Name: Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Leer hoe je menselijke pluripotente stamcellen differentieert naar primitieve of definitieve hematopoëtische progenitorcellen via stadiumspecifieke manipulatie van WNT-signalering. Deze methode biedt inzicht in transcriptieregulatoren van hematopoëse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Department of Internal Medicine, divisie van hematologie, Washington University School of Medicine. CD werd gesteund door T32HL007088 van het nationale hart-, Long- en bloed Instituut. CMS werd gesteund door een American Society of Hematology Scholar Award.

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+human+haematopoietic+development+from+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A view of human haematopoietic development from the Petri dish.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).</li>
<li>Chen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid%2Fmyeloid+progenitors+and+hematopoietic+stem+cells+originate+from+distinct+populations+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+definitive+erythroid+lineage+with+unique+regulation+of+the+beta-globin+locus+in+the+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo.</a> Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).</li>
<li>Palis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+emergence+of+high+proliferative+potential+hematopoietic+precursors+during+murine+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).</li>
<li>Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+erythroid+and+myeloid+progenitors+in+the+yolk+sac+and+embryo+proper+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse.</a> Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).</li>
<li>Boiers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphomyeloid+contribution+of+an+immune-restricted+progenitor+emerging+prior+to+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requirement+for+Notch1+distinguishes+2+phases+of+definitive+hematopoiesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development.</a> Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).</li>
<li>Kumano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+but+not+Notch2+is+essential+for+generating+hematopoietic+stem+cells+from+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells.</a> Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).</li>
<li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system%3A+advances+and+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li>
<li>Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBPjkappa-dependent+Notch+function+regulates+Gata2+and+is+essential+for+the+formation+of+intra-embryonic+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells.</a> Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).</li>
<li>Chadwick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+BMP-4+promote+hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Blood. 102 (3), 906-915 (2003).</li>
<li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+GFP+reporter+gene+to+the+MIXL1+locus+of+human+embryonic+stem+cells+identifies+human+primitive+streak-like+cells+and+enables+isolation+of+primitive+hematopoietic+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors.</a> Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).</li>
<li>Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).</li>
<li>Ledran, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+on+stromal+cells+derived+from+hematopoietic+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).</li>
<li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primitive+streak+gene+Mixl1+is+required+for+efficient+haematopoiesis+and+BMP4-induced+ventral+mesoderm+patterning+in+differentiating+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells.</a> Development. 132 (5), 873-884 (2005).</li>
<li>Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum-free+medium+reveals+distinct+roles+for+bone+morphogenetic+protein+4%2C+vascular+endothelial+growth+factor%2C+stem+cell+factor%2C+and+fibroblast+growth+factor+2+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis.</a> Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells%3A+efficient+production+in+the+coculture+with+OP9+stromal+cells+and+analysis+of+lymphohematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential.</a> Blood. 105 (2), 617-626 (2005).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukosialin+%28CD43%29+defines+hematopoietic+progenitors+in+human+embryonic+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.</a> Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+enhances+the+generation+of+hematopoietic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cell-derived+hemato-vascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors.</a> Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).</li>
<li>Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+progresses+through+sequential+hematoendothelial%2C+primitive%2C+and+definitive+stages+resembling+human+yolk+sac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development.</a> Blood. 106 (3), 860-870 (2005).</li>
<li>Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Signaling+Controls+the+Specification+of+Definitive+and+Primitive+Hematopoiesis+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).</li>
<li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Definitive+Haemogenic+Endothelium+and+Arterial+Vascular+Endothelium+Represent+Distinct+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages.</a> Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).</li>
<li>La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+development+from+human+cord+blood+hematopoietic+stem+cells+by+Delta-like+1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro.</a> Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).</li>
<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).</li>
<li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OP9-DL1+system%3A+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).</li>
<li>Polychronopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+synthesis+of+indirubins+as+potent+and+selective+inhibitors+of+glycogen+synthase+kinase-3+and+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases.</a> J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).</li>
<li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li>
<li>Peschle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic----Fetal+Hb+switch+in+humans%3A+studies+on+erythroid+bursts+generated+by+embryonic+progenitors+from+yolk+sac+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol wordt een snelle serumvrij, stroma-vrije methode voor de differentiatie van primitieve of definitieve hematopoietische progenitorcellen beschreven. Mesodermal specificatie van primitieve of definitieve hematopoietische progenitorcellen kan op betrouwbare wijze worden bereikt met behulp van onze protocol, dat een unieke klein molecuul remmers van het canonieke WNT signalering exploiteert. Fase-specifieke WNT activering door de GSK3β-remmer CHIR9902133 geeft aanleiding tot definitieve h...

