Name: Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en In Situ Proximity Ligatie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Leer co-immunoprecipitatie en proximity ligation assay vergelijken voor eiwit-eiwit interacties in kern en cytoplasma met HEK293-cellen. Deze methoden helpen onderzoekers bij het selecteren van de juiste techniek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de Zwitserse Nationale Wetenschapsstichting (SNSF, 31003A_163305).

1. Co-immunoprecipitatie <ol><li> Zaad HEK293 cellen bij 2 x 10 5 cellen per putje in een 6-well plaat in 2 ml Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) supplement met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U / ml penicilline-streptomycine (Pen-Strep) . </li><li> Kweek cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Was de cellen met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) driemaal. Oogst de cellen door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Bereid nucleaire en cytoplasmatische fracties behulp van commerciële nucleaire en cytoplasmatische extractie reagentia. Volg de instructies van de fabrikant met enkele wijzigingen. <ol><li> Gebruik 3 x 10 6 cellen voor een co-immunoprecipitatie-experiment (ongeveer 90% samenvloeiing van 3 putjes van een 6-wells plaat). Voeg 300 ul koude cytoplasmatische extractieoplossing (CER I) en vortex gedurende 15 seconden op de hoogste snelheid. </li><li> Incubeer gedurende 30 min op ijs. Tijdens incubatie Vortex 5 sec elke 10 min. </li><li> Voeg 16,5 ul koude cytoplasma extractie-oplossing II (CER II), vortex gedurende 5 seconden en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. </li><li> Vortex gedurende 5 seconden en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Transfer supernatans (cytoplasmatisch extract) in een nieuwe pre-gekoelde buis, en blijf op ijs tot gebruik. </li><li> Wassen onoplosbare pellets (bevattende kernen) drie maal met 1 ml koude PBS telkens op en neer te pipetteren vijf keer. Verwijder PBS na het wassen. </li><li> Voeg 150 ul koude nucleaire extractie-oplossing (NER), vortex gedurende 15 sec en incubeer 1 uur op ijs. Tijdens incubatie vortex gedurende 15 seconden en 10 maal pipet met een 200 ul tip elke 10 min. </li><li> Vortex gedurende 15 s en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Transfer supernatant (kernextract) in een nieuwe voorgekoeld buis, houdt op ijs tot gebruik. </li></ol></li><li> Neem 10% van het volume van de nucleaire en cytoplasmatische extracten elk als ingangen. </li><li> EENdd koude PBS om de resterende fragmenten tot een eindvolume van 1 ml. Blijf op ijs tot gebruik. OPMERKING: Pre-clearing niet essentieel is bij het gebruik van Proteïne G-geconjugeerde magnetische korrels. Echter, als de achtergrond hoge Voer pre-clearing door het incuberen van 40 pl Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels (50% suspensie) en 1 ml verdunde lysaat van deze stap op 4 ° C gedurende 30 minuten op een rotator. Aparte supernatant (pre-geklaard lysaat) uit kralen met magnetische rek. Gooi de kralen. </li><li> Te koppelen primair antilichaam met Proteïne G-geconjugeerde magnetische korrels, incubeer 40 ul Proteïne G-geconjugeerde magnetische korrels (50% slurry) met 4 ug konijn polyklonaal anti-RBM3 antilichaam of konijnen IgG (negatieve controle) in 200 pl PBS plus Tween 20 buffer (PBST, 0,02% Tween 20) bij kamertemperatuur (KT) gedurende 40 minuten op een rotator. </li><li> Aparte antilichaam-gekoppelde kralen en supernatant met een magnetische rek, en gooi de supernatant. Was de parels eenmaal met 200 pi PBST (0,02%). </li><li> Voeg 1ml verdunde lysaten (of eventueel vooraf geklaard lysaten) aan de korrels, en incubeer op rotator bij 4 ° C overnacht. </li><li> Op de volgende dag, scheiden de kralen en supernatant door een magnetisch rek, en gooi de supernatant. Was 3 x 10 min met 0,5 ml PBST (0,02%) voor elke buis bij 4 ° C op een rotator met een vaste snelheid van 20 rpm. </li><li> Elueer eiwitten van de bolletjes door toevoeging 