Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes
24 februari 2017
Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.
Het algemene doel van deze procedure is om de celcyclusactiviteit in postnatale cardiomyocyten te visualiseren en hun nucleariteit te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van hartregeneratie, zoals of een cardiomyocyt daadwerkelijk deelt, of dat deze enkel zijn ploidie verhoogt of meerkernig wordt. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de M-fase van de celcyclus met een hoge spatiotemporele resolutie kan worden gevisualiseerd en dat cardiomyocytenkernen via fluorescentie kunnen worden geïdentificeerd.
Patricia Freitag, een technicus uit ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Indien niet-homozygote fokparen worden gebruikt, identificeer dan eerst de transgene harten via fluorescentiemicroscopie om de expressie van EGFP analine en H2B-mCherry te controleren. EGFP-analine nucleaire signalen kunnen het eenvoudigst worden gedetecteerd aan de randen van de atria door door de weefsellagen heen te focussen.
Om de cardiomyocyten te isoleren, plaatst u het juiste aantal harten in reactiebuisjes van 1,5 milliliter die één milliliter enzymmix uit een neonatale hartdissociatiekit bevatten en knipt u de harten met een schaar in kleine stukjes. Draag de oplossing vervolgens over naar reactiebuisjes van 15 milliliter. Plaats de buis in een bijna horizontale positie bij 37 °C gedurende 15 minuten en meng het weefsel aan het einde van de incubatie vijf tot 10 keer met een pipette van vijf milliliter.
Stop na de derde digestie de reactie met 7,5 milliliters medium twee en filter de cel-suspensie door een 70 micron cell strainer. Spoel de cell strainer af met drie milliliters medium twee, voeg dit spoelwater toe aan de verzamelde cellen en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Resuspendeer de pellet in 500 microliters medium één voor het tellen.
Zaai vervolgens 1 x 10⁴ cellen per put in 120 µL medium één in een 96-well plaat met een vlakke bodem en centrifugeer de cellen voordat ze gedurende de nacht in een celkweekincubator worden gekweekt. De volgende dag zouden de meeste cardiomyocyten moeten kloppen. Veeg voor aanvang van de transfectie de werkbank en alle transfectiematerialen af met een RNAse-decontaminatieoplossing om eventuele RNAse te verwijderen.
Wanneer alle materialen gereed zijn, voegt u 20 µL vers bereide siRNA-mix toe aan elke put en plaatst u de cellen gedurende 48 uur terug in de incubator. Vervang na twee dagen het supernatant in elke put door 120 µL medium één en plaatst u de cellen voor nog eens ten minste 24 uur terug in de incubator. Was aan het einde van de incubatie de cellen één keer met PBS, gevolgd door fixatie in een 4% formaldehydeoplossing gedurende 20 minuten.
Om de cellen via confocale videomicroscopie te analyseren, plaatst u de plaat op de tafel van de confocale microscoop en start u de beeldvormingssoftware. Open de A1plus-instellingen en vink de vakjes voor kanaal één, twee, drie en vier aan. Stel in het uitklapmenu kanaal één in op DAPI, kanaal twee op eGFP, kanaal drie op RFP en kanaal vier op Cy5.
Klik op de kanaalspanning en gebruik de schuifregelaars om de spanning voor elk kanaal op 80 in te stellen. Gebruik de schuifregelaars om de offset op nul te zetten en klik op de home-knop om het pinhole in de home-positie te zetten. Stel de scanmaat in het uitklapmenu in op 1024 bij 1024 pixels.
Klik op optimize om het instelvenster voor de XYZ-grootte te openen en vink het vakje perfect voxel aan onder de voorgestelde stap Z. Selecteer het 20x objectief en pas de laserintensiteiten aan tot de afbeelding noch onder- noch overbelicht is. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, opent u het menu acquire. Selecteer scan large image en kies vervolgens current position is at top left corner onder area.
Stel vervolgens het aantal velden in X en Y in op drie bij drie en klik op scannen. Om het aantal cardiomyocytekernen te bepalen, klikt u op meten, handmatige meting en tellingen. Selecteer de kernen met H2B-mCherry-signalen, waardoor ze worden gemarkeerd en geteld.
