Name: Swab Sampling Methode voor de detectie van humane Norovirus op oppervlakken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Leer een macrofoam-gebaseerde swabmethode voor het detecteren van norovirus op harde oppervlakken. Dit protocol verbetert de herstelpercentages en ondersteunt uitbraakonderzoek effectief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen dankbetuigingen.

1. Swab Sampling in het veld <ol><li> Draag een schone paar handschoenen. </li><li> Meten van de grootte van bemonsteringsplaats zonder het oppervlak met een meetlint of liniaal. Probeer om het gebied zo goed mogelijk te schatten en invullen van een meldingsformulier (aanvullende tabel 1). </li><li> Controleer de swab-kit voor eventuele lekkages en het label monster transport tassen en swab kits. </li><li> Verplaats het staafje over de bemonstering gebied als volgt: een slag in horizontale richting, een slag in verticale richting en een slag in een diagonale richting. Niet een oppervlakte die groter zijn dan 700 cm 2 zwabberen. </li><li> Plaats elke zwabber in een buis en draai de dop goed. </li></ol> 2. Opslag en Transport van Swabs aan het Laboratorium <ol><li> Houd uitstrijkjes bij 4 ° C gedurende maximaal 48 uur. Als de opslag langer vereist is, slaan de doekjes bij -20 ° C (of -70 ° C). </li><li> Houd de buizen bij 0-4 ° C (dwz. Gebruik koude kompressen) in een geïsoleerde container tijdens het transport naar het laboratorium en het schip binnen 24-48 uur van de collectie. </li></ol> 3. Virus Concentratie, virale RNA-extractie en zuivering Opmerking: Alle centrifugatiestappen gebruiken een tafelblad centrifuge bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Wees extra voorzichtig bij het werken met de universele nucleïnezuur extractie (UNEX) buffer. Draag een veiligheidsbril of gezichtsbescherming. <ol><li> Label een 15 ml buis en één RNA Midi kolom voor elk monster. Neem een ​​negatieve extractie controle in elk experiment. </li><li> De Lysis oplossing bereiden 10 swabs, meng 25 ml UNEX buffer met 25 ml PBST (PBS pH 7,2 bevattende 0,02% Tween-80). </li><li> Voeg 50 ul van colifaag MS2 suspensie (10 6 PFU / ul) aan 50 ml Lysis oplossing. </li><li> Plaats een wattenstaafje in een 15 ml buis en voeg 5 ml Lysis oplossing. Meng en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li>Voeg 5 ml 100% ethanol aan elke buis en vortex gedurende 10 s. </li><li> Verwijder voorzichtig het staafje uit de 15 ml buis (het bevat UNEX buffer) zacht aan te drukken tegen de zijkant van de buis om overtollige vloeistof te verwijderen en dan gooi het staafje. Het resterende volume moet tussen 9-10 ml. </li></ol> 4. Midi Column viraal nucleïnezuur Extraction <ol><li> Breng zorgvuldig 4,5 ml UNEX / ethanol mengsel van stap 3.6 op een midi-kolom, centrifuge en gooi het filtraat. </li><li> Plaats een andere 4,5 ml van dezelfde mengsel op dezelfde kolom, centrifuge, en gooi het filtraat. </li><li> Voor de eerste wasbeurt, voeg 3,5 ml van 70% ethanol op de Midi kolom, centrifuge en gooi het filtraat. </li><li> Voor de tweede wasbeurt, voeg nog eens 3,5 ml van 70% ethanol op de kolom Midi. Centrifuge en gooi het filtraat. </li><li> Voor de droge-spin, centrifuge de Midi kolommen om alle sporen van ethanol (wat een negatieve invloed kan hebben op uw viraal RNA herstel) te verwijderen. </li><li>Plaats de kolom Midi in een nieuwe 15 ml centrifugebuis. Voeg 250 ul elutiebuffer op de kolom Midi; wacht 1 min voor centrifugeren om de hoogste virale RNA terugwinning te verkrijgen. </li><li> De uitgepakte nucleïnezuur bij -70 ° C of onmiddellijk overgaan naar stap 5. </li></ol> 5. Concentratie van viraal nucleïnezuur met behulp van RNA Schoon en Concentrator Kits <ol><li> Voeg 500 ul van RNA Binding Buffer 250 pl RNA geëlueerd in stap 4.7 hierboven en vortex gedurende 10 s. </li><li> Voeg 750 ul 100% ethanol en vortex gedurende 10 s. </li><li> Label een spin kolom voor elk monster. Laad de 750 pi monster op een spin-kolom. </li><li> Centrifugeer de spinkolommen bij 12.000 xg gedurende 1 min. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Laad de resterende 750 pl op een spinkolom en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 1 min. </li><li> Voor de voorwas, voeg 400 ul RNA Prep buffer elke spin kolom en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 1 min. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Voor de eerste wasbeurt, voeg 800 ul RNA Wash Buffer om elke spin kolom en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 1 minuut. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Voor de tweede wasbeurt, voeg 400 ul RNA Wash Buffer naar kolom en centrifuge draaien op 12.000 xg gedurende 1 minuut. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Voor de droge-spin centrifuge de spin kolom om alle sporen van wasbuffer verwijderen bij 12.000 xg gedurende 2 minuten. </li><li> overdracht spinkolom goed naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml. </li><li> Voeg 25 ul elutiebuffer naar de spinkolom en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Dit zal het herstel van de virale RNA te verhogen van de kolom. </li><li> Verzamel RNA door centrifugeren van de spinkolom bij 10.000 xg gedurende 1 min. </li><li> Hetzij direct doorgaan naar RT-qPCR (stap 6) of opslag RNA bij -70 ° C. </li></ol> 6. Mutiplex RT-qPCR detectie van genogroup I en II Norovirussen en colifaag MS 2 (aanvullende tabel 2) <ol><li> Schoon werken oppervlakken, pipettes en centrifuges met RNase decontaminatie oplossing om mogelijke verontreiniging te verminderen. </li><li> Ontdooi RT-qPCR reagentia op het ijs. Dooi RNA op ijs (in een aparte ruimte / kamer). </li><li> Bepaal het aantal reacties en voeg ten minste 10% meer daarvan (bijvoorbeeld als 10 reacties nodig zijn, maken master mix voor 11). </li><li> Vortex afzonderlijke master mix componenten, met uitzondering van de 25x RT-qPCR enzym, gedurende 5 s. Zorgvuldig mengen van het enzym door de knop van de buis met een vinger. </li><li> Kort centrifuge master mix componenten gedurende 5 s. </li><li> Bereid de master mix voor realtime RT-PCR detectie van norovirus GI en GII volgens de kit instructies toevoegen norovirus-specifieke oligonucleotideprimers en probes in een 1,5 ml microcentrifugebuis (aanvullend tabel 3). </li><li> Meng de master mix door pipetteren 5-10 keer op en neer (vortexen wordt niet aanbevolen). Aliquot 22 pi van de master mix in elk putje van real time PCR 96-well plaat. </li><li> Vortex monster RNAvoor 5 sec, en het verzamelen van korte (5 s) centrifugeren. </li><li> Voeg 3 ul van het monster RNA en GI en GII positieve controles voor de RT-qPCR plaat (volg sjabloon in tabel 2). Voeg 3 ul van nuclease-freewater in de niet-matrijs-control (NTC) wells. </li><li> Verzegeling van de real-time plaat met optische zelfklevende film. </li><li> centrifuge voorzichtig de real-time plaat bij 1300 xg gedurende 1 min om eventuele luchtbellen of vloeistofdruppels die in de putjes kunnen worden verwijderd. </li><li> Het opzetten van een real-time PCR-instrument en de set-up van de volgende thermische cycli voorwaarden: 1) RT stap gedurende 10 min. bij 45 ° C (2) activering van Taq polymerase, 10 min. bij 95 ° C en (3) 45 cycli van 15 s bij 95 ° C en 60 s bij 60 ° C. </li></ol> 7. Kwantificering van Norovirus in Swabmonsters <ol><li> Controleer de resultaten van positieve en negatieve controles voor RT-qPCR resultaten (aanvullend tabel 3) bevestigen. </li><li> Bepalen of elke standaard curve voldoet aan deacceptabele waarden in aanvullende tabel 2 en de berekening van de totale standaardafwijking voor de standaard curve met behulp van Vergelijking 1. (Vergelijking 1)% rendement = 100 x 10 (gemiddelde Ct Values-Intercept) / Helling. </li><li> Als de PCR thermal cycler software niet de helling voor elke standaard curve heeft te berekenen, bepalen helling en R2-waarden door regressie met behulp van statistische software (bijvoorbeeld Excel, SPSS of SAS). Bereken bovendien de efficiëntie% voor standaard curves volgende vergelijking I </li><li> Noteer het RNA kopienummer berekend door de thermische cycler software voor alle monsters gebaseerd op standaard curven die aan de in tabel 4 aanvullende criteria. Herhaald alle monsters met standaard krommen D at niet voldoen aan de criteria of vals-positieve controles. Controleer Ct waarden van colifaag MS2, die als een interne controle voor PCR remming volgen werd toegevoegd. </li><li> Bepaal het aantal RNA-kopieën per monster, door het RNA kopienummer in stap 7,2, berekend door de verhouding van het volume (25-50 pi) totaal RNA elutiemiddel dat het RNA (3-5 ul) gebruikt voor de RT-qPCR reactie vermenigvuldigen. Als alternatief, het berekenen van de RNA dichtheid door het totale RNA aantal kopieën te delen door het oppervlak object gebied (cm2) geanalyseerd. </li></ol> 8. Genotypering van Real-time RT-PCR-positieve monsters door Hemi Geneste Conventionele PCR Amplification <ol><li> Bereid de eerste ronde van de master mix voor elke primer set van de RT-PCR-test (Aanvullende tabellen 2 en 5). </li><li> Voeg 5 ul van norovirus positieve RNA tot 20 ul van master mix. </li><li> Voer het RT-PCR onder de volgende voorwaarden: (1) RT stap gedurende 30 minuten bij 42 ° C (2) activering van Taq polymerase, 15 min bij 95 ° C, en (3) 40 cycli van 30 s bij 95 ° C , 30 s bij 50 ° C en 60 sec bij 72 ° C. Na 40 cycli, incubeer gedurende nog 10 min bij 72 ° C. </li><li>Bereid de tweede ronde van mater mix voor elke primer set van de RT-PCR-test (Aanvullende tabellen 2 en 5). </li><li> Voeg 23 ul master mix en voeg 2 ul van de eerste ronde RT-PCR-producten (van de eerste ronde) aan elke buis (idealiter de eerste ronde product moet worden verdund 1/10 in RNase-free water). </li><li> Herhaal stap 8.3. </li><li> Bereid een 2% agarosegel in 1 x 100 ml Tris-acetaat EDTA (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur, en 1 mM EDTA, pH 8,3). Na agarose oplossen door het mengsel in de magnetron, voeg 10 pl nucleïnezuur vlek per 100 ml bereide gel na afkoelen van het mengsel tot 60-70 ° C, giet de gel en plaats de kammen. Laat de gel regelen ten minste 30 min. </li><li> Mix 15 pi van elke RT-PCR product met 3 pi van 6x ladingskleurstof. Load 15 pi van elk monster en de Electrophorese agarosegel bij 100 V gedurende 1 uur. </li><li> Accijnzen doel RT-PCR-fragmenten van geschikte grootte (330 bp voor GI en 341 bp voor GII) uit de gel eend RNA te zuiveren onder toepassing van een commercieel gelextractiekit. Het gezuiverde PCR-product kan nu worden gebruikt voor Sanger sequentiebepaling. </li></ol>