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) worden gedefinieerd als zowel de menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), en hebben de unieke mogelijkheid om niet alleen zelf-vernieuwing onder passende groei voorwaarden, ondergaan maar ook het vermogen om te differentiëren tot alle celtypes afgeleid uit de drie lagen van de kiem: ectoderm, endoderm en mesoderm1. Als gevolg van deze unieke vermogens houden hPSCs grote belofte voor regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en cel-gebaseerde therapieën2. Terwijl meerdere celtypen hebben met succes zijn onderscheiden van hPSCs, is één grote uitdaging de in vitro -specificatie van uitsluitend volwassene-achtige hPSC afkomstige hematopoietische cellen van de stam (HSCs) en definitieve hematopoietische progenitorcellen.
Een waarschijnlijk hinderpaal voor de ontwikkeling van de menselijke HSCs van hPSCs is de aanwezigheid van meerdere hematopoietische programma's binnen de menselijke embryo's3. Het eerste programma dat naar voren komt, genoemd "primitieve Haematopoiese," afkomstig is binnen de extraembryonic dooierzak weefsel en beste wordt gekenmerkt door zijn vluchtige productie van erytroblast progenitoren (EryP-CFC), macrofagen en megakaryocytes. Met name dit programma doet geen aanleiding geven tot HSCs, noch geeft het aanleiding tot T en B lymfoïde progenitoren. De dooierzak geeft Transient echter aanleiding tot beperkte definitieve hematopoietische progenitorcellen, zoals de erytro-myeloïde voorlopercellen (EMP4,5,6,7,8) en de erythroid-deficiënte lymfoïde-primer multipotente voorlopercellen (LMPP9). Noch EMPs, noch LMPPs zijn echter volledig multipotente, of staat van HSC-achtige engraftment in volwassen ontvangers. Daarentegen verderop in de ontwikkeling, is het klassiek gedefinieerde "definitief" hematopoietische programma opgegeven in de regio van de aorta-gonaden-mesonephros van het embryo zelf, die aanleiding geven tot alle volwassen hematopoietische lineages, met inbegrip van de HSC. De specificatie van deze intra embryonale definitieve hematopoietische stamcellen treedt op in een inkeping-afhankelijke manier, via een endotheel-naar-hematopoietische overgang van hemogenic endotheel (HE)3,10,11 ,12,13,14. Afgezien van reconstitutie capaciteit, kunnen de multilineage potentiële en Notch-afhankelijkheid van deze cellen worden gebruikt om te onderscheiden deze definitieve hematopoietische progenitorcellen van de EMP en de LMPP (herzien in verwijzingen3,13 ).
Inzicht in het bestuur van primitieve en definitieve hematopoietische specificatie van hPSCs mechanism(s) is waarschijnlijk cruciaal voor de reproduceerbare productie van definitieve hematopoietische progenitorcellen in allerlei hPSC lijnen. Tot voor kort bestond hPSC differentiatie protocollen die multipotente primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen scheiden kon niet15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Vele benaderingen met foetale runderserum (FBS) en/of stromale co cultuur eerst geschetst het hematopoietische potentieel van hPSC differentiatie, met mengsels van primitieve en definitieve hematopoietische potentiële15,16, 17,19,22,23,25. Verder veel serumvrij hematopoietische protocollen hebben beschreven de signaal-eisen voor de specificatie van mesoderm uit hPSCs die havens hematopoietische potentiële18,20,21, 24. aangezien deze methoden nog steeds gaf aanleiding tot heterogene mengsels van beide programma's, hun gebruik in klinische toepassingen en begrijpen van ontwikkelingsstoornissen mechanismen kunnen echter beperkt.
We hebben onlangs gebouwd op deze studies, hebben geschetst van de fase-specifieke signaal eisen voor ACTIVIN/NODAL en WNT signalering in primitieve en definitieve hematopoietische specificatie van hPSC afkomstige mesoderm18,26 . De laatste was bijzonder uniek, omdat het gebruik van fase-specifieke WNT signaal manipulatie voor de specificatie van uitsluitend primitief of uitsluitend definitieve hematopoietische progenitorcellen26 zorgt. Tijdens mesoderm specificatie, de remming van het canonieke WNT signalering met de PORCN-remmer IWP2 resulteert in de specificatie van CD43+ EryP-CFC- en myeloïde voorlopercellen, met geen detecteerbare lymfoïde potentieel. In schril contrast, stimulatie van het canonieke WNT signalering met de GSK3β-remmer, CHIR99021, tijdens dezelfde ontwikkelingsfase differentiatie resulteerde in de totale afwezigheid van detecteerbare CD43+ EryP-CFC, terwijl het tegelijkertijd leiden tot de specificatie van de CD34+CD43− HE. Deze bevolking bezeten myeloïde, HBG-erythroid en T-lymfoïde potentieel. Latere analyses vastgesteld dat hij als ontbreekt de uitdrukking van CD7327,28 , CD18428, en haar hematopoietische mogelijke NOTCH-afhankelijke28was. Verdere, eencellige klonale analyses aangetoond dat deze definitieve hematopoietische lineages kon worden afgeleid uit enige Multipotente cellen28. Samen genomen, blijkt deze studies dat stadium-specifieke WNT signalering manipulatie pure primitieve hematopoietische progenitorcellen of multipotente NOTCH-afhankelijke definitieve hematopoietische progenitorcellen kunt opgeven.
We schetsen hier, onze strategie van de differentiatie, dat de opbrengst uitsluitend primitieve of definitieve hematopoietische progenitorcellen, via manipulatie van canonieke WNT signalering tijdens mesodermal patronen, en hun downstream hematopoietische afstamming testen. Dit protocol is van grote waarde voor onderzoekers die geïnteresseerd in de productie van primitieve of definitieve hematopoietische progenitorcellen van hPSCs voor regeneratieve geneeskunde toepassingen zijn.