Select vervolgens de alpha-actinine-positieve cellen om het aantal cardiomyocyten te bepalen. Om de cardiomyocyten in de G1-, S- en G2-fase met nucleaire EGFP-analin-signalen te tellen, selecteert u measure, manual measurement en counts. Markeer de nuclei die EGFP-analin en H2B-mCherry tot expressie brengen door erop te klikken en tel handmatig de cardiomyocyten met mitose-specifieke EGFP-analin-signalen, zoals contractiele ringen en mid-bodies.
Klik vervolgens op measure, manual measurement en counts, en selecteer de cardiomyocyten met mitose-specifieke EGFP analin-signalen, cytoplasmatische signalen, contractie-ringen en mid-bodies. In vergelijking met de negatieve controles vertonen de met miRNA en siRNA getransfecteerde cardiomyocyten een inductie van celcyclusactiviteit. Cardiomyocyten die endoreduplicatie ondergaan, vertonen een exclusief nucleaire EGFP analin-expressie, terwijl cardiomyocyten die celdeling ondergaan, EGFP analin-expressie vertonen op de typische lokalisaties van de M-fase.
Na enzymatische digestie van het hartweefsel in het Langendorff-apparaat kunnen de atria en ventrikels mechanisch worden gescheiden en onafhankelijk worden geanalyseerd, waardoor de visualisatie van H2B-mCherry transgene ventriculaire cardiomyocyten mogelijk is met een hoog aantal H2B-mCherry positieve bi-nucleaire cardiomyocyten. In tegenstelling hiermee zijn de meeste atriale cardiomyocyten mono-nucleair. Enzymatische digestie resulteert niet in een populatie van 100% enkelvoudige cellen; een patroon van dwarsstriatie door kleuring met alfa-actinine vergemakkelijkt verder het onderscheid tussen bi-nucleaire cardiomyocyten, gekenmerkt door een continu patroon van dwarsstriatie, en celdoubletten.
Om de bi-nucleatie-index van cardiomyocyten in dikke coupes te analyseren, is het noodzakelijk om handmatig door de stack te scrollen, aangezien de kernen niet noodzakelijkerwijs in één Z-vlak liggen, waarbij kleuring met wheat germ agglutinine de detectie van de celgrenzen mogelijk maakt. 3D-reconstructies van gefixeerde coupes van adult transgene muizenharten maken de detectie en geautomatiseerde telling van hooks, gekleurde en H2B-mCherry-positieve kernen mogelijk om de proportie cardiomyocytkernen onder fysiologische omstandigheden binnen het weefsel te bepalen. Zodra de techniek onder de knie is, kan de dissociatie van het hart in twee tot drie uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om continu door te werken om de levensvatbaarheid van de cellen gedurende het hele experiment te behouden. Na deze procedure is het mogelijk om microRNA's of andere kleine stoffen te screenen op hun proliferatie-inducerende effecten in postnatale cardiomyocyten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus van cardiomyocyten met behulp van transgene muizenlijnen. De methoden maken een visualisatie met hoge resolutie van cardiomyocytenkernen en M-fase-activiteit mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cardiovasculaire biologie
- Celbiologie
- Regeneratieve geneeskunde
Achtergrond
- Het begrijpen van het gedrag van cardiomyocyten is cruciaal voor cardiale regeneratie.
- Cardiomyocyten kunnen de ploidie verhogen of meerkernig worden zonder zich te delen.
- Transgene muismodellen bieden instrumenten om deze processen te bestuderen.
- Fluorescentiemicroscopie helpt bij het identificeren van specifieke cellulaire activiteiten.
Doel van de studie
- Om de celcyclusactiviteit in postnatale cardiomyocyten te visualiseren.
- Om de nucleariteit van cardiomyocyten te bepalen.
- Om te verduidelijken of cardiomyocyten delen of ploidie-veranderingen ondergaan.
Gebruikte methoden
- Gebruik van Myh6-H2B-mCh en CAG-eGFP-anillin transgene muizen.
- Fluorescentiemicroscopie voor het identificeren van cardiomyocytekernen.
- Beeldvorming met hoge spatiotemporele resolutie van de M-fase van de celcyclus.
- Identificatie van transgene harten voorafgaand aan de analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van cardiomyocytekernen met behulp van fluorescentie.
- Duidelijk onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.
