013).</li>
<li>Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+chemokine+receptor+expression+regulates+functional+specialization+of+endothelial+progenitor+cell+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations.</a> Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).</li>
<li>Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+in+myocardial+ischaemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).</li>
<li>Stoppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+postoperative+blood+levels+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+are+associated+with+less+organ+dysfunction+in+patients+after+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery.</a> Mol Med. 18, 843-850 (2012).</li>
<li>Amin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+inhibitory+factor+mediates+angiogenesis+via+mitogen-activated+protein+kinase+and+phosphatidylinositol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase.</a> Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).</li>
<li>Kupatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+endothelial+progenitor+cells+expressing+a+broad+range+of+proangiogenic+and+remodeling+factors+enhance+vascularization+and+tissue+recovery+in+acute+and+chronic+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia.</a> FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).</li>
<li>Colotta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+monocyte+chemotactic+cytokine+by+human+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes.</a> J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).</li>
<li>Casale, T. B., Kaliner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+isolation+of+human+mononuclear+cells+free+of+significant+platelet+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination.</a> J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).</li>
<li>Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12745450">CD34 expression on platelets.</a> Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).</li>
<li>Stellos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+stromal+cell-derived+factor-1+regulates+adhesion+and+promotes+differentiation+of+human+CD34%2B+cells+to+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells.</a> Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).</li>
<li>Thornton, M. A., Poncz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+megakaryocytes+from+peripheral+blood+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors.</a> Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).</li>
<li>Ivetic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Producing+megakaryocytes+from+a+human+peripheral+blood+source%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source.</a> Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).</li>
<li>Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34-%2FCD133%2B%2FVEGFR-2%2B+endothelial+progenitor+cell+subpopulation+with+potent+vasoregenerative+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities.</a> Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).</li>
<li>Wijelath, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+vascular+endothelial+growth+factor+binding+domains+of+fibronectin+enhance+vascular+endothelial+growth+factor+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity.</a> Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li>
<li>Yao, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+antioxidative+beta-blocker+celiprolol+on+endothelial+progenitor+cells+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats.</a> Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-+and+cytokine-induced+mobilization+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+for+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization.</a> Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).</li>
<li>Kawamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+ex+vivo+expanded+endothelial+progenitor+cells+for+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia.</a> Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).</li>
<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Ischemia+Induces+SDF-1alpha+Release+in+Cardiac+Surgery+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients.</a> J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).</li>
<li>Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11744011">The inflammatory response in myocardial infarction.</a> Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).</li>
<li>Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease.</a> Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).</li>
<li>White, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+action+of+MIF+in+acute+myocardial+infarction+via+activation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76206(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het eerste deel van deze studie omvatte de isolatie van humane EPC&#39;s uit het perifere bloed van gezonde vrijwilligers om een ​​grondige evaluatie van het bloed van cardiochirurgische patiënten mogelijk te maken. Daarom werd een dichtheidsgradiënt centrifugatie uitgevoerd om de PBMC fractie uit plasma, granulocyten en erytrocyten te scheiden. De meeste verontreinigende bloedplaatjes te verwijderen, was dit celfractie onderworpen aan korte en langzame wasstappen 29, <sup class="xref"...

