Name: Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer een fluorescentie-gebaseerde lymfocytassay voor immunologie en drug discovery met lymfocyten van Nurr77 GFP-transgene muizen. Deze methode identificeert kleine moleculen die de lymfocytactivatie moduleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Merck Frosst Start-up middelen die door Universiteit van Montreal. We danken Drs Jean Duchaine en Dominic Salois van de High-throughput platform aan het Instituut voor Onderzoek in de Immunologie en Kanker voor hun discussie, commentaar en feedback. Moutih Rafei houdt een Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Award.

Alle dieren protocollen werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Montreal. De muizen werden gedood door een geleidelijke inademing van CO 2 tot er geen vitale functies waargenomen gevolgd werden door cervicale dislocatie. De procedure werd uitgevoerd door een gecertificeerd persoon uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de dieren werden gedood op een humane manier en op basis van de aanbevelingen van de Canadese Raad over Animal Care. 1. Bereiding van splenocyten Medium en Flow-cytometrie Buffer <ol><li> Voer alle stappen in het kader van een 70% ethanol-gereinigd biologische capuchon. </li><li> Verwijder 70 ml voorverwarmde Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x medium (in de handel verkrijgbaar en in gefilterd 500 ml volume steriele flessen meegeleverd) en plaats in een steriele buis. Het verwijderde medium zal later worden gebruikt in het protocol. </li><li> Supplement de resterende 430 ml RPMI 1640 met 1 x 50 ml geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 5 ml penicilline / streptomycine, 5mL HEPES, 5 ml niet-essentiële aminozuren, 5 ml natriumpyruvaat en 0,05 ml gefiltreerd (1M) 2-mercaptoethanol. OPMERKING: Pre-warm splenocyten medium met behulp van een waterbad ingesteld op 37 ºC tot warmte schokkend cellen te voorkomen. Dit is belangrijk voor inductie van cellulaire apoptose voorkomen. </li><li> Om de stroom-cytometrie buffer te bereiden, voeg 2 ml FBS tot 98 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en koel bewaren tot gebruik (bij voorkeur binnen drie dagen). </li></ol> 2. Genereren van splenocyten Cell Suspension uit Nur77 GFP muizenmilten <ol><li> Een septically de milt uit een 6-8 weken oude vrouwelijke Nur77 GFP muis isoleren. <ol><li> Hiervoor werken onder steriele kap. Week de opgeofferd muis vacht, schaar en pincet in 70% ethanol. </li><li> Leg de muis op zijn rechterzijde, snijd de huid en de spieren in de linkerbovenhoek buik kwadrant. Inspecteer de incisie gebied om zichtbaar te lokaliseren de milt en snijd het uit. Houd de miltin splenocyten medium op ijs pas klaar om de volgende stap uit te voeren. </li></ol></li><li> Plaats de milt (en) in een 10 cm 2 celkweek petrischaaltje met 5 ml voorverwarmd medium splenocyten. </li><li> Wrijf de milt met behulp van een steriele injectiespuit zuiger totdat de oplossing troebel. Een milt collageenmatrix moet tegen het einde van de procedure blijven. </li><li> Na een uitgebreide pureren in splenocyten medium, het verzamelen van de celsuspensie en geef het door een 70 um cel zeef geplaatst op een 50 ml buis te filteren-out vuil of stolsels. </li><li> Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Na het weggooien van het supernatant, resuspendeer de cel pellet in 2-3 ml in-house geproduceerde of commercieel van rode bloedcellen lysisbuffer. Na pipetteren (2-3 keer) laat de schorsing rust voor 20-30 s. </li><li> Voeg 5 ml PBS buffer of een geschikte keuze centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 500 x g. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof (moet rood van kleur zijn, want het bevat gelyseerde rode blood-cellen) en resuspendeer de cel pellet in 2 ml splenocyten medium. </li><li> Met behulp van een hemocytometer, tel het aantal cellen gekleurd met trypan blauw te maken tussen levende en dode (necrotische) cellen. </li></ol> 3. T-cel Isolatie van de splenocyten Cell Suspension <ol><li> Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 500 x g. Resuspendeer de cellen in serumvrij RPMI-medium (50 ml van stap 1,3) tot een cellulaire concentratie van 10 x 10 6 cellen / ml te verkrijgen. </li><li> Overdracht van de cellen naar een 5 ml polystyreen buis en de vernietiging van een 100 ul aliquot van splenocyten zuiverheid beoordeling / vergelijking aan het einde van de zuiveringsstap. </li><li> Voeg normaal rattenserum aan de celsuspensie bij 50 ul / ml gevolgd door T celisolatie antilichaam cocktail (50 ul / ml). </li><li> Meng de celsuspensie en laat het rusten voor 10 min. Deze stap maakt het antilichaam cocktail om alle ongewenste cellen te binden. </li><li> Voeg de streptavidine snelle sferen (magneetic korrels) gedurende 2,5 min, breng dan het volume op 2,5 ml met de serumvrije medium. </li><li> Plaats de buis in een celisolatie magneet voor 3 minuten. </li><li> Breng de T-cel suspensie in een nieuwe polystyreen buis door het houden van de magneet en uitgieten van de oplossing in één beweging. OPMERKING: De geïsoleerde suspensie bevat het gezuiverde T-cellen. Alle ongewenste cellen worden gehouden op de zijkant van de buis gebonden aan de magnetische streptavidine beads. </li><li> Tel de geïsoleerde T-cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer. OPMERKING: Bij deze stap de zuiverheid van de geïsoleerde T-cellen (optioneel) kan worden gecontroleerd door analyse van het percentage van CD3 + gebeurtenissen voor en na T cel isolatie door flow-cytometrie. 13 <ol><li> Kort Centrifugeer 1 ml splenocyten celsuspensie bij 500 x g. Verwijder het supernatant en suspendeer de cellen in stromingscytometrie buffer bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Voeg fluorescent-gelabelde anti-mouse CD3 antilichaam bij een concentratie van 1: 100. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was eenmaal, centrifuge en resuspendeer in flow-cytometrie buffer (400 ul) voor analyse door middel van flow-cytometrie. </li></ol></li></ol> 4. B-cel Isolatie van de splenocyten Cell Suspension <ol><li> Volgen hetzelfde protocol als beschreven voor T-cellen (stappen 3.1-3.8) maar met gebruik van een B-cel isolatiekit. Voor de beoordeling zuiverheid, gebruik maken van de CD19 antilichaam in plaats van de CD3 antilichaam. 13 <ol><li> Voor de beoordeling zuiverheid (optioneel), gebruik maken van de CD19 antilichaam in plaats van de CD3 antilichaam. Centrifuge 1 ml splenocyten celsuspensie bij 500 x g. Verwijder het supernatant en suspendeer de cellen in stromingscytometrie buffer bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. </li><li> add fluorescent gelabeld anti-muis CD19 antilichaam bij een concentratie van 1: 100 en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was eenmaal, centrifuge en resuspendeer in flow-cytometrie buffer (400 ul) for analyse door middel van flow-cytometrie. </li></ol></li></ol> 5. T-cel activatie en de inductie van GFP expressie <ol><li> Zaad de T-cellen, in suspensie, in een ronde bodem 96-well plaat bij een concentratie van 2,5 x 10 5 cellen / putje. </li><li> Voeg recombinant interleukine (IL) -7 bij 2 ng / ml en CD3 / CD28 magnetische parels (25 ui / 10 6 cellen). Houd een gedeelte van de T-cellen behandeld met kralen te dienen als een negatieve controle voor latere metingen die niet-geactiveerde T-cellen vertegenwoordigen. </li><li> Twaalf uur later, oogsten de T-cellen van de 96-well plaat door voorzichtig pipetteren de celsuspensie in elk putje en neer elke hiel-cel complex / aggregaten breken. Verzamel de opschorting van alle putjes in een 5 ml polystyreen buis. </li><li> De buis wordt met de suspensie in de eerder voor zuivering van T- of B-cellen hetzelfde celisolatie magneet en laat het rusten gedurende 5 min. </li><li> Breng de celsuspensie T into een nieuwe polystyreen buis door het houden van de magneet en uitgieten van de oplossing in één beweging. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen in splenocyten vers medium tot een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml te krijgen. </li><li> Beoordelen van GFP expressie intensiteit door flow-cytometrie (optioneel voor kwaliteitscontrole) op 12 tot 24 uur na de stimulatie in vergelijking met niet-geactiveerde T-cellen. 