Name: Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Leer een veelzijdige montagemethode voor langdurige beeldvorming van levende zebravisembryo's. Deze techniek behoudt normale ontwikkeling en maakt gedetailleerde observatie van celgedrag tijdens morfogenese mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Estelle Hirsinger: Kernfinanciering van het Institut Pasteur en Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is afkomstig van het Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon werd gefinancierd door de Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), vervolgens een Roux-beurs (Institut Pasteur) en vervolgens een AFM-Téléthon-beurs (nummer 16829). Hij wordt nu ondersteund door een Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. Voorbereiding van de Solutions en trok glazen naald <ol><li> Wordt 25x voorraadoplossing van tricaïne (3-amino benzoëzuurethylester, ook wel ethyl 3-aminobenzoaat) en 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8,8 en breng deze oplossing bij pH 7. Aliquot van 4 ml en bewaar bij -20 ° C. LET OP: De verdoving tricaïne werkt bij voorkeur op neurale-voltage-gated natriumkanalen waardoor spiertrekkingen en beweging 6 blokkeren. </li><li> Maak een werkoplossing van tricaïne bij een uiteindelijke concentratie van 0,17 mg / ml in E3 embryo medium. 7 LET OP: Maak de tricaïne werkende oplossing ex tempore als de pH van deze oplossing drijft. </li><li> Los het lage smeltpunt agarose tot een uiteindelijke concentratie van 1,5% in E3 embryo medium in een 50 ml buis door verwarming van de oplossing in een magnetron. Laat deze oplossing in evenwicht tot 42-45 ° C in ofwel een waterbad of bench-top incubator. Als voorbereiding van grote schotels voor verticalelight-sheet imaging (stap 4), maak dan een extra 25 ml van 1% -norm smeltende agarose in E3 embryo medium. </li><li> Gebruik borosilicaatglas met filament capillairen met een afmeting van 1,20 mm OD, ID 0,69 mm, lengte 10 mm. </li><li> Als haarvaten worden getrokken van het type verwarming filament naald puller in de tabel van de apparatuur en reagentia, gebruik de volgende instellingen beschreven: Heat 600, Pull 120, Velocity 50, Time 225, Pressure 500. Met een paar scherpe tang, breken de naald net voorbij het punt waar het buigt om een ​​schone en scherpe naald voor het oriënteren embryo&#39;s en het verwijderen van overtollige agarose creëren. Een micro-scalpel kan ook worden gebruikt om overtollige agarose te verwijderen. </li></ol> 2. Inbedding van embryo&#39;s voor Inverted of Upright Microscopy <ol><li> Breng de embryo&#39;s tot aan de juiste fase in E3 embryo medium. 7 </li><li> Aan het vereiste stadium dechorionate embryo met een paar scherpe tang onder een binoculaire dissecTing microscoop. </li><li> Incubeer de dechorionated embryo gedurende tenminste 5 min in tricaïne werkoplossing. </li><li> Zodra de gesmolten agarose oplossing afgekoeld tot 45 ° C, gebruikt een glazen Pasteur pipet om de dechorionated embryo direct in de 50 ml buis met minimale overdracht van E3 medium. </li><li> Verwijder embryo samen met ongeveer 1 ml van de montage medium en voeg ong. 100 ui samen montage medium met het embryo van de centrale cirkel van een 35 mm glazen bodem petrischaal met een 10 mm microwell. </li><li> Aangezien het fixeermiddel plaatst, beweegt het embryo naar de rand van de cirkel van agarose met de staart naar buiten (Figuur 1A). Gebruik de capillaire naald voor het embryo handhaven de gewenste zijwaartse richting totdat de gel volledig is ingesteld. Om het achterste lichaam ontwikkeling, zorg om het embryo in als zijwaartse een oriëntatie mogelijk te oriënteren. Daarom onderhouden van de embryo in deze positie door zorgvuldige adjustments met de capillaire naald. OPMERKING: meerdere embryo&#39;s kunnen worden toegevoegd aan de montage schotel op dit punt, indien nodig. Als dit het geval brengt de laagsmeltende agarose in de schaal eerst en voeg het embryo naar het midden van de agarose druppel. Druk vervolgens de embryo&#39;s op de randen van de glazen ring en oriënteren in de gewenste positie. Tot zes embryo&#39;s kunnen op deze manier voor de agarose wordt gestold worden gemonteerd. </li></ol> 3. Verwijdering van Excess Agarose Around the Posterior Body NB: Dit deel beschrijft de procedure waarmee agarose uit de regio rond het achterste lichaam wordt verwijderd. Bij achterste lichaam rek, is het belangrijk dat de staart kan groeien-out normaal. Door het verwijderen van de agarose nadat het embryo volledig is opgenomen door agarose, wordt het