<html> Endotheliale progenitor cellen (EPC) circuleren in het menselijk bloed en hebben het vermogen om te differentiëren in endotheliale cellen 2. Zij deelnemen aan vasculogenese en kunnen minimaliseren van de schade veroorzaakt door ontsteking en ischemie / reperfusie (I / R) letsel op verschillende wijzen 3, 4. Bijvoorbeeld EBV tonen verhoogde intracellulaire antioxidant enzymen zoals catalase, glutathion peroxidase of mangaan superoxide dismutase (MnSOD) 5. De verhoogde weerstand tegen oxidatieve stress laat EPC functioneren in micro-omgevingen met verhoogde reactive oxygen species (ROS) na ischemisch letsel 6. Eerdere studies gaven ook aan dat het aantal EBV kan worden gecorreleerd aan vasculaire hersteld en dat een verminderd aantal circulerende EPC voorspelt het optreden van cardiovasculaire gebeurtenissen 7,class = &quot;xref&quot;&gt; 8. Echter, een duidelijke definitie van een EPC is nog niet gevonden. Tot nu toe is er geen specifieke celoppervlak merker of consistente fenotype voor EBV en deze cellen zijn zeer zeldzaam in het perifere bloed 9. Een menselijke EPC moet worden beschouwd als een circulerende cel met het vermogen bij te dragen tot de reconstructie van de gewonden endotheel en nieuwe vasculaire structuren. Een manier om het isoleren en karakteriseren van EPC&#39;s is door middel van hechting aan fibronectine. Daardoor wordt de capaciteit van deze cellen gebruikt om een superieure hechting zien aan beklede schalen in vergelijking met type 1 collageen, bijvoorbeeld 3, 10, 11 fibronectine. Maar anderen vonden dat plating mononucleaire cellen op met fibronectine beklede schalen zonder enige verdere zuivering of stap leidt tot kolonies waaronder myeloïde progenitorcellen, monocyten en T-lymfocyten 12, 13, 14. Bovendien is in dit geval bloedplaatjes kan verontreinigen mononucleaire cellen (MNC) fractie en daardoor plasmamembraaneiwitten aan enige hechtende cellen 15. Naast karakterisatie door middel van in vitro hechting assays, is een combinatie van verschillende celoppervlak markers gebruikt om een celtype beschouwd als EPC beschrijven. In dit geval, na fibronectine-gemedieerde adhesie worden de cellen geanalyseerd met betrekking tot hun endotheel-achtige kenmerken. Hierbij twee endotheliale cel-geassocieerde markers, geacetyleerd-low density lipoproteïne (AcLDL) en vasculaire endotheliale groeifactor receptor 2 (VEGFR-2, KDR), een rol spelen. Endotheelcellen en macrofagen is aangetoond dat specifiek nemen AcLDL een proces genaamd &quot;scavenger cel pathway&quot; 16. Andere merkereiwit KDR als belangrijkste VEGF receptor op endotheliale17 cellen. Zoals EPC in het algemeen gekweekt in media waaraan endotheliale groeifactoren en foetaal kalfserum, is het mogelijk dat macrofagen, wat kan ook zijn ongeluk geïsoleerd, vertonen een endotheel-achtige merkerprofiel. Zoals eerder getoond, indien gekweekt in een endotheliaal geconditioneerd medium, macrofagen express &quot;endotheel-specifieke&quot; 18 eiwitten. In het algemeen zijn er twee categorieën van EBV in meer subtypen, die kan worden gevonden in het bloed of in vitro worden gekweekt. Late-uitgroei EPC&#39;s (late-EPC&#39;s) verschijnen na 2-3 weken van de cultuur. Deze cellen sneller geïntegreerd in een monolaag van humane navelstrengader endotheelcellen en kunnen capillaire buizen 19 vormen. Daarnaast zogenaamde &quot;early-EBV&quot; circuleren in het bloed gedurende een week en handelen passieve doorgang leveren angiogene moleculen, zoals vasculaire endotheelgroeifactorfactor (VEGF), of CXCL8 19. Patiënten met coronaire hartziekte (CAD) vertoonden significant lagere hoeveelheden vroegtijdige EBV vergeleken met een controlegroep zonder CAD 20. Interessant dezelfde groep vertoonden hogere hoeveelheden late-EBV vergeleken met een controlegroep. Een andere studie toonde aan dat vroege EPC&#39;s te beschermen gedifferentieerde EPC&#39;s van apoptose onder oxidatieve omstandigheden in een paracriene wijze 6. Daarom zou vroege EPC relevante beschermende effecten door de migratie van andere cellen in een auto- of paracriene manier binnen het perifere bloed te voorzien. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor vroegtijdige EPC zuiveren door eerst het isoleren van de PBMC-fractie uit menselijk perifeer bloed en vervolgens het isoleren van CD34 + cellen uit de PBMC-fractie deze celsuspensie tegen ongewenste cellen te verwijderen. CD34 is een marker, die wordt gebruikt voor de isolatie van humane hematopoietische stamcellen 9 </sup&gt;. Daarna CD34 + cellen gekweekt op met fibronectine gecoate weefselkweek oppervlakken. Na drie dagen wordt het medium vervangen, waarbij alle niet-hechtende cellen te verliezen. Tenslotte worden geïsoleerd EBV gekleurd om de opname van AcLDL en de aanwezigheid van KDR als endotheelcel-merker door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te controleren. Als extra marker, analyseerden we bloedplaatjes endotheel adhesiemolecuul (PECAM-1, CD31), die ook voorkomt op endotheliale cellen. Herstel van beschadigde of geïnfarceerde hartspierweefsel door verbeterde werving van EPC&#39;s behoort tot de intensief onderzocht behandelingsstrategieën in hart- en vaatziekten. De vertaling van experimentele resultaten in de klinische praktijk is nog uitdagend, gezien de complexe cellulaire interactie in het menselijk lichaam in verschillende pathofysiologische omstandigheden. Verder myocardiale I / R letsel veroorzaken een overmatige afscheiding van verschillende cytokinen, hormonen en groei fac<html> tors, die de homing van EPC&#39;s controleren om gebieden van bloedvatvorming 13. Zoals reeds aangetoond, CXCL8, stromale cel-afgeleide factor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF en macrofaag migratie-remmende factor (MIF) zijn aanzienlijk toegenomen in serummonsters na myocard I / R schade 1. Tot deze factoren behoren, MIF is een pleiotrope chemokine-achtige cytokine met overwegend pro-inflammatoire eigenschappen. In tegenstelling tot de historische naam MIF heeft pro-migrerende functioneert, als een echte chemokine bij verschillende celtypen 1, 21, 22. MIF-gemedieerde wervingsprocessen zijn gekoppeld aan de chemokine-receptoren CXCR4 en CXCR2, die MIF bindt aan en activeert een niet-verwante wijze 21. Van de nota, EPC&#39;s uitdrukken beide van deze receptoren op hun oppervlak, die bovendien up-gereguleerd worden onder hypoxische conditiesass = &quot;xref&quot;&gt; 23, 24. Bovendien accumuleren aanwijzingen dat MIF een totale cardio-beschermend effect tijdens I / R schade van het hart 22, 25, 26. In deze context, is verder gebleken dat MIF de vorming van nieuwe bloedvaten tijdens hypoxische stress die is van bijzonder belang, wanneer gezien de beperkte herstel mechanismen van de benadeelde myocard 27 kan ondersteunen. Vorige in vitro studies en experimenten in pre-klinische muismodellen verstrekt eerste bewijs over de rol van MIF in EPC recruitment 4. Van de nota, MIF is ook een prominent cargo eiwit van EPC&#39;s die tijdens de EPC werving binnen ischemische plaatsen 28 kan worden vrijgegeven. Studies in klinische settings name in vergelijking met andere (angiogene) serum cytokines blijft ongrijpbaar.