12 NB: De GFP-fluorescentie is inherent aan de Nur77 GFP T-cellen en manifesteert zich na succesvolle activering van de TCR. 12 </li><li> Voor de beoordeling van de levensvatbaarheid en activering (optioneel) van microscopie, vlekken op de geactiveerde cellen met Hoechst 30 minuten vóór de analyse bij een concentratie van 0,2 ug / ml. Voeg voldoende volume van de celsuspensie om een ​​cover dia of een putje van een vlakke bodem zwart-zijdige 384-wells plaat en onderzoek onder de fluorescentie microscoop om levende cellen te beoordelen. Dode cellen zal niet nucleaire behoudenkleuring. 14 </li></ol> 6. B-cel activatie en de inductie van GFP expressie <ol><li> Gebruik een kolf T-25, resuspendeer de geïsoleerde B-cellen in 1 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Add anti-muis IgG / IgM (H + L) bij 10 ul / ml en recombinant CD40L bij een concentratie van 200 ng / mL. Houd een deel van de B-cellen onbehandeld om te dienen als een negatieve controle voor latere metingen (die niet-geactiveerde B-cellen). </li><li> Beoordelen intensiteit GFP expressie door flow-cytometrie op 12 of 24 uur na stimulatie in vergelijking met niet-geactiveerde B-cellen. LET OP: De GFP-fluorescentie is inherent aan de Nur77 GFP B-cellen en manifesteert zich na succesvolle activering van de BCR. 12 </li><li> Voor de beoordeling van de levensvatbaarheid en activering (optioneel) van microscopie, vlekken op de geactiveerde cellen met Hoechst 30 minuten vóór de analyse bij een concentratie van 0,2 ug / ml. Voeg voldoende volume van de celsuspensieeen cover dia of een putje van een vlakke bodem zwart-zijdige 384-wells plaat en onderzoeken in het kader van een fluorescentie microscoop om levende cellen te beoordelen. Dode cellen nucleaire kleuring handhaven. 14 </li></ol> 7. high throughput screening van kleine moleculen <ol><li> Bereid een celsuspensie van 2 x 10 6 cellen / ml van de geactiveerde T- of B-cellen (magnetische korrels of antilichamen / CD40L) of niet-geactiveerde groepen. </li><li> Plaat 75.000 cellen / putje in een 384-well plaat (volume van 40 ui). Gebruik een platte bodem zwart-zijdige 384-well plaat of een microscoop dekking glijbaan voor de levensvatbaarheid en activering beoordeling door fluorescentie microscopie (optioneel kwaliteitscontrole stap voorafgaand aan de HTS) met behulp van Hoechst vlek (zie stap 5.8 en 6.4 voor details). 14 </li><li> Handmatig of met een geautomatiseerd systeem, om de geneesmiddelen van keuze (opgelost in 0,5% DMSO) aan elke well. </li><li> Voeg de drager (DMSO) positieve (geactiveerd) en negatieve (non-actiactiveerd) controleputjes. Passen DMSO concentratie tot maximaal 0,5%. </li><li> Incubeer de platen gedurende 24 uur (of incubatietijd keuze) bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Op de dag van de screening verdunnen Hoechst 33342 vlek oplossing (1:. 3333, voor bijvoorbeeld voeg 10 ul aan de cellen in 384 putjes met een totaal volume 50 uL genereren). Vlek 30 min voor GFP analyse door toevoeging Hoechst oplossing tot een concentratie van 0,2 ug / ml te bereiken. </li><li> Voorzichtig pipet de cellen op en neer om een ​​homogene verdeling in elke krijgen ook. Opmerking: Deze stap is belangrijk bij het afgeven van geneesmiddelen (stap 7,3) onder toepassing van een geautomatiseerd systeem zoals de cellen hopen zich aan één zijde van de put, tegengesteld aan de richting van de stroming. </li><li> Spin de platen bij 45 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Laat de platen rusten gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voer plaat (s) read-outs, met behulp van de geautomatiseerde confocale hoge gehalte scresterking (HCS) -systeem. 15 Laad de plaat aan de machine. Stel de doelstelling op 40X of hogere vergroting. Gebruik camera # 4 voor Hoechst (UV-lamp) en camera # 1 voor GFP (laser 488). Stel de machine 6-10 velden per goed te lezen. Stel de machine tot twee opeenvolgende metingen per gebied te doen bij 488 nm (te lezen GFP) en UV-licht (te lezen Hoechst). Stel de doelstelling op 40X of hogere vergroting. NB: Het systeem is een geautomatiseerde microscoop die aanpassingen niet vereist. De brandpuntsafstand, de intensiteit van het invallende licht en de blootstellingsduur worden allemaal automatisch door de machine. </li></ol>

<ol><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+were+new+medicines+discovered%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li>
<li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).</li>
<li>Lokey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+chemical+genetics%3A+progress+and+obstacles+on+the+path+to+a+new+pharmacopoeia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).</li>
<li>Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoproteomics-driven+drug+discovery%3A+addressing+high+attrition+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates.</a> Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).</li>
<li>Pruss, R. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20942792">Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).</li>
<li>St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+chemical+genetics+in+yeast+for+discovery+of+chemical+probes+targeting+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism.</a> Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).</li>
<li>Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+study%3A+impact+of+technology+investment+on+lead+discovery+at+Bristol-Myers+Squibb%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb.</a> Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Walters, W. P., Namchuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+screens%3A+how+to+make+your+hits+a+hit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Designing screens: how to make your hits a hit.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).</li>
<li>Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+screens+as+a+renewed+approach+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery.</a> Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li>
<li>Moran, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+signal+strength+in+Treg+and+iNKT+cell+development+demonstrated+by+a+novel+fluorescent+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse.</a> J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).</li>
<li>Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Glycosphingolipid+Expression+in+Mouse+Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues.</a> J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+estimation+of+DNA+and+RNA+content+in+intact+cells+stained+with+hoechst+33342+and+pyronin+Y%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y.</a> Cytometry. 2, 143-150 (1981).</li>
<li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).</li>
<li>An, W. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19347618">Fluorescence-based assays.</a> Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).</li>
<li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+TCR+ligation+without+costimulation+causes+rapid+onset+of+Fas-dependent+apoptosis+of+naive+murine+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells.</a> J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).</li>
<li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).</li>
<li>Jiang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+IL-7%2C+a+key+lymphotrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).</li>
<li>Koenen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutually+exclusive+regulation+of+T+cell+survival+by+IL-7R+and+antigen+receptor-induced+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals.</a> Nat Commun. 4, 1735(2013).</li>
<li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+%28IL-4%29+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells%3A+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).</li>
<li>Hawkins, C. J., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+Bcl-2+family+of+apoptosis+regulatory+proteins+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system.</a> Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).</li>
<li>Sumantran, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+chemosensitivity+assays%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular chemosensitivity assays: an overview.</a> Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).</li>
<li>Huh, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18304834">A cell-based system for screening hair growth-promoting agents.</a> Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).</li>
<li>Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+signal+transduction%3A+opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TCR signal transduction: opening the black box.</a> J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).</li>
<li>Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+prevents+cell+death+during+primary+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation.</a> J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).</li>
<li>Michels, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+selection+of+small+molecules+to+alter+allele-specific+MHC+class+II+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation.</a> J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Verscheidene uitlezing werkwijzen zijn gebruikt voor de ontwikkeling van gevoelige en betrouwbare HTS assays. Deze omvatten colorimetrische, lichtgevende of fluorescerende methoden. Hoewel colorimetrische methoden zijn eenvoudig te installeren, ze vereisen meerdere toevoegingen van chemicaliën die kunnen interfereren of verstoren van de cellen getest. 23 Verder zij geen dynamische beoordeling van een biologische respons mogelijk de farmacologische werking wordt gesteld op een specifiek eindpunt. ...

High throughput screening (HTS) is een bewezen strategie voor de identificatie van nieuwe therapeutische moleculen of herpositionering van FDA-goedgekeurde geneesmiddelen in nieuwe medische indicaties ingeburgerd. 1 nu toe, kan de bereikte HTS succes worden gemeten door de overvloed van eerder ontdekte drugs. Bijvoorbeeld de tyrosine kinase inhibitor lapatinib gebruikt voor de behandeling van borstkanker, sitagliptine; een dipeptidylpeptidase-4 (DPP-4) -remmer gebruikt als een anti-hyperglycemische drugs, en de orale Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitor dasatinib gebruikt voor de behandeling van chronische myelogene leukemie geven enkele voorbeelden van een lange lijst van goedgekeurde geneesmiddelen oorspronkelijk ontdekt door HTS. 2 Hoewel de productiviteit van de farmaceutische industrie onlangs heeft last van een gebrek in de ontdekking van nieuwe chemische entiteiten, de kans op een succesvolle geneesmiddelen kan worden verbeterd door een toename van het aantal pre-klinische candidates weergeven van modulerende biologische / biochemische eigenschappen. Bijgevolg kan de ontwikkeling van nieuwe assays HTS aangepast voor fenotypische screening potentieel belangrijke farmacologische instrumenten verschaffen voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen treffers bieden. 3, 4, 5, 6 Verder kunnen HTS nu worden uitgevoerd in een sneller tempo door belangrijke technologische veranderingen in de afgelopen jaren ook op maat gemaakte flexibele robot installaties nieuwe uitlezing technologieën of omvangrijke miniaturisatie. 2, 7 Onder de factoren die bijdragen aan de groeiende belangstelling voor het gebruik van fenotypische screening (aka forward farmacologie) is de perceptie dat het focussen op de functionele gevolgen in plaats van ongenuanceerd reductionistische aannames ten aanzien van moleculaire doelwitten (target-based screening / biochemische reacties) is de kans groter naar sho<html> w klinische werkzaamheid. Zo fenotypische screening houdt de belofte om nieuwe potentiële therapeutische verbindingen en moleculaire wegen van nog onbehandelbare ziekten bloot te leggen. 2 Goed remmers of activatoren voor een gegeven doelwit of celfunctie te identificeren, is een zeer gevoelige en betrouwbare test nodig om onderscheid te maken tussen bonafide klappen en valse positieven. Dus, wat maakt een goede test? De kwaliteit van een gegeven test moet eerst worden beoordeeld door de signaal-ruisverhouding (weerspiegeld door een Z-factor). 8 Ten tweede moet het gerichte effect of het doel van het scherm duidelijk worden vastgesteld. Zo kunnen functionele celtechnieken belangrijke voordelen voor screening receptor in tegenstelling tot een assay specifiek ontworpen om ligand-receptorbinding te bepalen. De reden hiervoor is dat de laatste benadering niet kan maken tussen agonist en antagonist liganden.ss = &quot;xref&quot;&gt; 9 daarentegen een celgebaseerde aanpak waarschijnlijk effectiever receptorfunctie direct kan worden beoordeeld in een biologisch fenotype te zijn (proliferatie, stoppen van de celcyclus, apoptose en / of differentiatie). Wel moet worden opgemerkt dat biochemische assays belangrijke voordelen kan bieden via fenotypische testen zoals inbreuk maken op een specifieke intracellulaire doelwit. Een goed geoptimaliseerde biochemische assay zullen over het algemeen minder gegevens scatter dan een fenotypische screening en vereenvoudigt nadien onderzoeken die op de drug moleculaire werkingsmechanisme. De belangrijkste nadeel van doelgerichte of biochemische assays is de kans op het amplificeren van het aantal valse positieve hits die aspecifieke doelen kunnen beïnvloeden wanneer getest in een biologisch systeem (verlies van de specificiteit oorspronkelijk onderzocht in de biochemische assay). 10 Hoewel een gevestigde cut-off point tussen negatieve en positieve treffers het aantal valse positieven te minimaliseren in de primaire screening, het gebruik van een fysiologisch relevante systeem nabootsen van de natuurlijke cellulaire omgeving zoals intacte cellen, weefsels of hele hele dier blijft de kern van het testontwerp slinger. Daarom fenotypische screening maakt lead discovery met gewenste biologische / fenotypische effecten op ziekten zonder geïdentificeerde drug targets zonder voorafgaande kennis van activiteiten of wijze van optreden van de verbinding. 11 De hierin studie heeft betrekking op de ontwikkeling en het testen van een geoptimaliseerd en reproduceerbare fenotypische screening op basis van twee belangrijke componenten: een in de handel verkrijgbaar muismodel en een geclusterde sub-familie van chemische verbindingen. Wat het diermodel, de assay berust op het gebruik van lymfocyten afgeleid van een muizenstam (Nur77 GFP) herbergt een bacterieel kunstmatig chromosoom bevat een cassette waarin de expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) wordt aangedreven door The Nur77 promotor. 12 Het kenmerk van deze stimulering is gebaseerd op het feit dat Nur77 een directe vroege gen opgereguleerd na T-celreceptor (TCR) of B-cel receptor (BCR) stimulatie. 12 Wat betreft de werkwijze het screenen zelf, is een aanpak om het vermijden van de screening van triviale analogen tegelijk de tijd die nodig is om een grote chemische library (&gt; 10 5 verbindingen) te beoordelen. Om dit te doen, een database van chemische verbindingen geselecteerd door geneesmiddelen chemici gebruik van virtuele screening instrumenten werd benut om topologisch soortgelijke verbindingen met behulp van bekende actieve zaad structuren als verwijzingen te identificeren. Deze aanpak liet ons toe om te screenen 4398 verbindingen waarmee een totaalbedrag bibliotheek van meer dan 136.000 chemische entiteiten.

<table><tbody><tr><td>Nur77GFP muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Muisensoort nr. 016617</td><td>Er werd een eigen kolonie opgezet in onze dierenfaciliteit&nbsp;</td></tr><tr><td>96 wells-U kweekplaten, sterieel</td><td>VWR International</td><td>10062-902</td><td>T-cel activering met behulp van magnetische kralen</td></tr><tr><td>70 &micro;m celzeef, sterieel</td><td>Corning Inc.</td><td>352350</td><td>Generatie van splenocyten celsuspensie</td></tr><tr><td>5 ml polystyreen buisjes met ronde bodem, sterieel</td><td>Corning Inc.</td><td>352058</td><td>Generatie van splenocyten celsuspensie</td></tr><tr><td>50 ml polypropyleen buisjes met kegelvormige bodem, sterieel</td><td>VWR International</td><td>89039-656&nbsp;</td><td>Generatie van splenocyten celsuspensie</td></tr><tr><td>10 ml spuit zonder naald, sterieel</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305482</td><td>Om de milt te pletten</td></tr><tr><td>T-25 kweekflacon</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690 175</td><td>Om B-cellen tijdens activering te incuberen</td></tr><tr><td>5 ml celkweekschaal, sterieel</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627 160</td><td>Om de milt te pletten</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>WISENT Inc.</td><td>450-200-EL&nbsp;&nbsp;</td><td>Onderdeel van het splenocyt medium</td></tr><tr><td>RPMI 1600 met natriumbicarbonaat en L-glutamine</td><td>WISENT Inc.</td><td>350-002-CL&nbsp;</td><td>Onderdeel van het splenocyt medium</td></tr><tr><td>MEM niet-essentiële aminozuren</td><td>WISENT Inc.</td><td>321-010-EL&nbsp;</td><td>Onderdeel van het splenocyt medium</td></tr><tr><td>HEPES vrije zuur 1 M</td><td>WISENT Inc.</td><td>330-050-EL&nbsp;</td><td>Onderdeel van het splenocyt medium</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat oplossing (100mM)</td><td>WISENT Inc.</td><td>600-110-EL&nbsp;</td><td>Onderdeel van het splenocyt medium</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)&nbsp;</td><td>WISENT Inc.</td><td>080-910&nbsp;</td><td>Onderdeel van het splenocyt medium en flowcytometrie buffer</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>WISENT Inc.</td><td>311-010-CL</td><td>Onderdeel van flowcytometrie buffer</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td>Onderdeel van het splenocyt medium</td></tr><tr><td>T-Cellen isolatiekit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19851</td><td>Om T-cellen te isoleren</td></tr><tr><td>B-Cellen isolatiekit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>Om B-cellen te isoleren</td></tr><tr><td>Muis T-Activator CD3/CD28 superparamagnetische kralen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11452D</td><td>Om T-cellen te activeren&nbsp;</td></tr><tr><td>Celisolatie magneet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td>Om T-cellen te isoleren en de magnetische kralen te verwijderen&nbsp;</td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>115-006-068</td><td>Om B-cellen te stimuleren</td></tr><tr><td>Recombinant Murine IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17&nbsp;</td><td>Om T-cel overleving tijdens activering te ondersteunen</td></tr><tr><td>Recombinant CD40L</td><td>R&amp;D Systems</td><td>8230-CL/CF</td><td>Om B-cellen te stimuleren</td></tr><tr><td>Anti-muis CD3 antilichaam</td><td>BD Pharmingen</td><td>561799</td><td>Om T-cellen te kleuren voor flow-cytometrie</td></tr><tr><td>Anti-muis CD19 antilichaam</td><td>BD Pharmingen</td><td>553786</td><td>Om B-cellen te kleuren voor flow-cytometrie</td></tr><tr><td>Biomek FXp</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>A31842</td><td>Om cellen na 24 uur incubatie opnieuw te suspenderen</td></tr><tr><td>Opera Phenix High Content Screening System</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>HH14000000</td><td>Om GFP/Hoechst signaal te analyseren</td></tr></tbody></table>

een fluorescentie gebaseerde lymfocyt assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is momenteel de steunpilaar voor de identificatie van chemische entiteiten kan moduleren biochemische reacties of cellulaire processen. Met de vooruitgang van biotechnologie en de hoge translationele potentieel van kleine moleculen, een aantal innovatieve benaderingen geneesmiddelen hebben ontwikkeld, waarbij de oplevende belangstelling voor het gebruik van HTS verklaart. De oncologie veld is op dit moment de meest actieve onderzoeksgebied voor drug discovery, zonder belangrijke doorbraak voor de identificatie van nieuwe immunomodulerende verbindingen targeting-transplantatie gerelateerde complicaties of auto-immune aandoeningen. Hier presenteren we een nieuwe in vitro muizen-fluorescentie gebaseerde assay lymfocyt gemakkelijk worden aangepast voor de identificatie van nieuwe immunomodulerende verbindingen. Deze test maakt gebruik van T- of B-cellen afkomstig van een transgene muis waarin het Nur77 promotor drijft GFP expressie na T- of B-celreceptor stimulatie. Aangezien de GFP intensiteit weerspiegelt deactivatie / transcriptionele activiteit van de doelcel, onze assay bepaalt een nieuw hulpmiddel om het effect van bepaalde verbinding (en) aan cellulaire / biologische reacties bestuderen. Zo werd een primaire screening uitgevoerd onder gebruikmaking 4398 verbindingen in afwezigheid van een &quot;target hypothese&quot;, die leidde tot de identificatie van mogelijke treffers 160 tonen immunomodulerende activiteiten. Zo is het gebruik van deze test is geschikt voor drug discovery programma verkennen grote chemische libraries voorafgaand aan in vitro / in vivo studies verder valideren.

