Lokale Field fluorescentiemicroscopie: Beeldvorming van cellulaire signalen in Intact Hearts
8 maart 2017
In het hart, moleculaire gebeurtenissen coördineren van de elektrische en contractiele functie van het orgel. Een set van de lokale veld fluorescentiemicroscopie technieken hier gepresenteerde maakt de registratie van cellulaire variabelen in intacte harten. Het identificeren van mechanismen voor het definiëren van de hartfunctie is van cruciaal belang in het begrijpen hoe het hart werkt onder pathologische situaties.
Het algemene doel van deze lokale veldfluorescentiemicroscopiebeeldtechniek is om moleculaire sondes te gebruiken om intracellulaire calciumniveaus te meten, of membraanpotentialen van hartregio's die moeilijk toegankelijk zijn op het niveau van het hele hart. Deze methode kan ons helpen om belangrijke cardiovasculaire vragen te beantwoorden met betrekking tot hartstilstand en ischemie. Het grote voordeel van deze techniek is dat harteigenschappen worden gemeten vanuit cellulaire gebeurtenissen in het intacte orgaan waar de cellen elektrisch, mechanisch en metabolisch gekoppeld blijven.
Bereid eerst het horizontale Langendorff-apparaat voor. Laad vers bereide Tyrode-oplossing in de 60 milliliter spuiten en voeg alle bijbehorende slangen van de set-up toe. Verwijder eenmaal gevuld alle luchtbellen.
Breng vervolgens de geladen oplossing in evenwicht met zuivere zuurstofgas geleverd door een ondergedompelde plastic luchtsteen. Plaats vervolgens een niet-absorbeerbare chirurgische hechting om een naald. Dit zal dienen als canule om het hart te retroperfuseren wanneer het aan het apparaat is bevestigd.
Verzamel vervolgens het hart na het injecteren van heparine en het euthanaseren van het dier. Reinig eerst de borst met ethanol. De demonstratie is met een muis, maar dezelfde procedure werkt voor het oogsten van het hart van een parkiet.
Maak vervolgens met dissectiescharen een insnijding in de onderbuik en snijd vervolgens omhoog naar de nek. Snijd vervolgens voorzichtig het middenrif open, waarbij het hart wordt vermeden. Trek nu het gesneden weefsel terug en speld het vast.
Verwijder vervolgens de longen en omliggende weefsels om het hart bloot te leggen. Gebruik eenmaal blootgesteld een pincet om het hart eruit te scheppen zonder het te knijpen. Maak het los van het dier door de aorta door te snijden en laat zoveel mogelijk aorta aan het hart verbonden.
Laad vervolgens het hart in een kleine weegboot met één milliliter Tyrode-oplossing. Verwijder onder een dissectiemicroscoop snel het bloed en het vetweefsel rond het hart met pincet en schaar. Bevestig de aorta aan de horizontale aansluiting van het Langendorff-apparaat met behulp van een niet-absorbeerbare chirurgische hechting en een naald.
Beveilig de knoop met behulp van twee fijne pincetten. Begin vervolgens met de retroperfusie door de klep te openen om de Tyrode-oplossing vrij te geven. Reinig het omliggende weefsel en zuig puin weg om de horizontale kamer schoon te houden terwijl het hart zich gedurende 10 minuten stabiliseert.
Maak de kleurstof vers. Voeg voor Rhod-2 AM 20 microliter van 20% Pluronic en DMSO toe aan de 50 microgram kleurstof van de fabrikant. Meng door te pipetteren en vermijd bellen.
Breng vervolgens de vloeibare kleurstof over in een helder glazen flesje en voeg één milliliter Tyrode-oplossing toe. Los de kleurstof grondig op in dit mengsel met behulp van 15 tot 20 minuten sonicatie. Perfuseer vervolgens de bereide kleurstof met behulp van een peristaltiekpomp bij kamertemperatuur.
Laad eerst de kleurstof in de kleurstofkamer en klem vervolgens alle slangenlijnen aan de manifold vast en houd de klemmen boven de manifold om terugstroming te voorkomen. Zet vervolgens de pomp aan en sluit onmiddellijk de driewegklep onder de 60 milliliter spuit. Plaats de kleine buis die is bevestigd aan het aanzuigdeel van de pomp naast het hart om de kleurstof te laten circuleren nadat deze is geperfundeerd.
