Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes
February 24th, 2017
Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.
Het algemene doel van deze procedure is om de celcyclusactiviteit in postnatale cardiomyocyten te visualiseren en hun nucleaire status te bepalen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van cardiale regeneratie te beantwoorden, zoals of een cardiomyocyt echt deelt of dat het alleen zijn ploidie verhoogt of multinucleair wordt. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de M-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met een hoge spatiële en temporele resolutie en dat cardiomyocytenkernen kunnen worden geïdentificeerd door middel van fluorescentie.
Patricia Freitag, een technicus van ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Als niet-homozygote kweekparen worden gebruikt, identificeer dan eerst de transgene harten via fluorescentiemicroscopie om hun EGFP analin en H2B-mCherry expressie te controleren. EGFP analyin nucleaire signalen kunnen het gemakkelijkst worden gedetecteerd aan de randen van de atria door te focussen door zijn weefsellagen heen.
Om de cardiomyocyten te isoleren, plaatst u het juiste aantal harten in 1,5 milliliter reactiebuizen met één milliliter enzymmix van een nieuwgeboren hartdissociatiekit en snijdt de harten in kleine stukken met een schaar. Breng vervolgens de oplossing over in 15 milliliter reactiebuizen. Plaats de buis in een bijna horizontale positie op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten, en meng het weefsel vijf tot 10 keer met een vijf milliliter pipet aan het einde van de incubatie.
Aan het einde van de derde spijsvertering, stopt u de reactie met 7,5 milliliter medium twee en filtert u de celsuspensie door een 70 micron celzeef. Spoel de celzeef af met drie milliliter medium twee, verzamel het waswater bij de verzamelde cellen en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Re-suspendeer het pellet in 500 microliter medium één voor het tellen.
Zaai vervolgens één keer tien tot de vierde cellen per put in 120 microliter medium één in een 96-puts vlakbodemplaat en centrifugeer de cellen voor hun overnachtelijke cultuur in een celcultuurincubator. De volgende dag zouden de meeste cardiomyocyten moeten kloppen. Veeg voor het beginnen van de transfectie het werkblad en al het transfectiemateriaal af met RNAse decontaminatieoplossing om eventuele RNAse te verwijderen.
Wanneer alle materialen klaar zijn, voegt u 20 microliter versbereide siRNA-mix toe aan elke put en plaats de cellen terug in de incubator gedurende 48 uur. Na twee dagen, vervangt u het supernatant in elke put met 120 microliter medium één en plaats de cellen terug in de incubator voor minstens nog eens 24 uur. Aan het einde van de incubatie, was de cellen één keer met PBS, gevolgd door fixatie in 4% formaldehydeoplossing gedurende 20 minuten.
Om de cellen te analyseren door confocale videomicroscopie, brengt u de plaat over naar het confocale microscooptafel en start u de beeldvormingssoftware. Open de A1plus-instellingen en controleer de kanalen één, twee, drie en vier. In het uitklapmenu, stelt u kanaal één in op DAPI, kanaal twee op eGFP, kanaal drie op RFP en kanaal vier op Cy5.
Klik op het kanaalvoltage en gebruik de schuifbalken om de spanning voor elk kanaal op 80 te zetten. Gebruik de schuifbalken om de offset op nul te zetten en klik op de home-knop om de pin-gate naar de startpositie te zetten. Stel de scangrootte in op 1024 bij 1024 pixels in het uitklapmenu.
Klik op optimaliseren om het XYZ-grootte-instellingsvenster te openen en controleer het perfecte voxel-vakje onder de voorgestelde stap Z. Selecteer het 20x objectief en pas de laserintensiteiten aan totdat de afbeelding noch onder- noch overbelicht is. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, opent u het verwerven-menu. Selecteer scan grote afbeelding en kies vervolgens huidige positie is in de linkerbovenhoek onder gebied.
Stel vervolgens het aantal velden in X en Y in op drie bij drie en klik op scan. Om het aantal cardiomyocytenkernen te definiëren, klikt u op meten, handmatige meting en telt. Selecteer de kernen met H2B-mCherry signalen, waardoor ze worden gemarkeerd en geteld.
Selecteer vervolgens de alfa-actinine positieve cellen om het aantal cardiomyocyten te bepalen. Om de G1, S, G2 fase cardiomyocyten met nucleaire EGFP analin signalen te tellen, selecteert u meten, handmatige meting en telt. Markeer de EGFP analin en H2B-mCherry expresserende kernen door te klikken en tel de cardiomyocyten met de mitose-specifieke EGFP analin signalen zoals contractiele ringen en mid-bodies handmatig.
Klik vervolgens op meten, handmatige meting en telt en klik op de cardiomyocyten met mitose-specifieke EGFP analin signalen, cytoplasmatische signalen, contractiele ringen en mid-bodies. Vergeleken met de negatieve controles, tonen de miRNA en siRNA getransfecteerde cardiomyocyten een inductie van celcyclusactiviteit. Cardiomyocyten die endo-reduplicatie uitvoeren, vertonen een exclusief nucleaire EGFP analin expressie, terwijl cardiomyocyten die een celdeling ondergaan EGFP analin expressie vertonen in typische lokalisaties in de M-fase.