<ol><li>Isakbaeva, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+transmission+on+cruise+ship%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Norovirus transmission on cruise ship.</a> Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).</li>
<li>Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22440972">Environmental transmission of norovirus gastroenteritis.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>Malek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+norovirus+infection+among+river+rafters+associated+with+packaged+delicatessen+meat%2C+Grand+Canyon%2C+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005.</a> Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).</li>
<li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus+shedding+after+experimental+human+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus shedding after experimental human infection.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3880795/">Norovirus gastroenteritis.</a> N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li>
<li>Park, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+New+Environmental+Sampling+Protocol+for+Detection+of+Human+Norovirus+on+Inanimate+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).</li>
<li>Barker, J., Jones, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+spread+of+infection+caused+by+aerosol+contamination+of+surfaces+after+flushing+a+domestic+toilet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet.</a> J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).</li>
<li>Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosolization+of+a+Human+Norovirus+Surrogate%2C+Bacteriophage+MS2%2C+during+Simulated+Vomiting%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting.</a> PloS one. 10, 0134277(2015).</li>
<li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+50%25+human+infectious+dose+for+Norwalk+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus.</a> J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).</li>
<li>Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+introduction+routes+into+nursing+homes+and+risk+factors+for+spread%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hosp.+Infect%22%5BJournal%5D)">Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5651a2.htm">Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).</li>
<li>Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+prolonged+environmental+survival+of+small+round+structured+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hosp.+Infect%22%5BJournal%5D)">Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses.</a> J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).</li>
<li>Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+surface+sampling+methods+for+virus+recovery+from+fomites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).</li>
<li>Taku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+detection+of+caliciviruses+from+food+contact+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food.+Prot%22%5BJournal%5D)">Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces.</a> J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).</li>
<li>Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s12560-008-9007-0">Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces.</a> Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).</li>
<li>Herzog, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+recovery+efficiency+for+bacteriophage+P22+on+fomites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).</li>
<li>Vega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaliciNet%3A+A+Novel+Surveillance+Network+for+Norovirus+Gastroenteritis+Outbreaks+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).</li>
<li>Rolfe, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internally+controlled%2C+one-step%2C+real-time+RT-PCR+assay+for+norovirus+detection+and+genogrouping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping.</a> J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).</li>
<li>Kittigul, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+GII-4+2006b+variant+circulating+in+patients+with+acute+Thailand+during+a+2006-2007+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study.</a> J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).</li>
<li>Teunis, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus%3A+how+infectious+is+it%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus: how infectious is it.</a> J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).</li>
<li>Wollants, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+norovirus+sampling+method+using+sodium+dodecyl+sulfate%2FEDTA-pretreated+chromatography+paper+strips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips.</a> J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).</li>
<li>Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27154208">The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.iso.org/iso/catalogue_detail.htm?csnumber=55382">Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR.</a> International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).</li>
<li>Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+approach+to+defining+%22high-touch%22+surfaces+in+hospitals%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Control.+Hosp.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).</li>
<li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+norovirus+outbreak+at+a+long-term-care+facility%3A+the+role+of+environmental+surface+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Control.+Hosp.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).</li>
<li>Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+recovery+of+viruses+from+water%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Environ.+Virol%22%5BJournal%5D)">Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review.</a> Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).</li>
<li>Gallimore, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+monitoring+for+gastroenteric+viruses+in+a+pediatric+primary+immunodeficiency+unit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).</li>
<li>Ganime, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+human+adenoviruses+and+rotavirus+species+A+on+fomites+of+hospital+pediatric+units%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units.</a> Am J Infect Control. , (2016).</li>
<li>Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+contamination+of+aerosol+and+surfaces+through+toilet+use+in+health+care+and+other+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings.</a> Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).</li>
</ol>

Auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen. De bevindingen en conclusies in dit rapport zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de Centers for Disease Control and Prevention.

Noroviruses een menselijke infectieuze dosis 50% tussen 18 en 10 3 20 virusdeeltjes. Daarom kan zelfs low-level vervuiling van oppervlakken een gevaar voor de volksgezondheid opleveren. Verschillende aspecten van het staafje bemonsteringsprotocol geëvalueerd waaronder: 1) verschillende swab materialen, 2) opslagpositie swabs tijdens transport, 3) viraal RNA-concentratie, en 4) colifaag MS2 extractie als interne controle. Tot voor kort was alleen de prestati...

<html> Human noroviruses zijn een belangrijke oorzaak van de epidemie en sporadische acute gastro-enteritis wereldwijd 1, 2, 3. Het virus is zeer besmettelijk en de transmissie gebeurt via direct van persoon tot persoon interactie of indirect door contact met besmet voedsel, water en milieu oppervlakken. Noroviruses kan worden afgestoten langdurig en verlengde overleving van het virus omgevingsoppervlakken is gedocumenteerd 1, 2, 3. Tijdens drukke verlies, miljarden virusdeeltjes vrijkomt per gram ontlasting en braaksel bevat ook een voldoende aantal virale deeltjes infectie 4, 5, 6, 7, 8 veroorzaken,ef &quot;&gt; 9, 10. Bovendien kan de overdracht van het virus tussen levenloze oppervlakken en menselijke huid gemakkelijk voordoen 2, 11, 12. Derhalve kunnen de controle van milieuverontreiniging helpen uitbraak onderzoeken en evalueren van de doelmatigheid van sanering en desinfectie procedures. Milieubemonstering verschillende protocollen zijn beschreven voor de detectie van rotavirus, colifaag MS2, feline calicivirus (FCV), en bacteriofaag P22 13, 14, 15, 16. De in deze studies, waaronder snelle uitdroging (&lt;1 uur) en de kleine oppervlakte beschreven valideringsomstandigheden (25 x 100 cm 2), mogelijk onvoldoende lokale instellingen vertegenwoordigen. Bovendien, de verwachte geringe besmetting met envinmental oppervlakken moeten protocollen die in staat zijn om heel weinig virusdeeltjes te detecteren zijn. We ontwikkelden een-macroschuim gebaseerde oppervlak sampling methode voor de detectie en typering van norovirus. Deze methode is gevalideerd in meerdere norovirus uitbraken. Het protocol bevat 1) hoe staafje monsters van het milieu oppervlakken te verzamelen (2) hoe u het beste te onderhouden integriteit van de monsters tijdens het verzamelen en verzending naar het laboratorium, en 3) laboratorium testen en typering van norovirus.

<table><tbody><tr><td>Generieke naam voor kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrofoam-doekje</td><td>Premoistened EnviroMax Swab kit&nbsp;</td><td>Puritan</td><td>2588060PFUW</td></tr><tr><td>RNA Lysis buffer&nbsp;</td><td>CDC UNEX buffer</td><td>Microbiologics</td><td>Cat No MR0501</td></tr><tr><td>RNA extractie spinkolom</td><td>Midi kolom</td><td>Omega Biotek</td><td>Cat No R6664-02</td></tr><tr><td>RNA zuiveringsspinkolom</td><td>Zymol RNA Clean and Concentrator kit&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>Cat No R1016</td></tr><tr><td>Real time RT-PCR kit</td><td>AgPath kit One-Step RT-PCR Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Cat No 4387391</td></tr><tr><td>Conventionele RT-PCR kit</td><td>Qiagen one step RT-PCR kit</td><td>Qiagen kit</td><td>Cat No 210212</td></tr><tr><td>Gel extractie kit</td><td>Qiagen QIAquick gel extractie kit</td><td>Qiagen kit</td><td>Cat No 28704 of 28706</td></tr><tr><td></td><td>Coliphage MS2</td><td>ATCC</td><td>Cat No 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>RNA run-off transcripten</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Realtime PCR platform</td><td>Applied Biosystems</td><td>Model ABI 7500</td></tr><tr><td></td><td>Optische 96-wells reactieplaat</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4316813</td></tr><tr><td></td><td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp;showAddButton=true&amp;productID=4306311&amp;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx%0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D&amp;returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp Clear Adhesive Film&nbsp;</a></td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4306311</td></tr></tbody></table>

swab sampling methode voor de detectie van humane norovirus op oppervlakken

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses zijn een belangrijke oorzaak van de epidemie en sporadische gastro-enteritis wereldwijd. Omdat de meeste infecties, hetzij rechtstreeks worden verspreid via de route van persoon tot persoon of indirect via het milieu oppervlakken of voedsel, besmet fomites en levenloze oppervlakken zijn belangrijke voertuigen voor de verspreiding van het virus tijdens het norovirus uitbraken. We ontwikkeld en geëvalueerd een protocol met behulp van macroschuim swabs voor de detectie en typering van de menselijke norovirussen van harde oppervlakken. Vergeleken met vezel getipte swabs of antistatische doekjes, macroschuim swabs toestaan virus herstel (range 1,2-33,6%) van de wc-bril oppervlakken van maximaal 700 cm 2. Het protocol omvat stappen voor de extractie van het virus van de swabs en verdere concentratie van het virale RNA met behulp spinkolommen. In totaal zijn 127 (58,5%) van de 217 wattenstaafje monsters die waren verzameld van oppervlakken in cruiseschepen en langdurige zorg voorzieningen waar norovirus gastro-enteritis was geweestgerapporteerd testte positief voor GII norovirus door RT-qPCR. Van deze 29 (22,8%) met succes kon worden gegenotypeerd. Tot slot, detectie van norovirus op het milieu oppervlakken met behulp van het protocol ontwikkelden we kunnen helpen bij het bepalen van het niveau van milieuverontreiniging tijdens uitbraken alsmede opsporing van het virus wanneer klinische monsters niet beschikbaar zijn; het kan ook het toezicht op de effectiviteit van de sanering strategieën te vergemakkelijken.

Figuur 1 toont een stroomdiagram van het staafje bemonsteringsprotocol. Dit protocol bestaat uit vier stappen; 1) monstername, 2) sample opslag en het transport, 3) viraal RNA zuivering en concentratie en 4) RT-qPCR assay en genotypering. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> Figuur 1: Stroomdiagram van de definitieve protocol voor het milieu oppervlakte bemonstering v...

Een op macrofoam gebaseerde bemonsteringsmethodologie werd ontwikkeld en geëvalueerd voor de detectie en kwantificering van norovirus op harde oppervlakken in het milieu.