embryo links omsloten door het kopgebied en ongeveer de helft van de dooierzak. <ol><li> Nadat de agarose druppel heeft ingesteld, overspoelen de petri dish met de tricaïne werkende oplossing. </li><li> Onder een microscoop ontleden verrekijker met een verzonden licht base, pas de spiegel positie en de hoek van invallend licht, zodat het sterke contrast maakt de bezuinigingen in de agarose duidelijk worden gezien door de operatie. </li><li> Uitvoeren gesneden 1 (figuur 1) Gebruik de capillaire naald of micro-scalpel om de agarose halverwege langs de dooier snijden, vanaf een plaats juist achter het vormen hart veld de positie van de somite 5 (de 5 e anterior somite). </li><li> Start de eerste cut grenst aan de vorming van het hart, zoals aangegeven, en de volledige weg door de agarose aan het glas. </li><li> Houd de capillaire of micro-scalpel diep in de agarose, en langzaam zag op en neer, terwijl begint een lange snee boven het embryo te maken, zoals getoond figuur 1. Gesneden zo dicht mogelijk bij het embryo mogelijk zonder doorboren het embryo of de dooier. </li><li> Vervolgens bezuinigen 2 en 3 (figuur 1 </strong&gt;), Uitgaande van de positie ten opzichte van de embryo en met de gesneden gaat helemaal naar beneden naar de glazen bodem schotel. Voeg 2 gesneden zodat het raakt aan de eerste 5 somieten die volledige dorsalward ontvouwing van het achterste lichaam. Voeg snij 3 bij een 90 ° hoek met het oppervlak dooier en vanaf de Heartfield. Opmerking: Het snijden van de agarose tot de rand van het glas cirkel (zie figuur 1) helpt bij het verwijderen van de agarose als een volledig blok (stap 3,6). Dit is echter niet noodzakelijk. </li><li> Vanaf de kruising van bezuinigingen 1 en 3, maak een langzame diagonale snede aan het einde van de snede 2, terwijl langzaam te tillen boven het oog op het plein van agarose rond de achterste lichaam los te maken. Notities: In sommige gevallen wordt dit vrijgegeven in een blok en de operatie in één keer voltooid. In andere gevallen kan het enkele pogingen ondernemen om dis-lodge alle agarose rond het embryo. </li><li> Met een paar scherpe tang, verwijder de verdreven bsloten agarose uit het embryo medium. Om te helpen bij dit proces, beweegt de stukken agarose aan de kant van de schaal en het gebruik van de wand van de petrischaal ondersteuning tijdens het optillen van de stukken agarose. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> Figuur 1: Schema&#39;s van Montage Set-ups. (A) Het diagram toont de positie van de gemonteerde embryo in het centrum glasring van een petrischaal. Aan de rechterkant is een gezoem van de embryo met elke opeenvolgende snede door de omliggende agarose getoond met dottted rode lijnen. (B) De gemonteerde embryo wordt schematisch in zijaanzicht het weergeven van de gemakkelijke toegang voor zowel omgekeerd en rechtop doelstellingen. (C) Een soortgelijke digram toont hoe embryo&#39;s kunnen worden gemonteerd voor verticale licht sheet beeldvorming set-ups. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">Gelieve cl</a>ick hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <ol start="9"><li> Als spiertrekkingen niet volledig geblokkeerd is op dat punt, druppels tricaïne toe te voegen uit de voorraad oplossing van 4 mg / ml, pH 7. </li></ol> 4. Montage van embryo&#39;s voor Vertical Light-sheet Microscopy Opmerking: Dit is een variatie op de hierboven beschreven werkwijze die het mogelijk maakt voor de toegang van meerdere doelen voor beeldvorming steekproefsgewijs verticaal georiënteerde SPIM. Het idee achter deze wijziging is het monster iets hoger dan de bodem van de schaal te heffen, zodat gemakkelijk naar de twee imaging doelen. <ol><li> Vóór montage monster, laag een 100 mm plastic petrischaal met 1% agarose in E3 medium tot een hoogte van 5 mm en laat opstijven. </li><li> Een druppel van 1 ml laag-smeltpunt agarose naar het midden van de schaal en laat opstijven. </li><li> Embedden embryo&#39;s in laag-smeltpunt agarose zoals in hoofdstuk 2. Echter, dit keer, verwijder het embryo uit de 50 ml buisagarose met een kleinere druppel van oplossing (0,5 ml) en plaats deze kleine druppel boven de 1 ml vallen in het midden van de schaal. </li><li> Gebruik de capillaire naald om het embryo te plaatsen in het midden van het druppeltje en de correcte positie te houden totdat gel ingesteld. </li><li> Overspoelen de schotel met tricaïne werkende oplossing en verwijder de overtollige agarose zoals in hoofdstuk 3, maar zonder te snijden door middel van het kussen van de 1% -norm agarose. </li></ol>