<table><tbody><tr><td>Fibronectin</td><td>Biochrom AG</td><td>L7117</td><td>Coating van T-75 kolven</td></tr><tr><td>Aqua ad iniectabilia</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endotheelcel groeimedium MV2</td><td>Promo Cell</td><td>C-22221</td><td></td></tr><tr><td>Endotheelcel groeimedium MV2 SupplementMix</td><td>Promo Cell</td><td>C-39226</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Dichtheidscentrifugatie</td></tr><tr><td>EasySep human CD34 positieve Selectie Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18056</td><td>Isolatie van CD34+ cellen</td></tr><tr><td>EasySep magneet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td>Detachering van cellen</td></tr><tr><td>Corning HTS transwell 96 well permeabele ondersteuningen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3387-8EA</td><td>Migratie systeem</td></tr><tr><td>Hoechst oplossing</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td>Kleuren van gemigreerde cellen</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>xxx</td><td>Tellen van gemigreerde cellen</td></tr></tbody></table>

isolatie van endotheliale cellen van gezonde vrijwilligers en hun trekkende potential beïnvloed door serum monsters na hartchirurgie

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endotheliale voorlopercellen (EPC&#39;s) worden gerekruteerd uit het beenmerg onder pathologische omstandigheden, zoals hypoxie en zijn cruciaal betrokken zijn bij de vorming van nieuwe bloedvaten van ischemische weefsels. De oorsprong, classificatie en karakterisering van EPC&#39;s zijn complex; Desondanks hebben twee prominente subtypes van EPC&#39;s vastgesteld: de zogenaamde &quot;early&quot; EPC&#39;s (later aangeduid als vroeg-EPC&#39;s) en late-uitgroei EPC&#39;s (late-EPC&#39;s). Ze kunnen worden ingedeeld biologische eigenschappen en hun verschijning in in vitro kweek. Terwijl &quot;vroege&quot; EPC&#39;s verschijnen in minder dan een week na het kweken van perifere bloed afgeleide mononucleaire cellen in EC-specifieke media, kan late-uitgroei EPC&#39;s worden na 2-3 weken. Late-uitgroei EPC&#39;s zijn erkend als rechtstreeks betrokken zijn bij neovascularisatie, voornamelijk door hun vermogen om te differentiëren in mature endotheelcellen, terwijl &quot;vroege&quot; EPC&#39;s te uiten verschillende angiogene factoren als endogenelende lading angiogenese te bevorderen in een paracriene manier. Tijdens myocardiale ischemie / reperfusie (I / R), verschillende factoren beheersen de homing van EPC regio&#39;s van bloedvatvorming. Macrofaag migratie-remmende factor (MIF) is een chemokine-achtige pro-inflammatoire en alomtegenwoordig uitgedrukt cytokine en werd onlangs beschreven als de belangrijkste regulator van de EPC&#39;s migratie functioneren bij fysiologische concentraties 1. Interessant MIF opgeslagen in intracellulaire pools en kan snel worden vrijgegeven in de bloedstroom na enkele stimuli (bijvoorbeeld myocardinfarct). Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de betrouwbare isolatie en kweek van vroege EPC van volwassen menselijk perifeer bloed gebaseerd op CD34-positieve selectie met daaropvolgende kweek in medium dat endotheliale groeifactoren op met fibronectine beklede platen voor toepassing bij in vitro migratie assays tegen serummonsters van cardiale chirurgische patiënten. Bovendien is detrekkende invloed van MIF op chemotaxis van EBV in vergelijking met andere bekende angiogenese-stimulerende cytokinen wordt aangetoond.

Karakterisering van geïsoleerde endotheliale voorlopercellen Ten eerste, de opname van AcLDL werd gecontroleerd, evenals de expressie van KDR en CD31 op het oppervlak van de geïsoleerde celpopulatie. Zoals figuur 7a toont, 85,1% van de geïsoleerde EPC&#39;s toonde een opname van AcLDL en uitgedrukt CD31. Figuren 7b en 7c tonen verder een homogene verdeling van beide markers, alho...

Endotheliale voorlopercellen (EPC&#39;s) zijn cruciaal betrokken zijn bij de vorming van nieuwe bloedvaten van ischemische weefsels. Deze werkwijze beschrijft de isolatie van humane EPC uit perifeer bloed, maar ook de identificatie van het trekkende bieden tegen sera van patiënten die hartchirurgie ondergaan.

Isolatie van endotheliale cellen van gezonde vrijwilligers en hun trekkende Potential Beïnvloed door Serum monsters na Hartchirurgie