<table><tbody><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD)</td><td>Corning</td><td>10-016</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM solution</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin, porcine skin, Type A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Knock-out serum replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>"KOSR"</td></tr><tr><td>Non-essential amino acids (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoethanol, 55 mM solution</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Fraction V, Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Corning</td><td>10-080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement, no vitamin A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 (SP34)</td><td>Life Technologies</td><td>10639011</td><td>"SP34"</td></tr><tr><td>Growth factor reduced Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>"MAT"</td></tr><tr><td>L-absorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Human serum transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Life Technologies</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&amp;D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>255-SC</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>291-G1</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R&amp;D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R&amp;D Systems</td><td>206-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R&amp;D Systems</td><td>207-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-11</td><td>R&amp;D Systems</td><td>218-1L</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R&amp;D Systems</td><td>288-TP</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>Flt-3 ligand (FLT3-L)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>IWP2</td><td>Tocris</td><td>3533</td><td></td></tr><tr><td>Angiotensin II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td><td></td></tr><tr><td>Losartan Potassium</td><td>Tocris</td><td>3798</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4</td><td>BD Biosciences</td><td>560650</td><td>Dilution 1:100; T cell assay</td></tr><tr><td>CD8 PE Clone RPA-T8</td><td>BD Biosciences</td><td>561950</td><td>Dilution 1:10; T cell assay</td></tr><tr><td>CD34 APC Clone 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>340441</td><td>Dilution 1:100; EHT assay</td></tr><tr><td>CD34 PE-Cy7 Clone 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>348801</td><td>Dilution 1:100; Hemogenic endothelium</td></tr><tr><td>CD43 FITC Clone 1G10</td><td>BD Biosciences</td><td>555475</td><td>Dilution 1:10; Hemogenic endothelium</td></tr><tr><td>CD45 APC-Cy7 Clone 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>557833</td><td>Dilution 1:50; T cell assay</td></tr><tr><td>CD45 eFluor450 Clone 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>642284</td><td>Dilution 1:50; EHT assay</td></tr><tr><td>CD56 APC Clone B159</td><td>BD Biosciences</td><td>555518</td><td>Dilution 1:20; T cell assay</td></tr><tr><td>CD73 PE Clone AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>Dilution 1:50; Hemogenic endothelium</td></tr><tr><td>CD184 APC Clone 12G5</td><td>BD Biosciences</td><td>555976</td><td>Dilution 1:50; Hemogenic endothelium</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>Dilution 1:10,000; T cell assay</td></tr><tr><td>OP9 DL4 cells</td><td></td><td></td><td>Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156</td></tr><tr><td>MethoCult H4034</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4034</td><td>"MeC"</td></tr><tr><td>Milli-Q water purification system</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO2 incubator</td><td></td><td></td><td>Set at 37 C</td></tr><tr><td>Multigas incubator</td><td></td><td></td><td>Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2</td></tr><tr><td>6 well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24 well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>6 well low-adherence tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>24 well low-adherence tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>35 mm tissue culture dishes</td><td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Blunt-end needle, 16 gauge</td><td>Corning</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>3 cc syringes</td><td>Corning</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polypropylene test tube</td><td>Corning</td><td>352063

regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Een van de belangrijkste doelen voor regeneratieve geneeskunde is de generatie en het onderhoud van hematopoietische stamcellen (HSCs) afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs). Tot voor kort hebben hematopoietische progenitorcellen die ontbreken van HSC potentieel, en in plaats daarvan lijken dooierzak Haematopoiese voornamelijk gegenereerd door inspanningen om te onderscheiden van hPSCs in HSCs. Deze resulterende hematopoietische progenitorcellen mogelijk beperkte nut voor in vitro ziekte modellering van verschillende volwassen hematopoietische aandoeningen, met name die van de lymfoïde geslachten. Echter, we hebben onlangs beschreven methoden voor het genereren van erytro-myelo-lymfoïde multilineage definitieve hematopoietische progenitorcellen van hPSCs met een fase-specifieke gestuurde differentiatie-protocol, die we hier schetsen. Embryoid organen (EBs) worden door enzymatische dissociatie van hPSCs op de kelder membraan matrix-gecoate plasticware gevormd. EBs worden onderscheiden naar mesoderm door recombinant BMP4, die later naar de definitieve hematopoietische programma door de GSK3β-remmer, CHIR99021 is opgegeven. Als alternatief, primitieve Haematopoiese wordt bepaald door de PORCN-remmer, IWP2. Haematopoiese is verder gedreven door de toevoeging van recombinant VEGF en ondersteunende hematopoietische cytokinen. De resulterende hematopoietische progenitorcellen gegenereerd met behulp van deze methode hebben het potentieel om te worden gebruikt voor ziekte en ontwikkelingsstoornissen modelleren, in vitro.

Een schematische voorstelling afgebeeld van de inductie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van hPSCs wordt geïllustreerd in Figuur 1. Mesoderm patronen door canonieke WNT signalering optreedt gedurende 2-3 dagen van differentiatie, gevolgd door hematopoïetische voorlopercellen specificatie.
Representatieve flow cytometrische analyse en kolonievormende methylcellulose tes...

Hier presenteren we menselijke pluripotente de protocollen van de cultuur van het cel van de stam (hPSC), gebruikt om te onderscheiden van hPSCs in CD34+ hematopoietische progenitorcellen. Deze methode maakt gebruik van fase-specifieke manipulatie van canonieke WNT signalering cellen uitsluitend naar ofwel het definitieve of primitieve hematopoietische programma opgeven.