<ol><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li>
<li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li>
<li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li>
<li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li>
<li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).</li>
<li>Schröter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li>
<li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze montage techniek maakt het mogelijk embryo&#39;s nog steeds tijdens de overdracht aan de microscoop en op lange termijn time-lapse imaging experimenten gericht op het volgende achterste lichaam rek bij meerdere lengteschalen worden gehouden. Bovendien is veelzijdig doordat het zorgt voor beeldvorming zowel rechtop en ondersteboven microscopie opstellingen en een suggestie gedaan voor hoe dit verder kan worden aangepast om verticaal georiënteerde SPIM. Een kritische stap in dit protocol ...

Achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling van het embryo zich een groot deel van de lichaamsas vormen. Het is een voorbeeld van een complex morfogenetisch proces waardoor meercellige gedrag optreden coördinerend de morfogenese op het niveau van afzonderlijke weefsels genereren. Deze differentiële weefsel vervormingen dan samenwerken om de verlenging van het achterste lichaam te genereren in de hele structuur niveau. Om te begrijpen hoe deze processen worden aangestuurd en gecoördineerd tijdens de ontwikkeling, moeten we in staat zijn om deze processen op verschillende schalen te volgen (dat wil zeggen op het niveau van moleculen, cellen, celpopulaties en weefsels) en deze rechtstreeks verband houden met de morfogenese van de gehele structuur . Zebravis embryo&#39;s zijn ideaal voor imaging achterste lichaam rek als hun optische transparantie en de geringe afmetingen zorgt voor de toepassing van minimaal invasieve licht imaging benaderingen zeer geschikt voor live beeldvorming. 1 Dit werd aangetoond door een aantal recente publicaties die gebleken werpen op achterste lichaam ontwikkeling op moleculair niveau, 2 enkele cellen, 3 en inter-weefsel gedrag, 4 en op het niveau van de celpopulatie en hele organen. 5 Geavanceerde imaging technieken zoals confocale, multi-foton microscopie en selectieve vliegtuig verlichting microscopie (SPIM) worden waardoor de lange termijn beeldvorming van ontwikkelingsprocessen met een verminderde werking van het licht toxiciteit en foto-bleken. Robuuste technieken voor de bevestiging van levende monsters nodig heeft drie doelen: 1) voldoende steun aan de bemonsteringen in de juiste positie te houden gedurende de overbrenging naar de microscoop en tijdens acquisitie, 2) voldoende bewegingsvrijheid van het monster om de uitgroei van het achterste lichaam regio zonder dat zijn normale ontwikwikkeling, en tenslotte 3) een zekere mate van veelzijdigheid van de montage-methode om imaging staan ​​op diverse imaging set-ups. Dit protocol introduceert een bevestigingstechniek voor het afbeelden van de ontwikkeling van de zebravis D. rerio. Deze techniek houdt montage embryo zodanig dat de kop en dooierzak regio vrijwel volledig opgenomen in agarose, terwijl het achterste lichaamsgebied te rekken en normaal te ontwikkelen. Als zodanig is het ook een geschikte methode voor de lange termijn beeldvorming van andere delen van het lichaam ontwikkelen als agarose maakt beeldvormend standaardfitting beeldvormingstechnieken. Dit protocol demonstreert montage van embryo&#39;s in een zijwaartse richting, maar het is ook mogelijk om embryo&#39;s in alteratieve oriëntaties monteren. Het zal verder zien hoe u de methode voor het rechtop, omgekeerd en verticale light-sheet microscopie opstellingen aan te passen.

