Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen
10 maart 2017
We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.
Het algemene doel van deze fluorescentie-gebaseerde lymfocyt-assay is om nieuwe kleine moleculaire immunomodulatoren te identificeren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van immunologie te beantwoorden over het mechanisme van lymfocytactie en -remming. Het belangrijkste voordeel van deze fenotypische functie en assay is dat deze kan worden aangepast voor medicijnontdekking.
Ahmed Fouda, een afgestudeerde student uit ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Onder een steriele werkkap, desinfecteert u de vacht van een vrouwelijke Nurr77 GFP-muis van zes tot acht weken oud met 70% ethanol en plaatst u het dier op zijn rechterzij. Maak vervolgens een incisie in de huid en spieren van de bovenste linkerbuikkwadrant en lokaliseer en verwijder de milt, waarbij u het weefsel in splenocytmedium op ijs plaatst.
Wanneer alle milten zijn verzameld, brengt u de weefsels over in een celkweekschaal van 10 centimeter vierkant die vijf milliliter voorverwarmd splenocytmedium bevat en gebruikt u een steriele spuitplunger om de weefsels te pletten totdat de oplossing troebel is. Na uitgebreid pletteren in splenocytmedium, filtert u de celsuspensie door een 70 micron celstrainer in een buis van 50 milliliter om eventueel vuil te verwijderen en centrifugeert u de resulterende enkellaagse celsuspensie. Resuspendeer het pellet in twee tot drie milliliter rode bloedcellysebuffer en sopping de reactie met vijf milliliter RPMI of een andere geschikte buffer na 20 tot 30 seconden.
Verzamel vervolgens de cellen met een andere centrifugatie en resuspendeer het pellet in twee milliliter splenocytmedium voor celtelling. Om de T-cellen te isoleren, centrifugeert u de cellen opnieuw en resuspendeert u het pellet in serumvrij RPMI-medium met een concentratie van een keer 10 tot de zeven cellen per milliliter. Breng de cellen over in een polystyreenbuis van vijf milliliter en zet een 100 microliter aliquot van splenocyten opzij om later te worden gebruikt voor zuiverheidsbeoordeling.
Voeg vervolgens 50 microliter per milliliter normaal rattinte naar de cellen, gevolgd door de toevoeging van 50 microliter per milliliter T-cellisolatie-antilichaamcocktail met zacht mengen. Na 10 minuten, incubeer de cellen met streptavidine geconjugeerde magnetische kralen gedurende twee en een halve minuut. Voeg vervolgens serumvrij medium toe aan de cellen voor een eindvolume van twee en een halve milliliter en plaats de buis gedurende drie minuten in een celisolatiemagneet.
Aan het einde van de incubatie, houdt u de buis in de magneet vast, giet u de supernatant in één beweging in een nieuwe polystyreenbuis. De T-cellen kunnen vervolgens worden geteld. Zaai T-cellen in een ronde bodem 96-well plate met een concentratie van 2,5 keer 10 tot de vijfde cellen per putje met 200 microliter vers splenocytmedium per putje.
Voeg recombinant interleukine 7 en CD3/CD28 magnetische kralen toe aan de juiste putjes en plaats de plaat in een celkweekincubator. 12 uur later, tritureer de celsuspensie in elke put zachtjes om eventuele kralen-celaggregaten te breken. Breng vervolgens de celsuspensies van elke put over in afzonderlijke polystyreenbuizen van vijf milliliter.
Wanneer alle cellen zijn verzameld, plaatst u elke buis met cellen gedurende vijf minuten in de scheidingsmagneet en decanteert u de supernatanten wanneer de buis nog in de magneet zit, in nieuwe polystyreenbuizen aan het einde van elke incubatie. Verzamel vervolgens de cellen door centrifugatie en resuspendeer de pellets in vers splenocytmedium met concentraties van twee keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Voor kleine molecuul hoogdoorlaatscreening, plateer 40 microliter cellen per putje in een 384-well plaat en behandel de geschikte putjes met het medicijn of de drager van uw keuze voor de gewenste behandelingsperiode in de celkweekincubator.
30 minuten voor de GFP-analyse, kleurt u de cellen met de juiste concentratie Hoechst-oplossing, verspreidt u de kleurstof grondig met zacht pipetten. Wanneer alle putjes zijn gekleurd, centrifugeert u de platen om de cellen op de bodem van de putjes te verzamelen en laat u de cellen 15 minuten bij kamertemperatuur rusten. Laad de plaat volgens de instructies van de fabrikant.
Stel vervolgens de objectieve lens in op 40X of hoger. Stel camera nummer vier in voor de UV-lamp en stel vervolgens camera nummer één in voor laser 488. Laad de plaat in het hoogdoorlaatsscreeningsysteem.
Stel vervolgens het geautomatiseerde confocale hoogdoorlaatsscreeningsysteem in om zes tot 10 velden per putje te lezen met twee opeenvolgende metingen per veld, bij 488 nanometer en UV-licht. CD3-positieve T-cellen vertegenwoordigen ongeveer 30% van een bepaalde muizenmilt, waarbij een basale GFP-expressie van 10% wordt aangetoond. Na stimulatie van het CD3/CD28 T-celreceptorkraaltje wordt een vijf- tot zesvoudige toename in het percentage GFP-expressie waargenomen.