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Het algemene doel van deze celisolatieprocedure en migratieprotocollen is om een betrouwbare methode te tonen voor het isoleren van endotheelprogenitoren en hun migratiepotentieel naar serummonsters van cardiaal chirurgische patiënten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de regeneratie van de endotheelbekleding en bloedvaten, wat noodzakelijk is na hartchirurgie als gevolg van letsel gerelateerd aan ischemie en reperfusie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de relatief eenvoudige manier van het isoleren van progenitorcellen, inclusief de pre-isolatie van CD-34 positieve cellen.Naast sterfgevallen blijven ernstige complicaties na hartchirurgie te frequent voorkomen. Dit onderstreept de noodzaak om de risico- en beschermingsmechanismen tijdens hartchirurgie te identificeren. Endotheliale progenitorcellen zijn cruciaal betrokken bij de neovascularisatie van ischemisch weefsel en staan erom bekend cardioprotectieve eigenschappen te bieden.Om het experiment te starten, mengt u bloed in een verhouding van één-op-één met calcium- en magnesiumvrije PBS. Voeg 15 milliliters dichtheidsgradiëntoplossing toe aan een buis van 50 milliliter. Breng het verdunde bloed vervolgens langzaam aan als een laag bovenop de dichtheidsgradiëntoplossing.Centrifuge vervolgens de monsters. Verzamel met een steriele plastic pipet voorzichtig de buffy coat-laag van elke buis en breng deze over naar een andere buis, terwijl u de dichtheidsgradiëntoplossing vermijdt. Verdun de fractie perifere bloedmononucleaire cellen, of PBMC-fractie, met ten minste drie volumes PBS en meng de oplossing door te pipetteren.Centrifugeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten bij 200 ×g. Aspireer vervolgens het supernatant en resuspendeer de celpellet in vijf milliliter endotheelcelgroeimedium, MV-2. Voeg na het resuspenderen van de cellen 100 µL menselijk CD-34 antilichaam toe per gebruikte buffy coat en roteer de cellen. Voeg 50 µL dextraan-gecoate magnetische kralen toe per gebruikte buffy coat en roteer de cellen.Breng na incubatie de suspensie over naar fax-buisjes, met maximaal drie milliliter per buisje. Plaats vervolgens de fax-buisjes in de magneten en wacht vijf minuten. Verwijder het supernatant zonder de fax-buisjes uit de magneet te halen.Resuspendeer vervolgens, buiten de magneten, de cellen in elke fax-buis met drie milliliters MV-2 medium. Breng de celsuspensie over in vooraf gecoate T-75 flasks. Voeg 17 milliliters MV-2 medium toe aan elke flask.Om de migratie-assay voor te bereiden, gebruikt u een pipet om het medium van de endotheliale progenitorcellen of de EPC's in de T-75 fles te verwijderen. Was de cellen met vijf milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS en schud de fles voorzichtig. Verwijder vervolgens de PBS en voeg vijf milliliter commerciële celdetachementoplossing toe.Wacht vervolgens tot de cellen onder een lichtmicroscoop zijn losgekomen. Versnel het loslaten door voorzichtig tegen de bodem van de kolf te tikken. Wanneer de cellen zijn losgekomen, voeg dan snel vijf milliliters MV-2 compleet medium toe en breng de celsuspensie over naar een andere buis.Centrifugeer de cellen 5 minuten bij 2.000 x G. Nadat de cellen zijn gepelletteerd, worden ze opnieuw gesuspendeerd in vijf tot tien milliliter PBS. Centrifugeer ze vervolgens opnieuw.Resuspendeer de cellen opnieuw in vijf tot tien milliliter PBS en centrifugeer deze vervolgens. Resuspendeer de celpellet in serumvrij MV-2 medium. Verdun vervolgens het serummonster één op vijf in serumvrij MV-2 medium.Bereid de migratieplaat voor door 235 µL van het serummonster in de onderste kamer toe te voegen. Plaats de insert kort voordat de celoplossing wordt toegevoegd. Voeg vervolgens 75 µL van de celoplossing toe aan de bovenste kamer.Laat de EPC's migreren. Verwijder de bovenkamer die alle niet-gemigreerde cellen bevat. Voeg 75 µL van een 3,6% paraformaldehyde-oplossing toe, inclusief hoechst-kleurstof verdund in een verhouding van 1:1.000.Centrifugeer de plaat kort bij 2 000 x G gedurende één tot twee minuten om alle cellen in hetzelfde brandvlak te krijgen. Om artefacten door serum-autofluorescentie te vermijden, worden de gemigreerde cellen gekwantificeerd door vijf foto's per putje te maken met een 100x vergroting onder een microscoop. Tel tot slot de gemigreerde cellen met behulp van de semi-geautomatiseerde software.Fax-analyse van de EPC's bevestigt de opname van acLDL, evenals de expressie van CD-31 op het oppervlak van de geïsoleerde celpopulatie. De analyse van acLDL en CD-31 afzonderlijk onthult een homogene distributie van elke marker. Analyseer de invloed van hartchirurgie na myocardiale reperfusieschade op de circulerende serumconcentraties van MIF, CXCL12, CXCL8 en VEGF.Serummonsters werden preoperatief en intraoperatief afgenomen. De serumspiegels van MIF, CXCL12 en CXCL8 vertoonden een significante intraoperatieve stijging ten opzichte van de basiswaarden. In contrast hiermee vertoonden VEGF-concentraties geen significante veranderingen.Een ex vivo migratie-assay, waarbij serummonsters werden gebruikt die vóór en tijdens de operatie waren afgenomen, werd uitgevoerd met EPC's geïsoleerd van gezonde vrijwilligers en toonde een significant verhoogde migratiesnelheid naar de intraoperatief afgenomen monsters aan. Met deze techniek kunnen daarna eenvoudig perifere mononucleaire bloedcellen worden geïsoleerd om aanvullende vragen over inflammatie te beantwoorden.