Neem een naald met een kleine diameter en prik deze door de top om de druk te verlichten. Laat het hart vervolgens 30 minuten met kleurstof perfuseren. Gedurende deze tijd is het erg belangrijk om het niveau van de kleurstof te evalueren om ervoor te zorgen dat er geen bellen in het weefsel komen, wat ischemie en weefselschade zou veroorzaken.
Na het perfunderen van de kleurstof, retroperfuseer het hart met Tyrode-oplossing. Verwijder de klem boven de manifold. Open de klep en laat het hart vervolgens 10 minuten stabiliseren.
Tijdens de retroperfusie, vul de horizontale kamer met Tyrode-oplossing en zet de Peltier-eenheid aan om de badtemperatuur op 37 graden Celsius te brengen. Om de lichtgeleider voor het experiment voor te bereiden, plaats eerst de lichtgeleider in een tweedubbele pijp. Bevestig vervolgens de pijp aan een micromanipulator.
Gebruik de micromanipulator om de lichtgeleider lichtjes tegen het oppervlak van de laterale ventrikel te drukken. Programmeer vervolgens een golfgenerator om een vierkante puls met een breedte van één milliseconde te geven. Zet een hartstimulator in om extern gesynchroniseerd te worden en verbind deze met de golfgenerator.
Bevestig aan elke van de twee stimulatoruitgangen een draad met een naald voor acupunctuur die aan het uiteinde is gesoldeerd. Bevestig twee naalden voor acupunctuur aan de top van het hart, ongeveer drie millimeter uit elkaar. Pas als de naalden zijn geplaatst, start u de stimulator, zodat u onbedoelde schokken kunt voorkomen.
Om het epicardiale signaal op te nemen, pas de acquisitiefrequentie in de software aan op 10 kilohertz. Om het endocardiale signaal te verzamelen, volg dezelfde procedure, maar gebruik een naald van 23 gauge om een gaatje te maken in de laterale ventrikel nabij het septum. Positioneer vervolgens met behulp van een micromanipulator de tweede lichtgeleider in het endocardium.
Om de transmurale functie te benaderen, werden de morfologieën van actiepotentialen vergeleken die werden opgenomen vanuit het endocardium en het epicardium. Fluorescerende opnamen werden gemaakt na behandeling van het hart met di-8-ANEPPS met behulp van de CLFFM-techniek. Het actiepotentiaal was langzamer in het endocardium, vooral in fase één.
De duur van het actiepotentiaal werd beschreven als de tijd die het actiepotentiaal nodig heeft om tot een bepaalde graad te repolariseren. Toen de duur werd genormaliseerd en verschoven om bij de nulfase te overlappen, konden ze worden vergeleken. Er was inderdaad een significant verschil tijdens fase één.
Vervolgens werd Rhod-2 AM gebruikt om intracellulair calcium te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een lokale veldfluorescentiemicroscopietechniek om intracellulaire calciumgehaltes en membraanpotentialen in het hart te meten. Deze methode maakt het mogelijk om de hartfunctie in intacte organen te onderzoeken, wat cruciaal is voor het begrijpen van aandoeningen zoals een hartstilstand en ischemie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Cardiovasculaire fysiologie
- Fluorescentiemicroscopie
- Cellulaire beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de hartfunctie is essentieel voor de aanpak van hartaandoeningen.
- Traditionele methoden bieden mogelijk geen effectieve toegang tot alle regio's van het hart.
- Lokale veldfluorescentiemicroscopie biedt een nieuwe benadering om hartcellen te bestuderen.
- Deze techniek behoudt de integriteit van de cellulaire koppeling in het hart.
Doel van de studie
- Om intracellulair calcium en membraanpotentialen in het hart te meten.
- Om mechanismen van de hartfunctie onder pathologische omstandigheden te onderzoeken.
- Om inzicht te verschaffen in cardiovasculaire incidenten zoals een hartstilstand en ischemie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van het horizontale Langendorff-apparaat.
- Vullen van spuiten met Tyrode-oplossing.
- Verwijderen van luchtbellen uit de opstelling.
- Gebruik van moleculaire probes voor metingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van cellulaire variabelen in intacte harten.
- Demonstratie van de effectiviteit van de techniek bij het bereiken van moeilijk toegankelijke regio's.
- Verworven inzichten in de elektrische en mechanische eigenschappen van hartcellen.
- Potentiële toepassingen voor het begrijpen van hartpathologieën.
Conclusies
- De techniek van lokale veldfluorescentiemicroscopie is waardevol voor cardiologisch onderzoek.
