Functionele Manipulatie van Maternal Gene producten met behulp van In Vitro Maturatie van zebravis

Het algemene doel van dit protocol is om de in vitro rijping van zebravis-oöcyten uit te voeren en, indien gewenst, om functionele manipulatie van maternale genproducten uit te voeren, vóór de bevruchting. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelingsbiologie, met betrekking tot de belangrijkheid van de maternale bijdrage aan het embryo. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om oöcyten in vitro te kweken, gevolgd door bevruchting en productie van levensvatbare embryo's.

En, indien gewenst, maakt het functionele manipulatie mogelijk van maternale genproducten die in het vroege embryo onmiddellijk na de bevruchting werken. Om te beginnen, gebruik een visnet om acht tot tien dagen voorafgaand aan de in vitro cultuurmanipulatie, meerdere sets van een enkele mannelijke en een enkele vrouwelijke vis van de gewenste stam over te brengen naar een kweektank. Laat ze een nacht in de kweektank.

Na het laten paren van de vissen tot de volgende middag, gebruik een visnet om de vrouwtjes die eieren produceren tijdens het paren te scheiden en plaats ze in een aparte tank. Voer deze vrouwtjes twee keer per dag met een voedingsmix die ongeveer een gelijke hoeveelheid zeeslakjes en vissenvoervlokken bevat. Voeg onder steriele omstandigheden 20 milliliter Leibovitz's L-15 Medium met l-glutamine, PH 7.0, toe aan een conische buis van 50 milliliter.

Gebruik vervolgens 10 Normal natriumhydroxide om het naar PH 9.0 te brengen. Voeg 9 milliliter van het L-15 Medium toe aan twee afzonderlijke conische buizen van 50 milliliter. Label vervolgens de ene buis DHP en de andere DHP.

In de DHP-buis voeg je 10 microliters DHP, 490 microliters DH2O en 500 microliters 10%BSA toe. In de DHP-buis voeg je 100 microliters 10 milligram per milliliter gentamicine, 400 microliters DH2O en 500 microliters 10%BSA toe. Om de dissectie van oöcyten uit te voeren, begin met het bereiden van een 0,2% tricaïne stockoplossing in DH2O, gebufferd tot PH 7.0 met een molaar tris PH 9.0.

Bewaar deze oplossing bij 4 graden Celsius. Van nul tot vier uur voor het einde van de dagelijkse lichtcyclus in de faciliteit, voeg in een 250 milliliter beker 20 milliliter 0,2% tricaïne stockoplossing, PH 7.0, toe aan 80 milliliter viswater en meng. Het is van cruciaal belang om de procedure binnen vier uur na het einde van de daglichtcyclus te starten waaraan de vissen gewend zijn.

Anders zullen de oöcyten niet goed rijpen. Gebruik een lepel om de geëuthaniseerde vissen uit de tricaïne-oplossing te verzamelen en spoel ze kort in viswater. Plaats vervolgens de vissen op een papieren handdoek om overtollig water te absorberen.

Gebruik een schone scheermes om de geëuthaniseerde vissen op het niveau van de borstvinnen te onthoofden. Maak vervolgens met dissecerende schaar een longitudinale incisie op de ventrale kant van de vis, vanaf het voorste uiteinde tot het anale gebied. Plaats de vis op een petrischaal onder een dissectiemicroscoop met incident licht.

Gebruik vervolgens een paar dissectiepincetten om ovariumgedeelten te isoleren en breng het weefsel over naar een 35 bij 10 millimeter kweekschaal, die vier milliliter Leibovitz's L-15 Meidum, DHP, bevat. Gebruik nu dissectiepincetten om de oöcyten voorzichtig te scheiden van de folliculaire massa. Sorteer de oöcyten in het vroege stadium vier, die bijna de maximale grootte hebben, en worden gekenmerkt door een donker ondoorzichtig cytoplasma en een duidelijk zichtbare germinale blaas, of GV, die asymmetrisch in de oöcyt is gelegen.

Verwijder oöcyten in vroeger stadia en doorschijnende volwassen stadium vijf-eieren. Gebruik een glazen weidepijp om de oöcyten in het vroege stadium vier over te brengen naar een tweede 35 bij 10 millimeter plastic kweekschaal, die vier milliliter Leibovitz's L-15 Medium bevat, plus DHP. Breng minimale hoeveelheden minus DHP-medium over naar de schaal met de plus DHP-oplossing.

Als u mRNA injecteert, gebruikt u onmiddellijk voorafgaand aan de injectie RNA-kwaliteit omgekeerd osmose water en 0,2 molair kaliumchloride om het MRNA te verdunnen tot een eindconcentratie van 0,1 molair kaliumchloride. Als u Morpholinos of MO's injecteert, verdunt u de MO's onmiddellijk voorafgaand aan de injectie tot de gewenste concentratie met RNA-kwaliteit omgekeerd osmose water en 0,2 molair kaliumchloride om een eindconcentratie van 0,1 molair kaliumchloride te bereiken. Gebruik vervolgens, om de injectie uit te voeren, oöcyten handmatig vast te houden met fijne pincetten en injecteer met een naald gemaakt van een getrokken glas capillaire pijp ongeveer één nanoliter in wild-type stadium vier oöcyten.

Vervolg het incuberen van de onvolwassen en geïnjecteerde oöcyten in DHP-medium bij 26,5 graden Celsius. Controleer ongeveer elke 30 minuten om ervoor te zorgen dat de oöcyten intact blijven en ondergaan de juiste rijping, door geleidelijk transparant te worden. Gebruik een weidepijp om eventuele lyserende oöcyten te verwijderen.

En gooi ze in een laboratorium afvalbeker om de kwaliteit van het medium te behouden. Met ongeveer de helft van het volume verse DHP-medium, ververs het kweekmedium om een heldere oplossing te behouden, afhankelijk van de hoeveelheid oöcytlyse. Wanneer de meeste oöcyten transparant zijn geworden en een GV die niet langer duidelijk zichtbaar is, gebruik extra fijne pincetten om een scheur in het folliculaire membraan te maken, in een gebied met een grotere ruimte tussen de oöcyt en het membraan.

Pel een deel van het membraan af en rol terwijl u het gepelde deel vasthoudt, de oöcyt uit het membraan. Een andere cruciale stap is het verwijderen van het folliculaire membraan. Als deze laag niet volledig wordt verwijderd, zullen bevruchting en de uitbreiding van het chorion worden belemmerd.

Br