isolation-endothelial-progenitor-cells-from-healthy-volunteers-their

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Endotheliale kolonievormende progenitor cellen (ECFCs) zijn een veelbelovend instrument om vasculaire homeostase en reparatie te bestuderen.

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

We beschrijven een methode om onder hechtende cellen aan laminaire stroming shear stress in een steriele continue stroom circuit. De cellen 'hechting, kan morfologie worden bestudeerd door de transparante kamer, monsters verkregen van het circuit voor de metaboliet-analyse en-cellen geoogst na afschuiving blootstelling voor toekomstige experimenten of cultuur.

Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning

Endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) in omloop zijn endotheelcellen met robuuste klonale proliferatie potentieel dat intrinsieke weer te...

Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed

Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 + CD34 - pericyten en CD34 + CD146 - adventitia-cellen van de menselijke hartspier.

Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Dit protocol beschrijft een endothelial differentiatie techniek voor cardiale voorlopercellen. Het richt zich vooral op de invloed van serumconcentratie en cel-zaaien dichtheid op de endotheliale differentiatie mogelijkheden.

Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden

Ontwikkeling van grote bijwerkingen cardiovasculaire voorvallen, die van invloed zijn cardiovasculaire prognose na coronaire angioplastie, worden beïnvloed door de omvang van coronaire schade en vasculaire reparatie. Het gebruik van nieuwe coronaire cellulaire en oplosbare biomarkers, reactief op vasculaire schade en reparatie, zijn nuttig om de ontwikkeling van MacEs en prognose te voorspellen.

Coronaire voorlopercellen en oplosbare biomarkers in cardiovasculaire prognose na coronaire angioplastie

Amputatie van de onderste ledematen kan zelfs optreden na angioplastiek van geblokkeerde vaten in Critical Limb Ischemia (CLI). Mononucleaire progenitorcellen (MPC's) weerspiegelen vasculair herstel. Het huidige protocol beschrijft de kwantificering van MPC's uit de circulatie dicht bij angioplastiek, en de relatie met endotheeldisfunctie en voorspelling van amputatie van de onderste ledematen.

Amputatie voorspellen met behulp van lokale circulerende mononucleaire voorlopercellen bij met Angioplastie behandelde patiënten met kritieke ledemaatischemie

De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door...

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Leer een betrouwbare methode om endotheliale progenitorcellen uit perifeer bloed te isoleren en hun migratie naar serum van hartchirurgiepatiënten te evalueren. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar neovascularisatie na ischemische letsels.

Isolatie van endotheliale cellen van gezonde vrijwilligers en hun trekkende Potential Beïnvloed door Serum monsters na Hartchirurgie (Video) | JoVE Journal

Isolatie van endotheliale cellen van gezonde vrijwilligers en hun trekkende Potential Beïnvloed door Serum monsters na Hartchirurgie

Meer video's verkennen