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Het algemene doel van deze methode is om de differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen richting het primitieve of definitieve hematopoëtische programma te sturen door middel van een benadering met stadiumspecifieke signaalmanipulatie. Deze methode kan veel kernvragen in het vakgebied beantwoorden, zoals het begrijpen van de signaal- en transcriptionele regulatoren van de menselijke definitieve hematopoëse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze gebruikmaakt van directe, stadiumspecifieke manipulatie.Carissa Dege, postdoc in mijn laboratorium, demonstreert deze procedure. Om het protocol te starten, gebruikt u vooraf bereide humane pluripotente stamcellijnen of HPSC's, gegroeid op muis embryonale fibroblasten of MEF's tot 70% tot 80% confluentie in een incubator van 37 °C met vijf procent CO2. Aspireer het HPSC-medium en voeg één milliliter 0,25% Trypsine EDTA van 37 °C toe aan elke well gedurende één minuut.Zuig na één minuut de Trypsine af en voeg één milliliter stockmedium toe aan elke put. Schraap de cellen met een celschraper van de plaat. Voeg vervolgens één milliliter wasbuffer toe aan elke put.Tritureer de cellen drie tot vijf keer met een serolo

directed-differentiation-primitive-definitive-hematopoietic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Genereren van T-lymfocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen geeft een alternatieve aanpak van het gebruik van embryonale stamcellen voor T-cel-gebaseerde immunotherapie. De werkwijze blijkt dat door een...

Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten

Wij hebben, op basis van kennis uit de ontwikkelingsbiologie en gepubliceerd onderzoek, een geoptimaliseerd protocol ontwikkeld om efficiënt A9 middenhersen-dopaminerge neuronen te genereren uit zowel menselijke embryonale stamcellen als menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, wat nuttig zou zijn voor ziektemodellering en celvervangende therapie voor de ziekte van Parkinson.

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft de efficiënte inductie van hemogene endotheel en multipotente hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen via de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten via overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren. Deze technologie kan worden toegepast op het menselijk systeem om platforms te bieden voor toekomstig onderzoek naar hematopoëse, hematologische ziekten en hematopoietische stamceltransplantatie.

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

Hier presenteren we een protocol om precies te vormen hemogenic endoteel van menselijke pluripotente stamcellen in een feeder-en xeno-vrije voorwaarde. Deze methode zal hebben brede toepassingen in ziektemodel lering en screening voor therapeutische verbindingen.

Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

Hier presenteren we een protocol voor immunophenotypic karakterisering en cytokine geïnduceerde differentiatie van snoer bloed afgeleide CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen tot de vier myeloïde lijn. De toepassingen van dit protocol omvatten onderzoeken naar het effect van myeloïde ziekte mutaties of kleine moleculen op myeloïde differentiatie van de CD34+ cellen.

Pan-myeloïde differentiatie van menselijk snoer bloed afgeleid CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen

Dit protocol demonstreert de inductie van een hemogeen programma in menselijke dermale fibroblasten door afgedwongen expressie van de transcriptiefactoren GATA2, GFI1B en FOS om hematopoietische stam en voorlopercellen te genereren.

Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

Het doel van dit artikel is om een gestandaardiseerde aanpak te bieden om menselijke hepatische voorloperdifferentiatie van pluripotente stamcellen te induceren. De ontwikkeling van deze procedure met kant-en-klare mediaformuleringen biedt de gebruiker een gemakkelijk systeem om menselijke levercellen te genereren voor biomedisch onderzoek en vertaling.

Hepatische voorloperspecificatie van pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd differentiatiesysteem

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol presenteert de differentiatie van humane osteoclasten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en beschrijft methoden voor de karakterisering van osteoclasten en osteoclastprecursoren.

Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Leer hoe je menselijke pluripotente stamcellen differentieert naar primitieve of definitieve hematopoëtische progenitorcellen via stadiumspecifieke manipulatie van WNT-signalering. Deze methode biedt inzicht in transcriptieregulatoren van hematopoëse.

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen