Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

Het algemene doel van deze fluorescentiegebaseerde lymfocytenassay is het identificeren van nieuwe kleine moleculaire immunomodulatoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de immunologie over het mechanisme van lymfocytenactivatie en -inhibitie. Het belangrijkste voordeel van deze fenotypische functie en assay is dat deze kan worden aangepast voor geneesmiddelenonderzoek.

Ahmed Fouda, een promovendus uit ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Desinfecteer onder een steriele werkkap de vacht van een zes tot acht weken oude vrouwelijke Nurr77 GFP-muis met 70% ethanol en plaats het dier op zijn rechterzijde. Maak vervolgens een incisie in de huid en spieren van het linker bovenkwadrant van de buikholte, lokaliseer de milt en verwijder deze, waarna het weefsel in splenocytmedium op ijs wordt geplaatst.

Wanneer alle milten zijn verzameld, brengt u de weefsels over naar een celkweekschaal van 10 centimeter kwadraat met vijf milliliter voorverwarmd splenocytenmedium en gebruikt u de zuiger van een steriele spuit om het weefsel te vermalen tot de oplossing troebel is. Filter na grondig vermalen in het splenocytenmedium de celsuspensie door een celzeef van 70 micron in een buis van 50 milliliter om eventueel debris te verwijderen, en centrifugeer de resulterende suspensie van enkelvoudige cellen. Resuspendeer de pellet in twee tot drie milliliter lysisbuffer voor rode bloedcellen en stop de reactie na 20 tot 30 seconden met vijf milliliter RPMI of een andere geschikte buffer.

Verzamel vervolgens de cellen met een tweede centrifugatie en resuspendeer de pellet in twee milliliter splenocytmedium voor het tellen van de cellen. Om de T-cellen te isoleren, centrifugeer je de cellen opnieuw en resuspendeer je de pellet in serumvrij RPMI-medium bij een concentratie van 1 x 10⁷ cellen per milliliter. Breng de cellen over naar een polystyreen buisje van vijf milliliter en zet een aliquot van 100 µL splenocyten apart om later te gebruiken voor de zuiverheidsbeoordeling.

Voeg vervolgens 50 µL per ml normaal ratenserum toe aan de cellen, gevolgd door de toevoeging van 50 µL per ml T-celisolatie-antilichaamcocktail onder voorzichtig mengen. Incubeer de cellen na 10 minuten gedurende twee en een halve minuut met streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen. Voeg daarna serumvrij medium toe aan de cellen tot een eindvolume van 2,5 ml en plaats de buis gedurende drie minuten in een celisolatiemagneet.

Giet aan het einde van de incubatie, terwijl de buis in de magneet wordt gehouden, de supernatant in één beweging in een nieuwe polystyreenbuis. De T-cellen kunnen vervolgens worden geteld. Zaai de T-cellen uit in een 96-well plaat met ronde bodem bij een concentratie van 2,5 × 10⁵ cellen per well, met 200 µL vers splenocytmedium per well.

Voeg recombinant interleukine 7 en CD3/CD28 magnetische beads toe aan de betreffende putjes en plaats de plaat in een celkweekincubator. Tritureer na 12 uur voorzichtig de celsuspensie in elk putje om eventuele aggregaten van beads en cellen te verbreken. Breng de celsuspensies vervolgens vanuit elk putje over naar individuele polystyreenbuisjes van vijf milliliter.

Wanneer alle cellen zijn verzameld, plaatst u elke buis met cellen gedurende vijf minuten per keer in de scheidingsmagneet en schenkt u de supernatanten, terwijl de buis nog in de magneet staat, aan het einde van elke incubatie af in nieuwe polystyreen buizen. Verzamel vervolgens de cellen door centrifugatie en resuspendeer de pellets in vers splenocytenmedium tot een concentratie van 2 × 10⁶ cellen per milliliter. Voor high-throughput screening met kleine moleculen plaatst u 40 µL cellen per well in een 384-wells plaat en behandelt u de betreffende wells met het gekozen geneesmiddel of vehikel gedurende de gewenste behandelperiode in de celcultuurincubator.

Kleur 30 minuten vóór de GFP-analyse de cellen met de juiste concentratie Hoechst-oplossing en verdeel de kleurstof grondig door voorzichtig te pipetteren. Wanneer alle wells zijn gekleurd, centrifugeer dan de platen om de cellen onderin de wells te verzamelen en laat de cellen 15 minuten rusten bij kamertemperatuur. Laad de plaat volgens de instructies van de fabrikant.

Stel vervolgens het objectief in op 40X of hoger. Stel camera nummer vier in voor de UV-lamp en camera nummer één voor laser 488. Plaats de plaat in het high content screening-systeem.

Stel vervolgens het geautomatiseerde confocale high-content screeningsysteem zo in dat er zes tot 10 velden per put worden uitgelezen met twee opeenvolgende metingen per veld, bij 488 nanometer en UV-licht. CD3-positieve T-cellen vormen ongeveer 30% van een gegeven milt van een muis, waarbij een basale GFP-expressie van 10% wordt aangetoond. Na stimulatie van de CD3/CD28 T-celreceptor met beads wordt een vijf tot zes keer zo hoge toename in het percentage GFP-expressie waargenomen.

Tevens vertegenwoordigen CD19-positieve B-cellen 50 tot 55% van de totale miltcellen, waarbij de basale GFP-expressie vergelijkbaar is met die van niet-geactiveerde T-cellen. Interessant is dat stimulatie van de B-celreceptor met anti-muis IgG, IgM en recombinant CD40L slechts een minimale toename in GFP-expressie teweegbrengt. Na magnetische bead-isolatie, zoals zojuist gedemonstreerd, vertonen de geïsoleerde CD3-positieve T-cellen nog steeds een basale GFP-expressie van 10%.

Stimulatie met CD3/CD28-beads induceert echter een significante upregulatie van de GFP-respons. Op dezelfde wijze vertonen de gezuiverde geactiveerde B-cellen na magnetische bead-isolatie van B-cellen een hogere expressie van GFP vergeleken met geactiveerde B-cellen in splenocyten. In dit representatieve experiment onthulde primaire high-throughput screening van 4398 verbindingen verschillende activatoren en inhibitoren van T-celactivatie.

Echter was de geobserveerde GFP-expressie van de gestimuleerde T-cellen 20 keer hoger dan die van de ongestimuleerde T-cellen. Hierdoor ontstond een actievenster waarin GFP-inhiberende verbindingen gemakkelijk gedetecteerd konden worden. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in 36 tot 48 uur worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen na elke stap geteld moeten worden. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals ELISA of western blotting, worden uitgevoerd om eventuele aanvullende vragen te beantwoorden. Deze techniek zal de weg vrijmaken voor drug discovery voor immunomodulatie bij knaagdieren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u T- of B-cellen kunt isoleren en activeren die afkomstig zijn uit de Nurr77 GFP-muisplaten.