Acute en chronische modellen van hyperglycemie bij zebravis: een methode om de impact van hyperglycemie op neurogenese te beoordelen en de biodistributie van radiolabelde moleculen

Het algemene doel van de volgende procedure is om hersenremodellering onder hyperglykemische omstandigheden te beoordelen en om radiogemarkeerde moleculen in zebravissen te volgen. Hyperglykemie wordt gekenmerkt door een overmatige concentratie van bloedglucose. Chronische hyperglykemie kan het gevolg zijn van diabetische aandoeningen en veroorzaakt verschillende vasculaire dysfuncties, die op hun beurt klinische complicaties kunnen uitlokken, zoals myocardinfarcten, beroertes of diabetische voetzweren.

Daarnaast kan acute hyperglykemie als gevolg van stress hemorragische complicaties bij ischemische beroertes bevorderen. De zebravis is een interessant model voor het begrijpen van menselijke ziekten en hun impact op het centrale zenuwstelsel. Dit geldt in het bijzonder aangezien het brein van volwassen vissen een intense neurogene capaciteit vertoont en een uitzonderlijk vermogen tot hersenherstermechanismen heeft in vergelijking met zoogdieren; daarom vormen zebravissen een goed model voor het onderzoeken van hersenremodellering na stress onder acute en hyperglykemische omstandigheden.

Het maakt daarnaast mogelijk om de biodistributie van radioactief gemarkeerde moleculen en potentiële therapeutische agentia te onderzoeken. Alle experimenten zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Franse en Europese gemeenschapsrichtlijnen voor het gebruik van dieren in onderzoek en zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dierproeven. Vang een vis voorzichtig met een visnet.

Plaats de vis in een klein volume tricaine-anesthesie, verdund tot een eindconcentratie van 0,02% in het water. Wacht tot de vis stopt met bewegen. Verwijder de vis met een afgesneden pipet en plaats deze voorzichtig op absorberend weefselpapier om zoveel mogelijk water te verwijderen.

Weeg de vis om een injectiespuit met d-glucose voor te bereiden, bestaande uit 50 µL van 2,5 g per kilo lichaamsgewicht. Een vis van 0,6 g ontvangt bijvoorbeeld 50 µL van een 3% d-glucose PBS-oplossing. Leg de vis op zijn rug en houd deze met één hand vast.

Zet met de andere hand de naald van de spuit in de intraperitoneale holte en injecteer langzaam de d-glucose PBS-oplossing. Verwijder de naald en plaats de vis terug in het viswater. Controleer de vis totdat deze volledig is hersteld.

Hun bloedglucosespiegels worden gewoonlijk na 1 1/2 uur gemeten. Om chronische hyperglykemie na te bootsen, wordt een tank van twee liter d-glucose bereid, met een uiteindelijke concentratie van 111 millimolair. Hiervoor worden 40 gram d-glucose afgewogen en in een lege tank geplaatst.

Vul de tank met twee liter aquariumwater en plaats er maximaal zeven vissen in. Vervang de glucoseloplossing elke twee dagen om de groei van bacteriën of andere micro-organismen te voorkomen. Chronische hyperglykemie wordt bereikt door een behandeling van 14 dagen met d-glucose.

Vang een vis met een visnet en leg deze op ijs. Bedek de vis met ijs voor een snelle euthanasie. Neem de vis en droog deze af om eventuele waterdruppels te verwijderen die de bloedmonsters zouden kunnen verdunnen.

Verwijder een oog met dissectiepenzetten en wacht tot de oogholte gevuld is met bloed. Plaats een teststrip in de glucometer en steek de strip in de oogholte. Noteer de waarde van de bloedglucoseconcentratie.

Voor acute hyperglykemie induceert een intraperitoneale injectie van d-glucose een significante stijging van de bloedglucosewaarden, zoals weergegeven 1 1/2 uur na injectie. Voor chronische hyperglykemie resulteert het onderdompelen van vissen in een d-glucose-oplossing in een significante stijging van de bloedglucosewaarden, zoals weergegeven na 14 dagen behandeling. Scheid aan het einde van de procedure het lichaam van de kop met dissectiescharen en plaats de kop in 4% paraformaldehyde, verdund in PBS voor immunohistochemische experimenten.

Incubeer een nacht bij 4 °C. Alternatief kan de hersenen direct worden geëxtraheerd en ingevroren voor andere experimenten, zoals mRNA-extractie. De volgende dag worden de gefixeerde koppen gespoeld met PBS en met een naald vastgehouden onder een dissectiemicroscoop.

Het overgebleven oog wordt verwijderd en de bovenkant van de schedel wordt voorzichtig met een pincet geopend. De hersenen worden vervolgens zorgvuldig uitgenomen en in 1x PBS geplaatst. Gefixeerde hersenen worden stapsgewijs gedehydrateerd in een reeks toenemende ethanolconcentraties, gevolgd door twee baden van 30 minuten in tolueen.

De hersenen worden vervolgens in een inbedcassette geplaatst en het deksel wordt voorzichtig gesloten. Plaats de cassette in gesmolten paraffine, bij 58 tot 60 °C. Schakel tijdens het paraffine-inbedden van de hersenen de verwarmde inbedpincet in.