Het ontwerp van de HTS assay Twee belangrijke factoren rekening gehouden bij het ontwerpen van de hierin fluorescentie. Eerst moesten we een fysiologische aandoening waarbij T- of B-celactivering een aandoening (bijvoorbeeld graft-versus-host ziekte) zou betekenen repliceren. Ten tweede moet de beoordeling van cellulaire activering worden uitgevoerd met een gevoelige en kwantitatieve methode. Fluorescentie is tegenwoordi...

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Het algemene doel van deze fluorescentiegebaseerde lymfocytenassay is het identificeren van nieuwe kleine moleculaire immunomodulatoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de immunologie over het mechanisme van lymfocytenactivatie en -inhibitie. Het belangrijkste voordeel van deze fenotypische functie en assay is dat deze kan worden aangepast voor geneesmiddelenonderzoek.Ahmed Fouda, een promovendus uit ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Desinfecteer onder een steriele werkkap de vacht van een zes tot acht weken oude vrouwelijke Nurr77 GFP-muis met 70% ethanol en plaats het dier op zijn rechterzijde. Maak vervolgens een incisie in de huid en spieren van het linker bovenkwadrant van de buikholte, lokaliseer de milt en verwijder deze, waarna het weefsel in splenocytmedium op ijs wordt geplaatst.Wanneer alle milten zijn verzameld, brengt u de weefsels over naar een celkweekschaal van 10 centimeter kwadraat met vijf milliliter voorverwarmd splenocytenmedium en gebruikt u de zuiger van een steriele spuit om het weefsel te vermalen tot de oplossing troebel is. Filter na grondig vermalen in het splenocytenmedium de celsuspensie door een celzee

a-fluorescence-based-lymphocyte-assay-suitable-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we describe a method highlighting the utility of bioluminescence assay for sensitive and rapid screening of drugs. These drugs can be tested alone or in combination to assess the synergism in their mode of action.

Cellular Bioluminescence Based Assay: A High Throughput Method for Combinatorial Drug Screening

This video demonstrates the screening of immunomodulatory compounds via fluorescent-based assay. Transgenic mouse-derived T lymphocytes with green fluorescent protein expression cassettes are treated with these compounds. The enhanced and reduced GFP signals enable the identification of the compounds' stimulatory and inhibitory effects, respectively.

A Fluorescence-Based Assay Using Engineered Lymphocytes for Screening Immunomodulatory Compounds

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Deze paper gebruikt een stroom cytometry-gebaseerde assay naar scherm bibliotheken van chemische inhibitoren voor de identificatie van remmers en de bijbehorende doelen die van invloed zijn T-cel receptor signalering. De hier beschreven methoden kunnen ook worden uitgebreid voor high-throughput screening.

Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering via de Screening van chemische remmer bibliotheken

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

Deze studie ontwikkelde een test voor high-throughput screening tegen Mycobacterium abscessus met een recent gecreëerde dubbele reporterstam, waarbij fluorescentie en luminescentie worden gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën snel te beoordelen. Dit protocol zal relevant zijn voor onderzoekers die nieuwe geneesmiddelen willen screenen op deze resistente bacterie.

Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën

Dit rapport beschrijft een geautomatiseerd protocol voor multiplex immunofluorescentie (mIF)-assays op een geautomatiseerde objectglaaskleuring. Het demonstreert de hoge reproduceerbaarheid van ruimtelijke proteomics op standaard high-throughput weefselautostainers en fluorescentiebeeldvormers met hele objectglaasjes, wat ideaal is voor aangepaste mIF-assays op een groot aantal weefselglaasjes in translationeel onderzoek.

High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

Leer een fluorescentie-gebaseerde lymfocytassay voor immunologie en drug discovery met lymfocyten van Nurr77 GFP-transgene muizen. Deze methode identificeert kleine moleculen die de lymfocytactivatie moduleren.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

Meer video's verkennen