- Identificatie van EGFP-anillin nucleaire signalen in atriumweefsel.
- Verbeterd inzicht in het gedrag van cardiomyocyten bij regeneratie.
Conclusies
- De protocollen bieden een betrouwbare methode voor het bestuderen van de deling van cardiomyocyten.
- Fluorescente markers zijn effectief bij het identificeren van cellulaire processen.
- Dit onderzoek draagt bij aan het vakgebied van cardiale regeneratie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Een nauwkeurige beoordeling van cardiomyocyte-proliferatie versus polyploïdisatie is essentieel voor het evalueren van strategieën voor cardiac regeneratie in preklinische modellen. Een verkeerde interpretatie van nucleaire markers kan leiden tot een overschatting van de werkelijke mitotische activiteit, wat de validatie van targets en de inspanningen voor lead-identificatie beïnvloedt. Deze methode biedt een mechanistische benadering voor risicoreductie door bona fide celdeling te onderscheiden van endoreduplicatie of acytokinetische mitose, waardoor het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen over cardiomyocytproliferatie te onderzoeken door echte mitose te onderscheiden van DNA-synthese zonder cytokinesis.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van fluorescente nucleaire en mitotische markers om ambiguïteit bij de beoordeling van de status van de celcyclus te verminderen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het beperken van risico's bij targets door te verduidelijken of een verbinding hyperplasie induceert versus hypertrofische groei via een toename van de ploidie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert kwantificeerbare nucleaire en mitotische signalen die compatibel zijn met high-content imaging voor compound-screening.
- Reproduceerbaarheid: Gestandaardiseerde transgene reporter-systemen maken consistente detectie van cardiomyocytenkernen en M-fasegebeurtenissen over verschillende experimenten mogelijk.
- Schaalbaarheid: Compatibel met 96-wells plaatformaten en enzymatische dissociatieworkflows voor medium-throughput screening van miRNA's of kleine moleculen.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Direct toepasbaar op postnatale cardiomyocytenmodellen die worden gebruikt voor de validatie van doelwitten in de regeneratieve geneeskunde.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en analyse op weefselniveau via 3D-reconstructie en geautomatiseerde kerntelling in dikke coupes.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Maakt onderscheid mogelijk tussen pro-proliferatieve en polyploïdiserende effecten, wat bijdraagt aan de go/no-go-criteria in de preklinische fase.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische beoordeling, in het bijzonder voor verbindingen die de dynamiek van de celcyclus van cardiomyocyten moduleren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door M-fase-activiteit en nucleariteit te visualiseren om werkingsmechanismen te verduidelijken.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via fluorescente reporters, wat betrouwbare evaluatie van verbindingen in microtiterplaten faciliteert.
- Analytics: Biedt kwantitatieve read-outs zoals het aantal kernen per cel, de mitotische index en de binucleatiesnelheid voor comparatieve analyse van condities.
- Translational Research: Verbindt cellulaire observaties met weefselarchitectuur via confocale z-stacking en grensdetectie met behulp van tarwekiemagglutinine.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van het cardiale regeneratieve potentieel over meerdere klassen van verbindingen en genetische modellen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door het verminderen van fout-positieve proliferatiesignalen als gevolg van endoreduplicatie of acytokinetische mitose.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde transgene markers en gedefinieerde beeldvormingsparameters.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door een eerdere identificatie van verbindingen met een werkelijke hyperplastische activiteit mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door mechanistische klassen van cardiomyocytenrespons te onderscheiden.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie, het omgaan met transgene dieren en technieken voor de isolatie van cardiomyocyten.
- Afhankelijk van toegang tot Myh6-H2B-mCh en CAG-eGFP-anillin muizenlijnen of gelijkwaardige dubbele reporter-systemen.
- Vereist gestandaardiseerde enzymatische digestie- en uitplaatprocedures om de cellevensvatbaarheid en de getrouwheid van de kleuring te behouden.
- Omvat handmatige meetstappen voor kernen en het tellen van mitotische gebeurtenissen, wat training tussen operators kan vereisen voor consistentie.
- Beperkt door weefseltoegankelijkheid en signaalpenetratie in dikke coupes, waardoor optische clearing of sectie maken noodzakelijk is voor diepe weefselanalyse.