Plaats de cassette in een schoon paraffinebad. Haal de cassette aan het einde van de paraffinebaden eruit. Giet wat vloeibare paraffine in een mal.

Open de cassette en plaats het brein in gesmolten paraffine in de mal. Orienteer het brein met de verwarmde inclusietang. Vul de mal aan met gesmolten paraffine en laat dit uitharden op het koelgedeelte van het inbeddingsapparaat.

Om technische redenen moet het brein worden gepositioneerd volgens een anterieur-posterieure as. Snijd na het uitnemen van het paraffinblok het blok bij en fixeer het met gesmolten paraffine op een cassette, in de juiste oriëntatie om transversale doorsneden mogelijk te maken. Plaats het paraffinblok in de arm van een microtoom en maak coupes van 50 micrometer, totdat het niveau van het breinsample is bereikt.

Trim daarna het paraffineblok om een trapezevorm te verkrijgen en stel de snijdikte in op zeven micrometer. Verzamel de paraffineribbons met een fijn penseel en plaats deze op zwart papier. Snijd de paraffineribbons elke drie tot vier secties door.

Plaats een objectglas op een warmteplaat en bedek dit met gedestilleerd water. Positioneer de coupes voorzichtig op het water op het objectglas en verwarm tot 40 °C. Wanneer de paraffinebanden voldoende zijn uitgespreid, verwijder dan het water met absorberend papier.

De laatste druppels worden mechanisch verwijderd, zoals getoond. Laat het preparaat minstens twee uur drogen voordat de immunohistochemieprocedure wordt uitgevoerd zoals beschreven in het protocol. Na de immunohistochemie worden de preparaten geanalyseerd met een epifluorescentie- of confocale microscoop om de impact van hyperglykemie op de proliferatie van hersencellen te bestuderen.

De kwantificering van hersencellen wordt uitgevoerd op ten minste drie opeenvolgende coupes, of een specifiek interessegebied. Hier zijn de prolifererende cellen, overeenkomend met PCNA-positieve cellen, groen weergegeven. Zoals te zien is, induceert chronische hyperglykemie een afname van het aantal prolifererende cellen, groen gelabeld met PCNA-antilichamen, in het ventrale telencephalon, het dorsale telencephalon en de caudale hypothalamus, rondom de laterale en posteriore recess.

Als alternatief kan, om de effecten van hyperglykemie op door letsel geïnduceerde neurogenese te bestuderen, een stabwond-letsel van het telencephalon worden uitgevoerd tijdens een chronische hyperglykemische behandeling. Hiervoor wordt een vis die zeven dagen is behandeld geanestheseerd en onder een dissectiemicroscoop geplaatst. Duw een spuit met een naald van 30 gauge verticaal door de schedel, in het centrum van de rechter telencephalische hemisfeer.

Na deze procedure moet de vis voor de vereiste tijd worden teruggeplaatst in het aquarium. In dit geval kreeg de vis zeven dagen de tijd om te overleven in d-glucose water voordat deze werd geofferd. Een steekverwonding van het telencefalon reguleert de proliferatie in de beschadigde hemisfeer sterk op, zeven dagen na de laesie.

Onze gegevens tonen aan dat chronische hyperglykemie een significante afname van de herstelprocessen in de hersenen veroorzaakt, door de celproliferatie na een steekwond in het telencefalon te verminderen. Zebravissen kunnen ook worden gebruikt voor het bestuderen van de biodistributie van radiogemarkeerde moleculen. Hier hebben we besloten om het glucosemetabolisme in het organisme van de zebravis te bestuderen.

De vis moet eerst worden verdoofd en geplaatst op een weefsel dat is gedrenkt in anesthetica. De vis wordt vervolgens achter een stralingsbeschermend venster geplaatst. De spuit met 50 µL fluorodeoxyglucose wordt klaargezet.

De vis wordt op de rug gelegd en er wordt intraperitoneaal 50 µL FDG van 20 MBq geïnjecteerd. De vis wordt vervolgens op een ander weefsel geplaatst dat is gedrenkt in anesthetica. De vis wordt voorzichtig ingepakt en gepositioneerd op de arm van een PET-scanner.

De arm wordt in de PET-scan geplaatst en de beeldgevingsprocedure wordt uitgevoerd. Hier kan worden opgemerkt dat FDG niet alleen op de injectieplaats wordt gedetecteerd, maar ook in de kop van de vis, met name in de hersenen, en langs het gehele ruggenmerg. In deze studie presenteren we twee verschillende methoden voor het induceren van acute en chronische hyperglykemie bij zebravissen, en we tonen aan dat hyperglykemie de proliferatie van hersencellen bemmert onder zowel normale als door letsel geïnduceerde omstandigheden.

Concluderend kunnen zebravissen worden gebruikt als een relevant model om de schadelijke effecten van hyperglykemie in het centrale zenuwstelsel te onderzoeken. Daarnaast maakt het de beoordeling van de biodistributie van radioactief gemarkeerde moleculen via een PET-scan mogelijk.