Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

Het algemene doel van deze methode is om de differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen te richten op het primitieve of definitieve hematopoëtische programma met behulp van een fase-specifieke signaalmanipulatiebenadering. Deze methode kan vele belangrijke vragen in het veld beantwoorden, zoals het begrijpen van de signaal- en transcriptieregulators van menselijke definitieve hematopoëse. Het grote voordeel van deze techniek is dat het fase-specifieke manipulatie onmiddellijk gebruikt.

Demonstratie van deze procedure is Carissa Dege, een post-doc in mijn laboratorium. Om het protocol te beginnen, verkrijg eerder bereide menselijke pluripotente stamcellijnen of HPSC's gekweekt op muizen embryonale fibroblasten of MEF's tot 70% tot 80% confluency in een 37-graad Celsius incubator met vijf procent CO2. Aspireer het HPSC-medium en voeg één milliliter 37-graad Celsius 0,25% Trypsin EDTA toe aan elke put gedurende één minuut.

Na één minuut, aspireer de Trypsin en voeg één milliliter stockmedium toe aan elke put. Gebruik een celschraper om de cellen van de plaat te schrappen. Voeg vervolgens één milliliter wasbuffer toe aan elke put.

Met een twee-milliliter serologische pipet, tritureer de cellen drie tot vijf keer om grote klonten te breken. En breng de cellen over naar een 50-milliliter conische buis. Centrifugeer de HPSC's gedurende vijf minuten bij 330 x G.

Na het centrifugeren, voeg HPSC-medium toe en schud de cellen opnieuw op. Voeg vervolgens twee milliliter van de opnieuw opgehangen HPSC's toe aan elke put van de MAT-gecodeerde plastic en incubeer de cellen een nacht lang. Na 24 uur, aspireer het medium en vervang het met 37-graad Celsius 0,05% Trypsin EDTA gedurende één minuut.

Aspireer de Trypsin EDTA. Voeg één milliliter stockmedium toe en schraap de cellen krachtig met een celschraper. Voeg vervolgens één milliliter wasmedium toe.

Met een twee-milliliter serologische pipet, tritureer de cellen drie keer en breng ze over naar een 50-milliliter conische buis. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 220 x G. Aspireer vervolgens het medium, voeg 20 milliliter wasmedium toe en gebruik een vijf-milliliter serologische pipet om de cellen voorzichtig opnieuw op te schudden.

Na centrifugatie en aspiratie, schud de Embryoïde Lichamen of EB's voorzichtig opnieuw op in Day Zero-medium. Verdeel twee milliliter differentiatiemedium met EB's in elke put van een zes-puts lage-adherentie celkweekschotel met behulp van een tien-milliliter serologische pipet. Plaats de EB's in een 37-graad Celsius vijf procent CO2, vijf procent O2 multigas incubator.

Vier en twintig uur later, voeg twee milliliter Day One-medium toe. Incubeer de cellen een nacht lang in een multigas incubator. Na 18 uur, oogst de EB's voorzichtig met een vijf-milliliter serologische pipet en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 100 x G.

Was en combineer de hele cultuur met tien milliliter Iscove's Gemodificeerd Dulbecco Medium of IMDM. Na het opnieuw centrifugeren van de cultuur gedurende vijf minuten bij 100 x G om puin te verwijderen, aspireer het medium. Schud de EB's voorzichtig opnieuw op met Day Two-medium met behulp van een P1000 pipet.

Breng vervolgens twee milliliter van de EB's per put in zes-puts lage-adherentie celkweekplaten. Voeg drie micromolar CHIR99021 of IWP2 toe om respectievelijk definitieve of primitieve hematopoëtische voorlopercellen te specificeren. Incubeer de plaat in een 37-graad Celsius multigas incubator gedurende 30 uur.

Na 30 uur, isoleer de EB's met een twee-milliliter serologische pipet door ze over te brengen naar een 50-milliliter conische buis en ze gedurende vijf minuten bij 330 x G te centrifugeren. Schud de EB's voorzichtig opnieuw op en was ze met 10 milliliter IMDM. Schud de EB's opnieuw op in Day Three-medium en verdeel twee milliliter in elke put van lage-adherentie zes-puts platen.

Incubeer de cellen gedurende 72 uur in een 37-graad Celsius multigas incubator. Na 72 uur incubatie, voeg twee milliliter Day Six-medium toe aan elke put. Incubeer vervolgens de EB's gedurende nog eens 48 uur in een 37-graad Celsius multigas incubator.

Isoleer de CHIR99021-behandelde EB's op dag acht van differentiatie en ga verder met de volgende sectie. Centrifugeer de EB's gedurende vijf minuten bij 330 x G. Aspireer het supernatant.

Voeg vervolgens twee milliliter 0,25% Trypsin EDTA toe aan de EB's. Vortex de EB's gedurende vijf seconden en incubeer de Ebs in een 37-graad Celsius waterbad gedurende acht minuten. Voeg vervolgens vijf milliliter stopoplossing toe en centrifugeer de EB's.

Aspireer vervolgens het supernatant. Schud de EB's opnieuw op in vijf milliliter Collagenase II. Vortex de buis gedurende vijf seconden en incubeer vervolgens de EB's in een 37-graad Celsius waterbad. Na 60 minuten, vortex de EB's gedurende vijf seconden en voeg vijf milliliter stopoplossing toe.

Na centrifugatie, aspireer het supernatant en schud de cellen opnieuw op in één milliliter FACS-buffer. Laat de cellen door een 40-micron celstrainer passeren om ongedissocieerde celklompjes te verwijderen. Ga verder met antilichaamlabeling en FACS-isolatie van CD34-positieve hemogene endotheelvoorlopercellen.

Na FACS-isolatie, schud de cellen opnieuw op in HE-medium. Verdeel de cellen in 50-microliter aliquoten in een 96-puts lage-adherentie kweekplaat en incubeer de cellen een nacht lang. De volgende ochtend moeten de hematopoëtische voorlopercellen zich bundelen tot groepjes van zes tot tien cellen.

Breng voorzichtig de 50-microliter volumes van de opnieuw geaggregeerd cellen over naar het midden van een 24-puts MAT-gecodeerde plaat. Plaats de plaat voorzichtig in de multigas incubator gedurende vier tot zes uur totdat de cellen gehecht zijn. Na vier tot zes uur, om de cellen de tijd te geven om te hechten, voeg langzaam één milliliter vers bereid HE-medium toe aan