Swab Sampling Methode voor de detectie van humane Norovirus op oppervlakken

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Het algemene doel van onze op macrofoam gebaseerde methode voor oppervlaktebemonstering is het identificeren van de etiologie van een uitbraak, de globale evaluatie van de dynamiek van milieucontaminatie van het virus en de effectiviteit van saneringsstrategieën voor het norovirus. Dit protocol beschrijft in detail hoe wattenstaafmonsters van milieuoppervlakken moeten worden verzameld, hoe deze swabs moeten worden bewaard en getransporteerd, en welke laboratoriumprotocollen worden aanbevolen voor de detectie en typering van het norovirus vanuit deze swabs. Duidelijke verbeteringen van dit milieu-swabprotocol voor norovirussen zijn dat we het beste type swabmateriaal hebben bepaald, hoeveel norovirus er van harde oppervlakken kan worden teruggewonnen, en dat het protocol effectief kan worden gebruikt om grotere oppervlakken te bemonsteren.In deze video zullen twee van mijn stafwetenschappers, Geun Woo Park en Preeti Chhabra, het wattenstaafprotocol demonstreren voor de detectie en typering van norovirussen. Om te beginnen met het bemonsteren, gaat u naar het bemonsteringsgebied en beweegt u de wattenstaaf over het bemonsteringsgebied met één haal in horizontale richting, één haal in verticale richting en één haal in diagonale richting. Plaats elke wattenstaaf in een aparte buis en draai de dop stevig vast.Neem monsters van oppervlakken van roestvrij staal, een toiletbril en een deurkruk. Label vervolgens voor elk monster één buis van 15 milliliter en één RNA Midi-kolom. Neem in elk experiment een negatieve extractiecontrole op.Bereid een lege fles voor om afval van de universele nucleïnezurextractie (UNEX)-buffer op te vangen. Om de lysisoplossing voor 10 watjes te bereiden, mengt u 25 milliliters UNEX-buffer met 25 milliliters PBST. Voeg 50 microliters colifaag MS2-suspensie toe aan 50 milliliters lysisoplossing.Plaats een wattenstaafje in een buis van 15 milliliter en voeg vijf milliliter lysisoplossing toe. Meng het wattenstaafje in de oplossing en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur. Voeg vijf milliliter 100% ethanol toe aan elke buis en vortex de buizen gedurende 10 seconden.Verwijder de wattenstaaf voorzichtig uit de buis van 15 milliliter door deze zachtjes tegen de wand van de buis te drukken om overtollige vloeistof te verwijderen, en gooi de wattenstaaf vervolgens weg. Breng voorzichtig 4,5 milliliter van het UNEX-ethanolmengsel over op een Midi-kolom en centrifugeer de kolom. Gooi na centrifugatie het filtraat weg.Laad nog eens 4,5 milliliters van hetzelfde mengsel op dezelfde kolom en centrifugeer de kolom vervolgens. Gooi het filtraat weg. Voeg voor de eerste wasbeurt 3,5 milliliters 70%ethanol toe aan de Midi-kolom en centrifugeer de kolom.Gooi na het centrifugeren het filtraat weg. Voeg voor de tweede wasbeurt nog eens 3,5 milliliters 70%ethanol toe aan de Midi-kolom. Centrifugeer en gooi het filtraat weg.Centrifugeer voor de droge spin de Midi-kolommen om alle sporen van ethanol te verwijderen. Plaats de Midi-kolom in een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter. Voeg 250 µL elutiebuffer toe aan de Midi-kolom en wacht één minuut voor het centrifugeren om de hoogste recovery van viraal RNA te verkrijgen.Voeg 500 µL RNA-bindingsbuffer toe aan 250 µL RNA en vortex het mengsel 10 seconden. Voeg 750 µL 100% ethanol toe en vortex 10 seconden. Label vervolgens voor elk monster een spincolumn.Laad het monster van 750 µL op een spincolumn en centrifugeer de spincolumns. Gooi het filtraat weg. Laad de resterende 750 µL op een spincolumn en centrifugeer de columns.Voeg voor de voorwash 400 µL RNA prep buffer toe aan elke spincolumn en centrifugeer de column. Gooi het filtraat weg. Voeg voor de eerste wash 800 µL RNA wash buffer toe aan elke spincolumn en centrifugeer de columns.Gooi het doorstroomvolume weg. Voeg voor de tweede wasbeurt 400 microliters RNA-wasbuffer toe aan elke spincolumn en centrifugeer deze. Gooi het doorstroomvolume weg.Centrifugeer de spincolumn voor de droge spin om alle sporen van de wasbuffer te verwijderen. Breng de spincolumn voorzichtig over naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 25 µL elutiebuffer toe aan de spincolumn en incubeer de column gedurende één minuut bij kamertemperatuur om het herstel van viraal RNA uit de column te verhogen.Verzamel het RNA door de spincolumn één minuut lang te centrifugeren bij 10,000 ×g. Ga direct door naar real-time PCR. Voordat u verdergaat met multiplex real-time RTPCR, reinigt u de werkvlakken, pipetten en centrifuges met een RNase-decontaminatieoplossing.Ontdooi real-time PCR-reagentia op ijs. Ontdooi het monster-RNA op ijs in een apart gebied. Bepaal het aantal reacties en bereid minstens 10% extra reagentia voor de mastermix voor om verliezen tijdens het pipetteren op te vangen.Vortex vervolgens de afzonderlijke componenten van de mastermix gedurende vijf seconden. Meng het enzym voorzichtig door aan de buis te tikken. Centrifugeer de componenten van de mastermix kortstondig gedurende vijf seconden.Bereid vervolgens de mastermix voor de RTPCR-detectie van norovirus G1 en G2 volgens de instructies van de kit, en voeg norovirus-specifieke oligonucleotide primers en probes toe in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Meng daarna de mastermix door zeven keer op en neer te pipetteren. Verdeel 22 microliters van de mastermix over elke put van de real-time PCR-plaat.Vortex het monster-RNA gedurende vijf seconden en verzamel de inhoud door centrifugatie van vijf seconden. Voeg drie microliters positieve controles van het monster-RNA en 10-voudige seriële verdunningen van G1- en G2-RNA-transcripten toe aan de real-time PCR-plaat. Voeg drie microliters nucleasevrij water toe aan de wells voor de template-controle, of NTC-wells.Seal de plaat met optisch plakfolie. Centrifugeer de plaat voorzichtig bij 1.300 ×g gedurende één minuut om eventuele luchtbellen of vloeistofdruppels die in de wells aanwezig kunnen zijn te verwijderen. Stel vervolgens de real-time PCR in en voer de thermocycluscondities in.Bepaal de standaardcurven voor zowel de G1- als de G2-transcripten. Zet de Ct-waarden om in RNA-kopieën met behulp van de respectievelijke standaardcurve. Neem de verhouding tussen het volume van het totale RNA-eluaat en de totale hoeveelheid RNA die is gebruikt voor de real-time assay om het totale aantal RNA-kopieën per monster te berekenen.Om de norovirus-positieve monsters te genotyperen met behulp van hemi-nested conventionele RTPCR, bereidt u eerst een mastermix voor de eerste ronde RTPCR voor en verdeelt u aliquots van 20 µL over vooraf gelabelde PCR-buisjes. Voeg vijf µL RNA toe aan elk buisje. Nadat de eerste ronde RTPCR is voltooid, bereidt u een mastermix voor de hemi-nested tweede PCR-ronde door aliquots van 23 µL in nieuwe buisjes te verdelen.Voeg tot slot twee µL van het PCR-product uit de eerste ronde toe aan elke buis. De bemonsteringsmethode met macrofoam-swabs werd in het veld getest op monsters die waren verzameld van een cruiseschip waarop gevallen van vermoedelijke norovirus-gastro-enteritis waren gemeld. Vier van de 17 norovirus-positieve swabmonsters konden worden geg genotypeerd, en alle monsters hadden identieke G2-sequenties.Bepaling van de virale load maakte het mogelijk om oppervlakken die zwaar besmet waren, zoals toiletbrillen, te beoordelen. De relatie tussen de drempelcyclus, of Ct-waarden, en het vermogen om deze monsters te sequensen werd bepaald via real-time RTPCR. In totaal testten 127 van de 217 watjes positief voor G2 norovirus.Zwabbelmonsters met Ct-waarden tussen 24 en 27 en tussen 28 en 31 werden respectievelijk met percentages van 100% en 72,2% genotypeerd. Daarentegen werden slechts 22% en 1,6% van de zwabbelmonsters met Ct-waarden tussen 32 en 36 en 37 tot 40 succesvol gesequenced. Zoals we hebben aangetoond, maakt dit protocol het mogelijk om het niveau van milieucontaminatie tijdens norovirusuitbraken te bepalen, de mogelijke oorzaak van een uitbraak op te sporen wanneer klinische monsters niet beschikbaar zijn, en tevens de effectiviteit van schoonmaakpraktijken vast te stellen.Voor het meest nauwkeurige resultaat is het zeer belangrijk om dit protocol nauwgezet te volgen om de variatie in de resultaten tussen de verschillende monsters te minimaliseren.

