Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

Het algemene doel van deze procedure is om een driedimensionale reconstructie met diepteveldherstel van een dik biologisch specimen te verkrijgen met behulp van convergente straalscanning transmissie elektronentomografie. Deze methode kan sleutelvraagstukken beantwoorden op het gebied van structurele biologie over elektronentomografie van dikke biologische specimens. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat beelden kunnen worden verkregen in convergente bitmodus en dat de gegevensverwerking kan worden uitgevoerd op de meeste software die is gewijd aan tomografie.

Om te beginnen met het voorbereiden van een celkweekmonster, centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 5000 x g. Gebruik deze centrifugatieparameters gedurende de hele monstervoorbereiding. Gooi de supernatant weg en suspendeer de cellen opnieuw in één milliliter PBS verrijkt met 4% paraformaldehyde en 2% gluteraldehyde.

Incubeer de suspensie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het mengsel, gooi de supernatant weg en was het pellet drie keer met porties van één milliliter PBS. Gebruik dezelfde incubatiecondities en wasprocedure, incubeer het pellet in één milliliter PBS, verrijkt met 1%osmium tetroxide, en in één milliliter PBS verrijkt met 2% uraanacetaat.

Koel het monster vervolgens af tot vier graden Celsius. Dehydrateer het pellet door opeenvolgende incubaties in steeds geconcentreerdere ethanoloplossingen. Houd de monstertemperatuur van vier graden Celsius gedurende de hele incubatie, centrifugatie en wassing.

Suspendeer het gedehydrateerde pellet opnieuw in één milliliter zuivere ethanol en incubeer het overnacht bij 4 graden Celsius. Laat het monster vervolgens opwarmen tot kamertemperatuur en centrifugeer het monster. Incubeer het pellet in steeds geconcentreerdere epoxyharsoplossingen bij kamertemperatuur.

Na de laatste wassing, suspendeer het pellet opnieuw in één milliliter pure epoxyhars en incubeer het overnacht bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster, verwijder het supernatant en suspendeer vervolgens het pellet in 200 microliters epoxyhars en verharder. Breng de suspensie over in de capsule.

Incubeer de plastic capsule gedurende 48 uur op 60 graden Celsius om de hars te polymeriseren. Verwijder de capsule uit de incubator en controleer de harspolymerisatie. Voeg een laag epoxyhars en verharder toe boven het ingebedde monster en incubeer de capsule opnieuw onder dezelfde omstandigheden.

Monteer het in hars ingebedde monster ondersteboven in een monstershouder. Bevestig het monster stevig op de trimblok van een ultramicrotoom. Snijd de plastic capsule weg van het monster in de hars.

Vorm de blootgestelde hars tot een piramide. Breng vervolgens de capsule en monstershouder over naar de beweegbare arm van de ultramicrotoom. Installeer een trimmes en verfijn de piramidevorm onder leiding van een microscoop.

Vervang de trimmes door een histologiemes. Pas onder de microscoop de capsule-pitchhoek aan zodat de piramide loodrecht op de meskolk staat. Stel de snijsnelheid in en snijd het monster.

Na het snijden van het monster, breng de gekozen sectie over naar een behandeld koperrooster over filterpapier. Laat het monster drogen en laad het monster vervolgens in de elektronenmicroscoop. Om de doorlopende focale kantelserie te ontwerpen, bereken eerst de diepte van scherpstelling van de elektronenbundel en de maximale schijnbare dikte van het monster.

Op basis van deze waarden, selecteer een focusinterval en bepaal het aantal focusstappen dat nodig is om het hele monster bij de maximale schijnbare dikte te beeldvormen. Vervolgens, bij lage vergroting, lokaliseer het gebied van belang binnen het monster. Pas de eucentrische hoogte aan zodat het ROI niet lijkt te bewegen wanneer het monster wordt geroteerd.

Controleer of het ROI zichtbaar blijft gedurende het hele kantelaar. Vul de parameters voor de doorlopende focale kantelserie voor geautomatiseerde beeldacquisitie in en verzamel de beelden. Importeer de beeldserie in een beeldverwerkingsprogramma en lijn de beelden uit die bij dezelfde kantelhoek zijn verzameld in een piramidevormige hiërarchie.

Zoek de uitlijning bij elke kantelhoek door de uitgelijnde beelden te stapelen. Blader door de stapel om ervoor te zorgen dat alleen het scherpstelgebied van beeld naar beeld beweegt en heroriënteer de beelden indien nodig. Zodra de uitlijning in het hele monster is geverifieerd, voeg de scherpe informatie op de hoge instellingen samen om de serie met een enkele afbeelding per kantelhoek te verkrijgen.

Voer de uitlijning van de kantelserie uit op basis van lokale minima of fiduciale markers. Voer een 3-D reconstructie uit en inspecteer het resulterende beeld. Als de reconstructie wazig of vervormd lijkt, heroriënteer de originele beeldserie.

Een monster van t. brucei werd afgebeeld en geanalyseerd met behulp van deze methode. Bij een nulgraad kantelaar zijn verschillende details van de flagellare pocket zichtbaar.

Bij de hogere kantelaar van 70 graden is slechts een deel van elk beeld dat in de doorlopende focale serie is verzameld scherp. Deze positie verschuift gedurende de hele serie. Door de scherpe secties samen te voegen, wordt een enkele afbeelding met een grotere scherpe zone geproduceerd.

Dit effect is nog meer uitgesproken wanneer de hoge frequentie gebieden van de doorlopende focale kantelserie worden gemarkeerd. De hoge frequentie informatie omvat het grootste deel van de gecombineerde afbeelding, wat aangeeft dat de doorlopende focale kantelserie goed is verwerkt. Eenmaal beheerst, kan het beeldverwerkingsgedeelte in ongeveer drie tot vier uur worden gedaan, afhankelijk van de gekozen uitlijning en reconstructieparameters.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de uiteindelijke reconstructie grotendeels afhankelijk is van de kwaliteit van de voorafgaande uitlijningstests. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de verzameling en beeldverwerking van een doorlopende focale kantelserie kunt uitvoeren.