Na enzymatische spijsvertering van het hartweefsel in het Langendorff-apparaat, kunnen de atria en ventrikels mechanisch worden gescheiden en onafhankelijk worden geanalyseerd, waardoor de visualisatie van H2B-mCherry transgene ventrikelcardiomyocyten met een hoog aantal H2B-mCherry positieve binucleaire cardiomyocyten mogelijk wordt. In tegenstelling hiermee zijn de meeste atriale cardiomyocyten mononucleair. Enzymatische spijsvertering resulteert niet in een 100% single-celpopulatie, wat een patroon van dwarsstrepen door alpha-actininekleuring onthult, wat verder de discriminatie vergemakkelijkt tussen binucleaire cardiomyocyten als een continu patroon van dwarsstrepen en cel-doubletten.
Om de binucleaire index van cardiomyocyten in dikke plakken te analyseren, is het noodzakelijk om handmatig door de stapel te scrollen, aangezien de kernen zich niet noodzakelijkerwijs binnen één Z-vlak bevinden, met wheat germ agglutininekleuring die de detectie van de celgrenzen mogelijk maakt. 3D-reconstructies van vaste plakken van volwassen transgene muisharten maken de detectie en geautomatiseerde telling van haken, gekleurde en H2B-mCherry positieve kernen mogelijk om de verhouding van cardiomyocytenkernen onder fysiologische om
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus van cardiomyocyten met behulp van transgene muislijnen. De methoden maken een hoge resolutie visualisatie van cardiomyocytkernen en M-fase activiteit mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cardiovasculaire biologie
- Celbiologie
- Regeneratieve geneeskunde
Achtergrond
- Het begrijpen van cardiomyocytgedrag is cruciaal voor hartregeneratie.
- Cardiomyocyten kunnen hun ploidie verhogen of meervoudig genucleeerd worden zonder te delen.
- Transgene muismodellen bieden tools voor het bestuderen van deze processen.
- Fluorescentiemicroscopie helpt bij het identificeren van specifieke cellulaire activiteiten.
Doel van de studie
- Om celcyclusactiviteit in postnataal cardiomyocyten te visualiseren.
- Om de genucleairheid van cardiomyocyten te bepalen.
- Om te verduidelijken of cardiomyocyten delen of ploidie veranderingen ondergaan.
Gebruikte methoden
- Gebruik van Myh6-H2B-mCh en CAG-eGFP-anillin transgene muizen.
- Fluorescentiemicroscopie voor het identificeren van cardiomyocytkernen.
- Hoge spatie-temporele resolutie beeldvorming van de M-fase van de celcyclus.
- Identificatie van transgene harten vóór analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van cardiomyocytkernen met behulp van fluorescentie.
- Duidelijke onderscheiding tussen celdeling en celcyclusvariaties.
- Identificatie van EGFP anillin nucleaire signalen in atriumweefsel.
- Verbeterd begrip van cardiomyocytgedrag in regeneratie.
Conclusies
- De protocollen bieden een betrouwbare methode voor het bestuderen van cardiomyocytdeling.
- Fluorescentiemarkeringen zijn effectief in het identificeren van cellulaire processen.
- Dit onderzoek draagt bij aan het veld van hartregeneratie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of cardiomyocyte proliferation versus polyploidization is critical for evaluating cardiac regeneration strategies in preclinical models. Misinterpretation of nuclear markers can lead to overestimation of true mitotic activity, impacting target validation and lead identification efforts. This method provides a mechanistic de-risking approach by distinguishing bona fide cell division from endoreduplication or acytokinetic mitosis, thereby improving predictive confidence in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding cardiomyocyte proliferation by distinguishing true mitosis from DNA synthesis without cytokinesis.
- Operational Value: Uses fluorescent nuclear and mitotic markers to reduce ambiguity in cell cycle status assessment.
- Predictive Value: Supports target de-risking by clarifying whether a compound induces hyperplasia versus hypertrophic growth via ploidy increase.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable nuclear and mitotic signals compatible with high-content imaging for compound screening.
- Reproducibility: Standardized transgenic reporter systems allow consistent detection of cardiomyocyte nuclei and M-phase events across experiments.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats and enzymatic dissociation workflows for medium-throughput screening of miRNAs or small molecules.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to postnatal cardiomyocyte models used in regenerative medicine target validation.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to tissue-level analysis via 3D reconstruction and automated nuclear counting in thick slices.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables differentiation between pro-proliferative and polyploidizing effects, informing go/no-go criteria in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for compounds modulating cardiomyocyte cell cycle dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing M-phase activity and nuclearity to clarify mechanisms of action.
- Screening: Enables assay standardization through fluorescent reporters, facilitating reliable compound evaluation in microtiter plates.
- Analytics: Provides quantitative readouts such as nuclei count per cell, mitotic index, and binucleation rate for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects cellular observations to tissue architecture via confocal z-stacking and border detection using wheat germ agglutinin.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing cardiac regenerative potential across multiple compound classes and genetic models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing false-positive proliferation signals from endoreduplication or acytokinetic mitosis.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized transgenic markers and defined imaging parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier identification of compounds with genuine hyperplastic activity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by distinguishing mechanistic classes of cardiomyocyte response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, transgenic animal handling, and cardiomyocyte isolation techniques.
- Dependent on access to Myh6-H2B-mCh and CAG-eGFP-anillin mouse lines or equivalent dual-reporter systems.
- Necessitates standardized enzymatic digestion and plating procedures to maintain cell viability and staining fidelity.
- Involves manual measurement steps for nuclei and mitotic event counting, which may require inter-operator training for consistency.
- Limited by tissue accessibility and signal penetration in thick slices, necessitating optical clearing or sectioning for deep tissue analysis.