swab-sampling-method-for-the-detection-of-human-norovirus-on-surfaces

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een stap RT-PCR voor de detectie en genogroup identificatie van Norovirus isolaten van kinderen ontlasting dat primers en TaqMan probes specifiek voor de open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 grensgebied, de geconserveerde regio van de Norovirus genoom gebruikt beschreven. Een niet-commerciële, kosteneffectieve RNA-extractie methode wordt beschreven.

Detectie en Genogrouping van Norovirussen van Children&#39;s Krukken Door Taqman een stap RT-PCR

This video demonstrates an assay for quantifying human norovirus virus-like particles (VLPs) binding to human intestinal bacteria. The bacterial suspensions are mixed with the VLPs and incubated to allow the formation of VLP-bacteria complexes. The complexes are then labeled with fluorophore-tagged VLP-specific antibodies, followed by flow cytometry-based visualization and quantification to identify the percentage of VLP-bound bacteria.

An Assay to Quantify the Binding of Human Norovirus VLPs to Intestinal Bacteria

EPA-methode 1615 gebruikt een elektropositieve filter om enterovirussen en norovirusessen te concentreren in milieu- en drinkwater. Dit manuscript beschrijft de procedure voor het verzamelen van monsters voor analyse volgens Methode 1615.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

Hier presenteren we een procedure om totale cultiveerbare virussen te meten met behulp van de Buffalo Green Monkey niercel lijn. De procedure biedt een gestandaardiseerd hulpmiddel voor het meten van het voorkomen van infectieuze virussen in milieu- en drinkwater.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

Hier presenteren we een procedure om enterovirus en norovirus in milieu- en drinkwater te kwantificeren met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve PCR. De gemiddelde virusterugwinning uit grondwater met deze gestandaardiseerde procedure van EPA-methode 1615 was 20% voor poliovirus en 30% voor muur-norovirus.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

Routine detectiemethoden gebruik te maken van de versterking van het virale genoom worden beperkt door hun onvermogen om te discrimineren besmettelijke uit niet-infectieuze deeltjes. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen voor alternatieve methoden om hulp in discriminatie van besmettelijke norovirus deeltjes met behulp van aptamer-bindende, Dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie.

Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Het doel van dit protocol is het kwantificeren van binding van de eukaryotische pathogene menselijke norovirus aan bacteriën. Na het uitvoeren van een eerste virus-bacterie gehechtheid test, flow cytometrie wordt gebruikt om viraal gebonden bacteriën te detecteren binnen de bevolking.

Kwantificeren van menselijke Norovirus Virus-achtige deeltjes binding aan commensale bacteriën met behulp van Flow Cytometrie

Een citizen science project is ontworpen om inwoners van San Diego te werven om milieumonsters te verzamelen voor SARS-CoV-2. Er is een meertalig webgebaseerd platform gemaakt voor het indienen van gegevens met behulp van een gebruiksvriendelijke interface voor mobiele apparaten. Een laboratoriuminformatiebeheersysteem vergemakkelijkte het verzamelen van duizenden geografisch diverse monsters met realtime resultaattracking.

Swabbing the Urban Environment - Een pijpleiding voor bemonstering en detectie van SARS-CoV-2 uit milieureservoirs

Dit protocol beschrijft een eenvoudige zelfklevende tape-gebaseerde aanpak voor de bemonstering van de tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door een snelle volledige cel detectie...

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

De uitoefening in staat is om apoptose in immuuncellen. Er zijn verschillende meet-beperkingen, met name met betrekking tot de hoeveelheid tijd die nodig is om te isoleren en te behandelen een bloedmonster voorafgaand aan de beoordeling. Aangetoond is een snelle en minimaal invasieve procedure voor de analyse van de oefening geïnduceerde apoptose lymfocyten.

Finger-stick Blood Sampling Methode voor de bepaling van lichamelijke oefening geïnduceerde apoptose Lymfocyt

Leer een macrofoam-gebaseerde swabmethode voor het detecteren van norovirus op harde oppervlakken. Dit protocol verbetert de herstelpercentages en ondersteunt uitbraakonderzoek effectief.

Swab Sampling Methode voor de detectie van humane Norovirus op oppervlakken

Meer video's verkennen