Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Het algemene doel van deze methode is om Zebravis embryo's te monteren voor live beeldvorming, die de normale uitgroei van het achterste lichaamsgedeelte mogelijk maakt. Deze methode kan worden aangepast voor de beeldvorming van andere delen van de zich ontwikkelende Zebravis. Deze techniek helpt om belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie te beantwoorden, zoals hoe individueel celgedrag leidt tot de morfogenese op het niveau van hele weefsels.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de vrije beweging van het achterste lichaam mogelijk maakt terwijl het embryo in de juiste oriëntatie wordt gehouden. Om te beginnen, voeg lage smeltpunt agarose toe tot een eindconcentratie van 1,5% aan E3-medium in een buis van 50 milliliter en los de agarose op door te verwarmen in de magnetron. Laat de oplossing gelijkmatig worden tot 42 tot 45 graden Celsius in een waterbad of op een incubator op tafel.

Na het trekken van glazen naalden volgens het tekstprotocol. Met een tang breek je de naald net voorbij het punt waar het buigt om een schone en scherpe naald te maken voor het oriënteren van embryo's en het verwijderen van overtollig agarose. Breng de embryo's naar het juiste stadium in E3-medium.

Gebruik vervolgens onder een binoculaire dissectiemicroscoop een paar scherpe pincetten om de embryo's te ontdoen van het dooierzakje. Incubeer de ontdaan embryo's gedurende minstens vijf minuten in tricaine werkoplossing. Gebruik vervolgens een glazen Pasteur-pipet om het ontdaan embryo met minimaal E3 rechtstreeks over te brengen in de 50 milliliter buis van 45 graden Celsius agarose.

Verwijder het embryo samen met ongeveer één milliliter van het montageagarose en breng ongeveer 100 microliter van het medium met het embryo over naar het centrum van een 10 millimeter microwell aan de onderkant van een 35 millimeter glasbodem Petrischaal. Terwijl het montagemedium hard wordt, verplaats het embryo naar de rand van de cirkel van agarose, met de staart naar buiten gericht. Gebruik de capillaire naald om het embryo zo lateraal mogelijk te oriënteren om de ontwikkeling van het achterste lichaam te beeldvormen.

Houd vervolgens met de capillaire naald het embryo in de gewenste laterale oriëntatie totdat de gel volledig is gesteld. Zodra de agarose druppel is gesteld, gebruik tricaine werkoplossing om de Petrischaal te overspoelen. Pas vervolgens, onder een dissectiemicroscoop met een getransmitteerde lichtbasis, de spiegelpositie en hoek van incident licht aan zodat het sterke contrast de sneden in de agarose duidelijk laat zien.

Gebruik om de eerste snede uit te voeren de capillaire naald of micro-scalpel om de agarose in een zaagbeweging op en neer te snijden, naast en halverwege de dooier, net achter de vormende hartvelden langs de vijfde voorste somiet, en volledig door de agarose tot het glas. Kritisch hier om ervoor te zorgen dat het embryo niet beschadigd raakt tijdens het snijden van de agarose over de dooierzak. Maak vervolgens de tweede en derde snede, beginnend tegen het embryo tot het glas, tangentieel aan de eerste vijf somieten, waardoor de dorsale ontvouwing van het achterste lichaam mogelijk wordt.

Begin vervolgens bij de kruising van snede een en drie, maak een langzame diagonale snede richting het einde van snede drie terwijl je langzaam omhoog tilt om het vierkant van agarose rond het achterste lichaam los te maken. Verwijder met een paar scherpe pincetten de losgemaakte blokken agarose uit het embryomedium door de wand van de Petrischaal te gebruiken als ondersteuning terwijl je de agarose stukken eruit tilt. Voor het monteren van het monster, gebruik 1% agarose in E3 om een 100 millimeter plastic schaal te bedekken tot een hoogte van vijf millimeter en laat het uitharden.

Plaats vervolgens een druppel van één milliliter lage smeltpunt agarose in het midden van de schaal en laat deze ook uitharden. Bedenk de embryo's in lage smeltpunt agarose zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Verwijder echter dit keer het embryo uit de 50 milliliter buis van agarose met een kleinere druppel oplossing en plaats deze kleine druppel op de één milliliter druppel in het midden van de schaal.

Gebruik de capillaire naald om het embryo in het midden van de kleine druppel te plaatsen en houd de juiste oriëntatie aan totdat de gel is gesteld. Gebruik ten slotte tricaine werkoplossing om de schaal te overspoelen en overtollig agarose te verwijderen. Een voorbeeld van een Zebravis embryo geïnjecteerd met mRNA dat codeert voor het fotoomzettingsfluorescenteiwitje kikumeGR, vervolgens gemonteerd op de 15 somiet fase en onderworpen aan time-lapse beeldvorming gedurende 12 uur, wordt getoond in deze geanimeerde video.

Het achterste lichaam wordt vrij gelaten om te bewegen en vertoont vergelijkbare veranderingen in morfologie zoals gezien in embryo's die vrij van hun chorion mogen ontwikkelen in normale kweekomstandigheden. In deze video werden embryo's geïnjecteerd op het 16 cel stadium met mRNA dat histone 2BRFP codeert, dat de kernen labelt, en CAAXGFP, dat de celmembranen labelt. Beelden werden genomen op een rechtopstaande, multifotonmicroscoop met een 25X waterimmersie objectief vanaf het 10 somiet stadium gedurende drie uur om celgedrag tijdens staartknopvorming te visualiseren.

Cellen kunnen worden gezien die actieve uitsteeksels en gerichte beweging genereren terwijl de staartknop zich normaal vormt. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 20 minuten worden uitgevoerd als het goed wordt gedaan. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het embryo in een laterale positie is terwijl de agarose gel uithardt.

Anders zal het gebied van belang snel uit het gezichtsveld bewegen tijdens het beeldvormen. Na het bekijken van deze video, zou u een duidelijk begrip moeten hebben van hoe u Zebravis embryo's moet monteren voor de live beeldvorming van achterste lichaamsgroei.