- Deze methode vergroot ons begrip van de hartfunctie bij gezondheid en ziekte.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek benutten voor diepere inzichten in de cardiovasculaire gezondheid.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Lokale veldfluorescentiemicroscopie maakt de meting van intracellulair calcium en membraanpotentialen in intacte harten mogelijk, waarbij de cellulaire koppeling behouden blijft, wat essentieel is voor het begrijpen van ischemie en aritmieën. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie door fysiologisch relevante gegevens te leveren van elektrisch en mechanisch gekoppeld weefsel, waardoor het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen wordt verbeterd. De techniek faciliteert mechanische risicoreductie door moleculaire signalen te koppelen aan de functie van het gehele orgaan in onderzoek naar cardiovasculaire aandoeningen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door calciumtransiënten en actiepotentialen te meten in intact myocardium onder fysiologische koppeling.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk in ziekterelevante systemen waar geïsoleerde celmodellen tekortschieten in het vastleggen van dynamiek op weefselniveau.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door verbindingen te identificeren die de intracellulaire calciumkinetiek in endocardiale en epicardiale regio's normaliseren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door basislijn-fluorescentiesignalen vast te stellen in geperfundeerde harten.
- Kwantitatieve output: Genereert reproduceerbare metingen van calcium-transient kinetiek en actiepotentiaalduur voor de beoordeling van het effect van verbindingen.
- Hergebruik van het platform: Ondersteunt schaalbaarheid over knaagdiermodellen via Langendorff-perfusie, waardoor consistente signaalacquisitie mogelijk is in cardiovasculaire screeningscascades.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert mechanismen van ischemie en aritmie door regionale verschillen in calciumhuishouding en repolarisatie in intacte harten te monitoren.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door electrotonische en metabole koppeling te behouden tijdens farmacologische interventie.
- Beslissingen op basis van risicoanalyse: Informeert voortgangscriteria via kwantificeerbare veranderingen in actiepotentiaal-morfologie en calciumtransiënten in ziektevast versus behandeld weefsel.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in cardiovasculaire ontdekkingsworkflows, vanaf vroege target-interrogatie tot preklinische validatie, en ondersteunt de identificatie van lead-verbindingen door fysiologisch gecontextualiseerde signaleringsgegevens te leveren.
- Discovery-biologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door compartimentspecifiek calcium (cytosolisch versus sarcoplasmatisch reticulum) en membraanpotentiaal in intact weefsel te meten.
- Screening: Levert assay-klare preparaten met stabiele fluorescentie-read-outs voor het evalueren van compound-effecten op de cardiale elektrofysiologie en calciumhuishouding.
- Analytica: Biedt kwantitatieve afhankelijke variabelen, waaronder tijd-tot-piek calciumtransiënten, actiepotentiaalduur en fasespecifieke repolarisatiemetrieken voor intergroepsvergelijking.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire metingen met de functie van het gehele orgaan, waardoor biomaker-afstemming in preklinische modellen van cardiale dysfunctie mogelijk wordt.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van cardiovasculaire risico's in verschillende therapeutische gebieden via gestandaardiseerde Langendorff-gebaseerde fluorescentiedetectie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door subcellulaire signalen te correleren met intacte orgaanfysiologie in modellen van hart- en vaatziekten.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde kleuring, perfusie en fiberoptische positionering in het Langendorff-systeem.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege elektrofysiologische en calciumhuishoudingsgebreken te identificeren voordat er kostbare fouten in een laat stadium optreden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van genormaliseerde actiepotentiaal- en calciumtransiënte kinetiek in zieke versus geredde harten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in cardiale dissectie, Langendorff-perfusie en de bereiding van fluorescente kleurstoffen (bijv. Rhod-2 AM, di-8-ANEPPS).
- Afhankelijk van een glasvezelmicroscopie-opstelling, golfgeneratoren voor stimulatie en acquisitiesystemen met een hoge frequentie (10 kHz).
- Vereist cross-functionele standaardisatie tussen teams voor fysiologie, beeldvorming en farmacologie voor signaalconsistentie.
- Omvat aanpassingen voor verschillende soorten (muis, parkiet) en ventriculaire regio's (epicardium, endocardium) bij het meten van transmurale gradiënten.
- Beperkt door de efficiëntie van de kleurstofbelading en bewegingsartefacten tijdens perfusie, die gecontroleerd moeten worden om ischemie of signaalverstoring te voorkomen.