<table><tbody><tr><td>VERBRUIKSBARE ITEMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schotels met glazen bodem</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petri schaal, 10 mm microput. Nr. 1.5 dekglas</td></tr><tr><td>Kapillaren voor injectienaalden</td><td>&nbsp;Sutter&nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>We gebruiken orosilicate glas met filament, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, lengte 10 cm. Echter, filament naalden zijn niet noodzakelijk en de meeste standaard injectienaalden zouden moeten werken.</td></tr><tr><td>Micro-scalpel</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather wegwerp oogafschaar met plastic handvat</td></tr><tr><td>Pasteur Pipetten</td><td></td><td></td><td>230 mm lang</td></tr><tr><td>REAGENTIA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Agar-agar met laag smeltpunt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>APPARATUUR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincetten&nbsp;</td><td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&nbsp;</td><td>11252-30&nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Naaldtrekker&nbsp;</td><td>Sutter&nbsp;</td><td>P97</td><td>Naaldtrekker met verwarmingsfilament</td></tr><tr><td>Binoculaire dissectiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

een veelzijdige montage methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebravisembryo&#39;s vormen een ideale experimenteel systeem om complexe morfogenetische processen te bestuderen vanwege hun gemakkelijke toegankelijkheid en optische transparantie. Vooral achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling waarbij meerdere weefsel vervormingen werken samen om de vorming van een groot deel van de lichaamsas sturen. Om dit proces te observeren door langdurige time-lapse imaging moet een bevestigingstechniek waarmee voldoende steun monsters in de juiste positie te houden gedurende de overbrenging naar de microscoop en verkrijging gebruiken. Daarnaast moet de montage ook voldoende bewegingsvrijheid voor de uitgroei van de achterste lichaamsgebied zonder aantasting van de normale ontwikkeling. Tenslotte moet een zekere veelzijdigheid van de montagewijze beeldvormende worden vrijgemaakt voor diverse imaging setups. Hier presenteren we een bevestigingstechniek voor beeldvorming van de ontwikkeling van achterste lichaam elongation in de zebravis D. rerio. Deze techniek houdt montage embryo zodanig dat de kop en dooierzak regio vrijwel volledig opgenomen in agarose, terwijl de achterste lichaamsgebied te rekken en normaal te ontwikkelen. We zullen zien hoe dit kan worden aangepast voor rechtop, omgekeerd en verticale light-sheet microscopie set-ups. Hoewel dit protocol is gericht op montage embryo&#39;s voor beeldverwerking met het achterste lichaam, kan het gemakkelijk worden aangepast voor de live imaging meerdere aspecten van zebravis ontwikkeling.

Het protocol hierboven geschetste Gegevens een veelzijdige techniek voor de montage van de zebravis embryo&#39;s voor de lange termijn time lapse imaging. Een voorbeeld hiervan wordt getoond in figuur 2A en geanimeerde / video Figuur 1. Embryo&#39;s werden geïnjecteerd op de 1 cellig stadium met mRNA dat codeert voor het fluorescerende eiwit photoconvertible kikumeGR. Aan het 15 somiet fase werden zij geplaatst zoals hierboven beschreven en afgebeeld ged...

Hier presenteren we een veelzijdige montagemethode die langetermijn tijds-gelaps beeldvorming mogelijk maakt van de ontwikkeling van het achterste lichaam van levende zebravisembryo's zonder de normale ontwikkeling te verstoren.