Evenzo vertegenwoordigen CD19-positieve B-cellen 50 tot 55% van de totale splenocyten met een basale GFP-expressie vergelijkbaar met die van niet-geactiveerde T-cellen. Interessant is dat B-celreceptorstimulatie met anti-muis IgG, IgM en recombinant CD40L, slechts een onbeduidende toename in GFP-expressie veroorzaakt. Na magnetische kraalisolatie zoals zojuist is aangetoond, vertonen de geïsoleerde CD3-positieve T-cellen nog steeds een basale GFP-expressie van 10%.
CD3/CD28 kraalstimulatie induceert echter een significante opregulatie van de GFP-respons. Evenzo vertonen de gezuiverde geactiveerde B-cellen na magnetische kraalisolatie een hogere expressie van GFP in vergelijking met geactiveerde B-cellen in splenocyten. In dit representatieve experiment onthulde primaire hoogdoorlaatscreening van 4398 verbindingen verschillende activatoren en remmers van T-celactivatie.
Maar de waargenomen GFP-expressie van de gestimuleerde T-cellen, 20 keer hoger dan die gemeten voor de niet-gestimuleerde T-cellen. Dit maakt het mogelijk om een actiegebied te genereren waar de GFP-remmende verbindingen gemakkelijk kunnen worden gedetect
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe op fluorescentie gebaseerde assay die gebruik maakt van lymfocyten van een transgene muis, gericht op high-throughput screening van kleine moleculen die lymfocytenactivatie kunnen moduleren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Geneesmiddelontdekking
- Celbiologie
Achtergrond
- De assay richt zich op het identificeren van kleine moleculaire immunomodulatoren.
- Het behandelt belangrijke vragen over mechanismen van lymfocytenactivatie.
- De methode is aanpasbaar voor toepassingen in de geneesmiddelontdekking.
- Demonstratie van de procedure wordt uitgevoerd door een afgestudeerde student.
Doel van de studie
- Om een high-throughput screeningmethode voor immunomodulatoren te ontwikkelen.
- Om het begrip van lymfocytenactivatie en -remming te verbeteren.
- Om een platform te bieden voor toekomstige geneesmiddelontdekkingsinspanningen.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een op fluorescentie gebaseerde assay.
- Isolatie van lymfocyten van Nurr77 GFP transgene muizen.
- High-throughput screening van kleine moleculen.
- In vitro analyse van lymfocytenactivatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van kleine moleculen die lymfocytenfunctie moduleren.
- Aangetoond dat de assay aanpasbaar is voor geneesmiddelontdekking.
- Biedt inzichten in de mechanismen van lymfocytenactivatie.
- Een betrouwbare methode gevestigd voor toekomstige immunologische studies.
Conclusies
- De op fluorescentie gebaseerde assay is een veelbelovend hulpmiddel voor onderzoek in de immunologie.
- Het kan de ontdekking van nieuwe immunomodulerende geneesmiddelen vergemakkelijken.
- De studie draagt bij aan een dieper begrip van de lymfocytbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput phenotypic screening of lymphocyte activation using a fluorescence-based assay enables rapid identification of immunomodulatory small molecules without a predefined target hypothesis. This platform supports early-stage drug discovery in immunology and transplantation by providing quantitative, scalable readouts of T and B cell responses. The assay's adaptability and throughput position it as a critical tool for portfolio triage and mechanistic de-risking in immunomodulator pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immunomodulatory hypotheses in primary lymphocytes using functional readouts.
- Supports biological de-risking by quantifying activation and inhibition across diverse compound libraries.
- Facilitates predictive confidence in target-agnostic screening for novel immune modulators.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative GFP-based outputs for high-throughput compound evaluation.
- Ensures reproducibility and scalability through automated confocal imaging and multi-well formats.
- Prepares validated cellular systems for downstream mechanistic or secondary assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant immune pathways by modeling T and B cell activation in vitro.
- Provides continuity from phenotypic screening to in vivo validation of immunomodulatory hits.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates based on functional immune modulation profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based lymphocyte assay integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging phenotypic screening with mechanistic follow-up and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-free screening and pathway clarification in immune cell activation.
- Screening: Offers robust, quantitative readouts for high-throughput evaluation of thousands of compounds.
- Analytics: Provides GFP intensity measurements to compare activation states and identify modulators.
- Translational Research: Facilitates selection of candidates for further in vitro and in vivo immunological studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various immune cell types and compound libraries for broad portfolio application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immunomodulator discovery.
- Operational Value: Standardizes and accelerates screening workflows with scalable, reproducible outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early functional triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunomodulatory candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary lymphocyte isolation and high-content fluorescence imaging.
- Needs access to automated confocal screening platforms and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell preparation and assay conditions.
- Adaptable to different immune cell subtypes and compound libraries with protocol optimization.
- Dependent on robust cell viability and activation controls for reliable data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Generation of Splenocyte Cell Suspension from Nur77GFP Mouse Spleens
2:07
T Cell Isolation from the Splenocyte Cell Suspension
3:26
T-cell Activation and the Induction of GFP Expression
4:42
High Throughput Screening of Small Molecule
6:05
Results: T and B Cell Receptors Activation Flowcytometry Results and a Representative T Cell HTS of Smal Molecules
7:56
Conclusion
