Name: Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Leer celcyclusvisualisatie in postnatale cardiomyocyten met behulp van transgene muizen en fluorescentiemicroscopie. Deze methode onderscheidt celdeling van ploïdieveranderingen voor hartregeneratieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken S. Grünberg (Bonn, Duitsland) en P. Freitag (Bonn, Duitsland) voor hun technische assistentie.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Er is een discussie over de vraag of cardiomyocyten kunnen de celcyclus opnieuw invoeren en verdelen en na beschadiging tijdens weefsel homeostase. Waarden voor de basisomzet cardiomyocyten werden gegeven in het traject tussen 1% en 80% 1 7. Ook na een cardiale laesie, is de inductie van celcyclus-activiteit en het scheppen van nieuwe cardiomyocyten gerapporteerd in het grensgebied, met waarden tussen 0,0083% 8 en 25 - 40% 7....

De correcte identificatie van cardiomyocyt kernen en de celcyclus status van cruciaal belang voor het bepalen van de cardiale omzet en regeneratie spier. Dit geldt met name voor het gebruik van nucleaire merkers, zoals pHH3, Ki-67, of thymidine analogen, voor het identificeren celcyclusactiviteit. Aangezien de proliferatieve capaciteit van zoogdier volwassen hartspiercellen zeer klein 1, een valse identificatie van een kern voor een positieve marker proliferatie van cardiomyocyten kern kan een wezenlijk verschil in de uitkomst van een proliferatie assay maken. Bovendien cardiomyocyten zijn gevoelig voor variaties in de celcyclus, zoals endoreduplicatie en acytokinetic mitose, die resulteren in polyploïde en meerkernige cellen dan bij de celdeling. Daartoe is de interpretatie van antilichaamkleuring tegen gemeenschappelijke celcyclus markers is niet beslissend in alle gevallen. Hier presenteren we methoden voor de straight-forwa<html> rd erkenning van de muis hartspiercellen en hun nucleariteit in de moedertaal geïsoleerde cellen en dikke weefselcoupes bij postnatale en volwassen stadia door de ondubbelzinnige identificatie van hun kernen. Daartoe een transgene muis lijn cardiomyocyt- specifieke expressie van een fusieproteïne bestaande uit humaan histon H2B en mCherry onder controle van de promoter Myh6 (Myh6-H2B-MCH) werd 2. Kruisen deze muis lijn met een transgene proliferatie indicator muizenlijn, waarin de expressie van een eGFP-anillin fusie-eiwit onder controle van de alomtegenwoordige kip actine promoter een CMV enhancer (CAG-eGFP-anillin), maakt de bepaling van de status van celcyclus. De steiger anillin proteïne specifiek tot expressie gebracht in celcyclus actieve cellen 3 en het differentieel subcellulaire lokalisatie tijdens de celcyclus maakt live tracering celcyclusprogressie met een hoge resolutie van de M-faseef &quot;&gt; 4. Derhalve dubbele transgene muizen kunnen worden gebruikt om te discrimineren tussen prolifererende hartspiercellen en die celcyclus variaties ondergaan. Dit bewijst vooral nuttig bij het screenen op proliferatie-inducerende stoffen in vitro.

<table><tbody><tr><td>10 cm Petri dish</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;m cell strainer</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; injection cannula, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>20 gauge needle</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-butane</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde solution</td><td>AppliChem GmbH&nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>3-way stopcock</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL syringe</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area</td><td>Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryostat CM 3050S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>donkey serum</td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>PromoCell, Heidelberg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution (4%)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine from porcine skin, Type A</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslips</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberger extension tube</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond microscope slides</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp;mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringe</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&rsquo;s ModifiedDulbecco&rsquo;s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml;sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG Cy5 (donkey)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tube</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini shaker</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Mold</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide 8-well ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>negative control(scrambled RNA)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal Heart Dissociation Kit</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml;sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non essential amino acids, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO&reg;, antifading</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>sample containers</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>software NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 iodide (642/661)</td><td>Molecular probes/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled</td><td>Vector Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-actinin antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van celcyclus variaties en bepaling van nucleatie in postnatale cardiomyocytes

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocyten zijn vatbaar voor variaties in de celcyclus, zoals endoreduplicatie (doorgaande rondes van DNA-synthese zonder karyokinese en cytokinese) en acytokinische mitose (karyokinese maar geen cytokinese). Dergelijke atypische celcyclusvariaties resulteren in polyploïde en multinucleaire cellen in plaats van celdeling. Daarom is het van cruciaal belang om cardiomyocyt-kernen, het aantal kernen per cel en hun celcyclusstatus correct te identificeren om cardiale vernieuwing en regeneratie te bepalen. Dit geldt vooral voor het gebruik van nucleaire markeringen voor het identificeren van celcyclusactiviteit, zoals thymidine-analogen Ki-67, PCNA of pHH3. Hier presenteren we methoden voor het herkennen van cardiomyocyten en hun nucleaire status en voor het bepalen van hun celcyclusactiviteit. We gebruiken twee gepubliceerde transgene systemen: de Myh6-H2B-mCh transgene muislijn, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocyt-kernen, en de CAG-eGFP-anillin muislijn, voor het onderscheiden van celdeling van celcyclusvariaties. Gecombineerd vergemakkelijken deze twee systemen het onderzoek naar cardiale regeneratie en plasticiteit.

Om de effecten van siRNAs / miRNAs de celcyclusactiviteit postnatale cardiomyocyten in vitro cardiomyocyten van dubbel transgene Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin muizen te analyseren werden geïsoleerd op postnatale dag 3 (P3) en getransfecteerd met celcyclus activiteit-inducerende miR199 5, siRNA p27 en siRNA Fzr1. In vergelijking met de negatieve controle (Figuur 1A), de Foto miR199- (figuur 1B) en p27- siRNA (fig...

Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Het algemene doel van deze procedure is om de celcyclusactiviteit in postnatale cardiomyocyten te visualiseren en hun nucleariteit te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van hartregeneratie, zoals of een cardiomyocyt daadwerkelijk deelt, of dat deze enkel zijn ploidie verhoogt of meerkernig wordt. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de M-fase van de celcyclus met een hoge spatiotemporele resolutie kan worden gevisualiseerd en dat cardiomyocytenkernen via fluorescentie kunnen worden geïdentificeerd.Patricia Freitag, een technicus uit ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Indien niet-homozygote fokparen worden gebruikt, identificeer dan eerst de transgene harten via fluorescentiemicroscopie om de expressie van EGFP analine en H2B-mCherry te controleren. EGFP-analine nucleaire signalen kunnen het eenvoudigst worden gedetecteerd aan de randen van de atria door door de weefsellagen heen te focussen.Om de cardiomyocyten te isoleren, plaatst u het juiste aantal harten in reactiebuisjes van 1,5 milliliter die één milliliter enzymmix uit een neonatale hartdissociatiekit bevatten en knipt u de harten met een schaar in kleine stukjes. Draag de oplossing vervolgens over naar reactiebuisjes van 15 milliliter. Plaats de buis in een bijna horizontale positie bij 37 °C gedurende 15 minuten en meng het weefsel aan het einde van de incubatie vijf tot 10 keer met een pipette van vijf milliliter.Stop na de derde digestie de reactie met 7,5 milliliters medium twee en filter de cel-suspensie door een 70 micron cell strainer. Spoel de cell strainer af met drie milliliters medium twee, voeg dit spoelwater toe aan de verzamelde cellen en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Resuspendeer de pellet in 500 microliters medium één voor het tellen.Zaai vervolgens 1 x 10⁴ cellen per put in 120 µL medium één in een 96-well plaat met een vlakke bodem en centrifugeer de cellen voordat ze gedurende de nacht in een celkweekincubator worden gekweekt. De volgende dag zouden de meeste cardiomyocyten moeten kloppen. Veeg voor aanvang van de transfectie de werkbank en alle transfectiematerialen af met een RNAse-decontaminatieoplossing om eventuele RNAse te verwijderen.Wanneer alle materialen gereed zijn, voegt u 20 µL vers bereide siRNA-mix toe aan elke put en plaatst u de cellen gedurende 48 uur terug in de incubator. Vervang na twee dagen het supernatant in elke put door 120 µL medium één en plaatst u de cellen voor nog eens ten minste 24 uur terug in de incubator. Was aan het einde van de incubatie de cellen één keer met PBS, gevolgd door fixatie in een 4% formaldehydeoplossing gedurende 20 minuten.Om de cellen via confocale videomicroscopie te analyseren, plaatst u de plaat op de tafel van de confocale microscoop en start u de beeldvormingssoftware. Open de A1plus-instellingen en vink de vakjes voor kanaal één, twee, drie en vier aan. Stel in het uitklapmenu kanaal één in op DAPI, kanaal twee op eGFP, kanaal drie op RFP en kanaal vier op Cy5.Klik op de kanaalspanning en gebruik de schuifregelaars om de spanning voor elk kanaal op 80 in te stellen. Gebruik de schuifregelaars om de offset op nul te zetten en klik op de home-knop om het pinhole in de home-positie te zetten. Stel de scanmaat in het uitklapmenu in op 1024 bij 1024 pixels.Klik op optimize om het instelvenster voor de XYZ-grootte te openen en vink het vakje perfect voxel aan onder de voorgestelde stap Z. Selecteer het 20x objectief en pas de laserintensiteiten aan tot de afbeelding noch onder- noch overbelicht is. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, opent u het menu acquire. Selecteer scan large image en kies vervolgens current position is at top left corner onder area.Stel vervolgens het aantal velden in X en Y in op drie bij drie en klik op scannen. Om het aantal cardiomyocytekernen te bepalen, klikt u op meten, handmatige meting en tellingen. Selecteer de kernen met H2B-mCherry-signalen, waardoor ze worden gemarkeerd en geteld.Select vervolgens de alpha-actinine-positieve cellen om het aantal cardiomyocyten te bepalen. Om de cardiomyocyten in de G1-, S- en G2-fase met nucleaire EGFP-analin-signalen te tellen, selecteert u measure, manual measurement en counts. Markeer de nuclei die EGFP-analin en H2B-mCherry tot expressie brengen door erop te klikken en tel handmatig de cardiomyocyten met mitose-specifieke EGFP-analin-signalen, zoals contractiele ringen en mid-bodies.Klik vervolgens op measure, manual measurement en counts, en selecteer de cardiomyocyten met mitose-specifieke EGFP analin-signalen, cytoplasmatische signalen, contractie-ringen en mid-bodies. In vergelijking met de negatieve controles vertonen de met miRNA en siRNA getransfecteerde cardiomyocyten een inductie van celcyclusactiviteit. Cardiomyocyten die endoreduplicatie ondergaan, vertonen een exclusief nucleaire EGFP analin-expressie, terwijl cardiomyocyten die celdeling ondergaan, EGFP analin-expressie vertonen op de typische lokalisaties van de M-fase.Na enzymatische digestie van het hartweefsel in het Langendorff-apparaat kunnen de atria en ventrikels mechanisch worden gescheiden en onafhankelijk worden geanalyseerd, waardoor de visualisatie van H2B-mCherry transgene ventriculaire cardiomyocyten mogelijk is met een hoog aantal H2B-mCherry positieve bi-nucleaire cardiomyocyten. In tegenstelling hiermee zijn de meeste atriale cardiomyocyten mono-nucleair. Enzymatische digestie resulteert niet in een populatie van 100% enkelvoudige cellen; een patroon van dwarsstriatie door kleuring met alfa-actinine vergemakkelijkt verder het onderscheid tussen bi-nucleaire cardiomyocyten, gekenmerkt door een continu patroon van dwarsstriatie, en celdoubletten.Om de bi-nucleatie-index van cardiomyocyten in dikke coupes te analyseren, is het noodzakelijk om handmatig door de stack te scrollen, aangezien de kernen niet noodzakelijkerwijs in één Z-vlak liggen, waarbij kleuring met wheat germ agglutinine de detectie van de celgrenzen mogelijk maakt. 3D-reconstructies van gefixeerde coupes van adult transgene muizenharten maken de detectie en geautomatiseerde telling van hooks, gekleurde en H2B-mCherry-positieve kernen mogelijk om de proportie cardiomyocytkernen onder fysiologische omstandigheden binnen het weefsel te bepalen. Zodra de techniek onder de knie is, kan de dissociatie van het hart in twee tot drie uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om continu door te werken om de levensvatbaarheid van de cellen gedurende het hele experiment te behouden. Na deze procedure is het mogelijk om microRNA's of andere kleine stoffen te screenen op hun proliferatie-inducerende effecten in postnatale cardiomyocyten.

visualization-cell-cycle-variations-determination-nucleation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Cardiale kernen worden geïsoleerd via dichtheid sedimentatie en immunolabeled met antilichamen tegen pericentriolar materiaal 1 (PCM-1) te identificeren en cardiomyocyten kernen sorteren op flowcytometrie.

Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

Mutaties die leiden tot aangeboren hartafwijkingen profiteren van in vivo onderzoek van de hartstructuur tijdens de ontwikkeling, maar hoogwaardige structurele studies in het embryonale muishart zijn technisch uitdagend. Hier presenteren we een robuuste immunofluorescentie- en beeldanalysemethode om cardiomyocyt-specifieke structuren in het zich ontwikkelende muishart te beoordelen.

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

Het kwantificeren van cardiomyocytenvernieuwing is een uitdaging. Het hier beschreven protocol levert een belangrijke bijdrage aan deze uitdaging door nauwkeurige en gevoelige kwantificering van neo-cardiomyocytkerngeneratie en kern-ploïdie mogelijk te maken.

Gelijktijdig Beoordeling van Cardiomyocyte DNA Synthese en Ploïdie: een methode om Assist Kwantificering van Cardiomyocyte Regeneration en Omzet

We beschrijven een protocol voor het volumetrisch afbeelden van met fluorescente eiwitten gelabelde cellen diep in intacte embryonale en postnatale harten. Door gebruik te maken van weefselklaringsmethoden in combinatie met gehele montagekleuring, kunnen enkele met fluorescente eiwitten gelabelde cellen in een embryonaal of postnataal hart duidelijk en nauwkeurig worden afgebeeld.

Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution

Gebruikelijke werkwijzen tot inleiding suspensie geaggregeerde basis cardiale differentiatie van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) geplaagd cultuur heterogeniteit met betrekking tot de totale grootte en vorm. Hier beschrijven we een robuuste methode voor cardiale differentiatie gebruik microputjes genereren maat gecontroleerde HPSC aggregaten gekweekt onder omstandigheden cardiale bevorderen.

Aggregate Size Optimization in Microputjes voor Suspension basis Cardiac Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs protocol voor het genereren en kwantificeren van diverse geherprogrammeerde hartsubtypen met behulp van een retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Het doel van dit werk is het ontwikkelen van een methode om cardiomyocyten reproduceerbaar te isoleren van het volwassen hart en het DNA-gehalte en nucleatie te meten.

Isolatie van Cardiomyocyten uit vaste harten voor immunocytochemie en ploidy-analyse

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) bieden een alternatief voor het gebruik van dieren voor preklinische cardiotoxiciteitsscreening. Een beperking voor de wijdverbreide toepassing van hiPSC-CMs in preklinische toxiciteitsscreening is het onrijpe, foetale fenotype van de cellen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor robuuste en snelle rijping van hiPSC-CMs.

High-throughput cardiotoxiciteitsscreening met behulp van volwassen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenmonolagen

Leer celcyclusvisualisatie in postnatale cardiomyocyten met behulp van transgene muizen en fluorescentiemicroscopie. Deze methode onderscheidt celdeling van ploïdieveranderingen voor hartregeneratieonderzoek.

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

Meer video's verkennen