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Het algemene doel van deze methode is het monteren van Zebrafish-embryo's voor live-imaging, waarbij de normale uitgroei van de posterieure lichaamsregio mogelijk wordt gemaakt. Deze methode kan worden aangepast voor de imaging van andere regio's van de ontwikkelende Zebrafish. Deze techniek helpt bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals de wijze waarop individueel celgedrag leidt tot morfogenese op het niveau van volledige weefsels.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een vrije beweging van het posterieure lichaam mogelijk maakt, terwijl het embryo in de juiste oriëntatie wordt gehouden. Begin met het toevoegen van laagsmeltende agarose tot een eindconcentratie van 1,5% aan E3-medium in een buis van 50 milliliter, en los de agarose op door deze in de magnetron te verhitten. Laat de oplossing equilibreren tot 42 tot 45 degrees celsius in een waterbad of een laboratoriumincubator.Nadat de glazen naalden volgens het tekstprotocol zijn getrokken. Breek de naald met een pincet net voorbij het buigpunt om een schone en scherpe naald te creëren voor het oriënteren van embryo's en het verwijderen van overtollige agarose. Laat de embryo's in E3-medium rijpen tot het gewenste stadium.Gebruik vervolgens onder een binoculaire dissectiemicroscoop een scherp pincet om de embryo's te dechorioneren. Incubeer de gedechorioneerde embryo's gedurende ten minste vijf minuten in de werkoplossing van tricaine. Gebruik daarna een glazen Pasteur-pipet om het gedechorioneerde embryo met een minimale hoeveelheid E3 direct over te brengen naar de buis van 50 milliliter met agarose van 45 °C.Verwijder het embryo samen met ongeveer één milliliter van de montage-agarose en breng ongeveer 100 µL van het medium met het embryo over naar het centrum van een microwel van 10 mm onderin een glazen Petrischaal van 35 mm. Terwijl het montagemedium stolt, verplaatst u het embryo naar de rand van de agarosecirkel, met de staart naar buiten gericht. Gebruik de capillaire naald om het embryo zo lateraal mogelijk te oriënteren om de ontwikkeling van het achterlichaam in beeld te brengen.Houd vervolgens met de capillaire buis het embryo in de gewenste laterale oriëntatie totdat de gel volledig is gestold. Zodra de agarose-druppel is gestold, wordt de Petrischaal gevuld met de tricaine-werkoplossing. Pas vervolgens, onder een dissectiemicroscoop met een transmissielichtbasis, de spiegelpositie en de hoek van het invallende licht aan, zodat het sterke contrast ervoor zorgt dat de sneden in de agarose duidelijk zichtbaar zijn.Om de eerste snede uit te voeren, gebruikt u de capillaire naald of het microscalpel om de agarose met een zaagbeweging op en neer door te snijden, direct naast en halverwege de dooier, vlak posterieur van de vormende hartvelden tot aan het vijfde anterieure somiet, en volledig door de agarose tot aan het glas. Het is hierbij cruciaal om ervoor te zorgen dat het embryo niet wordt beschadigd tijdens het doorsnijden van de agarose over de dooierzak. Maak vervolgens de tweede en derde snede, beginnend tegen het embryo tot aan het glas, tangentieel aan de eerste vijf somieten, waardoor het dorsale deel van het posterieure lichaam kan openvouwen.Maak vervolgens, beginnend bij het snijpunt van snede één en drie, een langzame diagonale snede richting het uiteinde van snede drie, terwijl u langzaam omhoog tilt om het vierkant agarose rond het achterlichaam los te maken. Verwijder de losgekomen agaroseblokken uit het embryo-medium met een scherp pincet, waarbij u de wand van de Petrischaal als steun gebruikt tijdens het uitliften van de agarosestukken. Gebruik vóór het monteren van de monsters 1% agarose in E3 om een plastic schaal van 100 millimeter tot een hoogte van vijf millimeter te coaten en laat dit stollen.Plaats vervolgens een druppel van 1 ml laagsmeltende agarose in het midden van de schaal en laat deze ook stollen. Bedrijf de embryo's in laagsmeltende agarose zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Verwijder de embryo echter deze keer uit de buis van 50 ml agarose met een kleinere druppel oplossing en plaats deze kleine druppel bovenop de druppel van 1 ml in het midden van de schaal.Gebruik de capillaire naald om het embryo in het midden van de kleine druppel te positioneren en behoud de juiste oriëntatie totdat de gel is gestold. Gebruik tot slot de tricaine-werkoplossing om het schaaltje te vullen en verwijder het overtollige agarose. Een voorbeeld van een Zebrafish-embryo dat is geïnjecteerd met mRNA dat codeert voor het photoconverteerbare fluorescerende eiwit kikumeGR, vervolgens is gemonteerd in het 15-somietenstadium en gedurende 12 uur is onderworpen aan time-lapse-beeldvorming, wordt getoond in deze geanimeerde video.Het achterste deel van het lichaam kan vrij bewegen en vertoont vergelijkbare morfologische veranderingen als bij embryo's die zich vrij van hun chorion ontwikkelen onder normale kweekomstandigheden. In deze video werden embryo's in het 16-celstadium geïnjecteerd met mRNA dat codeert voor histone 2BRFP, om de kernen te labelen, en CAAXGFP, om de celmembranen te labelen. Beelden werden vastgelegd met een rechtopstaande multifotonmicroscoop met een 25X waterimmersie-objectief vanaf het 10-somietenstadium gedurende drie uur om celgedragingen tijdens de vorming van de staartknop te visualiseren.Er kan worden waargenomen dat cellen actieve uitstulpingen en directionele bewegingen genereren terwijl de staartknop zich normaal vormt. Zodra de techniek beheerst is, kan deze in 20 minuten worden uitgevoerd indien correct gedaan. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er zeker van te zijn dat het embryo zich in een laterale positie bevindt terwijl de agarosegel stolt.Anders zal het interessegebied tijdens de beeldvorming snel uit het gezichtsveld bewegen. Na het bekijken van deze video zou u een duidelijk inzicht moeten hebben in hoe u Zebrafis-embryo's monteert voor live-beeldvorming van de verlenging van het achterlijf.

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier beschrijven we een methode voor het monteren van zebravis embryo's voor de lange termijn imaging, twee-foton beeldvorming en weefsel-schade technieken en time-lapse confocale beeldvorming.

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Dit artikel beschrijft een methode om levende zebravisembryo's te monteren voor langetermijnbeeldvorming. Deze methode is kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren met behulp van gewone microscopieschalen met glazen bodem voor beeldvorming op inverted microscope. De montage wordt uitgevoerd in lagen agarose in verschillende concentraties.

Gelaagde agarmontage: levende zebravisembryo's voorbereiden op langetermijnbeeldvorming met een omgekeerde microscoop

Deze video beschrijft stap voor stap instructies voor het monteren van levende zebravisembryo's op 6 putplaat met behulp van laag smeltagarose. Het biedt ook het proces om beelden van levende embryo's te verkrijgen en deze te analyseren met behulp van software.

Agar-montage: een basismethode voor het monteren van levende zebravisembryo's voor langdurige beeldvorming

Processen als proliferatie, patroon, differentiatie en axon begeleiding kan gemakkelijk worden gemodelleerd in de zebravis ruggenmerg. In dit artikel beschrijven we een montageprocedure voor zebravis embryo's die visualisatie van deze gebeurtenissen optimaliseert.

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: Analyse van Spinal Cord Development

De ontwikkeling van de zebravis kan over dagen met licht blad microscopie wanneer embryo's zijn ingebed in optisch heldere polymeer buizen met een lage concentratie agarose worden gevolgd.

Multilayer Montage voor langdurig licht Sheet Microscopie van zebravis

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Dit artikel beschrijft een methode voor het monteren van fragiele zebravis embryo's voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie. Deze voordelige methode is eenvoudig uit te voeren met behulp van regelmatige glazen bodem microscopie gerechten voorbeeld vorming op elke omgekeerde Microscoop. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties.

Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Dit protocol maakt gebruik van light-sheet beeldvorming om de contractiele functie van het hart bij zebravislarven te onderzoeken en inzicht te krijgen in de hartmechanica door middel van celtracking en interactieve analyse.

4D Light-sheet beeldvorming van hartcontractie van zebravissen

Leer een veelzijdige montagemethode voor langdurige beeldvorming van levende zebravisembryo's. Deze techniek behoudt normale ontwikkeling en maakt gedetailleerde observatie van celgedrag tijdens morfogenese mogelijk.

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Meer video's verkennen