40 pl monsterbuffer (1x commerciële monsterbuffer en 50 mM 1,4-dithiothreitol (DTT)). Verhit bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Spin down en overdracht vloeistoffen naar een nieuwe 1,5 ml buis. </li><li> Verdun ingang lysaten in monsterbuffer (eindconcentratie: 1x commerciële monsterbuffer en 50 mM DTT) en verwarm bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Load input en immunologisch neergeslagen eiwitten van de laatste stap een prefab 4-12% bis-Tris gel. Het laadvolume van elk putje mag niet meer dan 20 pl. Voeren elektroforese in 1 x loopbuffer commerciële op ijs gedurende 35 min. LET OP: Load nucleaire en cytoplasmatische extracts in een verhouding van 1: 2 (V / V), die dezelfde oorspronkelijke hoeveelheid cellen weerspiegelt. </li><li> Transporterende eiwitten op PVDF membraan 1x commerciële overdracht buffer bij 30 V gedurende 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Blok membraan met 5% magere melk in PBST (0,1% Tween 20) bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten op een schudapparaat. </li><li> Incubeer het membraan met primaire antilichamen (zowel verdund in 1: 1000) in PBST (0,1%) bij 4 ° C overnacht. </li><li> Was 3 x 10 minuten met PBST (0,1%) bij kamertemperatuur op een schudinrichting. </li><li> Incubeer membraan met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-muis of anti-konijn secundaire antilichamen (zowel verdund in 1: 5000) in PBST (0,1%) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Was 3 x 10 minuten met PBST (0,1%) bij kamertemperatuur op een schudinrichting. </li><li> Gebruik 0,2 ml versterkte chemiluminescentie (ECL) substraatmengsel per cm2 membraan geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Vermijd alle licht van deze stap verder met uitzondering van rode lichten. </li><li> Gooi vloeistof en blootstellen aan een röntgenfilm in een filmcassette. Ontwikkel film met behulp van een automatische film prHOUTBEWERKINGS machine. </li></ol> 2. Immunocytochemie en Proximity Ligatie Assay <ol><li> Zaad HEK293 cellen bij 1,5 x 10 4 cellen per kamer in één 8-kamer poly-D-lysine gecoate dia in 0,4 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en 100 U / ml Pen-Strep. </li><li> Kweek cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Aspireren medium en vast de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Aspireren PFA, en wassen 3 x 10 min met 0,5 ml PBS per kamer. </li><li> Doorlaatbaar en blok cellen met 0,5% Triton X-100 en 5% normaal geit serum (NGS) in PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Incubeer met primaire antilichamen in 0,1% Triton X-100 en 5% NGS in PBS op een schudder bij 4 ° C overnacht. Verdunde monoklonaal anti-NF90-antilichaam en konijn polyklonaal anti-RBM3 antilichaam 1: 100 in PBS dubbele kleuring. Voor negatieve controle, onafhankelijk weglaten van beide primaire antilichamen en weglaten beide antilichamen in een derde controle. NB: Gebruik geen commerciële blokkeren en verdunnen van reagentia. </li><li> Was 3 x 10 min met 0,5 ml PBS per kamer. </li><li> Onderworpen aan immunocytochemie of proximity ligation assay protocols <ol><li> immunocytochemie <ol><li> Incuberen met 1: 500 verdund groene fluorescente kleurstof gekoppeld anti-muis en rode fluorescerende kleurstof-gekoppelde anti-konijn secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Vermijd het licht van deze stap verder. </li><li> Tegenkleuring kernen met 4 &#39;, 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) verdund 1: 5000 in PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Was 3 x 10 min met 0,5 ml PBS per kamer. </li><li> Verwijder de kamers van het glasplaatje en droog. Monteer met 250 μ, montage medium per slide. </li></ol></li><li> Proximity ligation assay <ol><li> Bereid nabijheid ligatie assay probes. Meng en verdun twee proximity ligation assay probes (anti-muis en anti-konijn secundaire antilichamen bevestigd met verschillende oligonucleotiden die th kan ligerenruwe toevoeging van twee andere oligonucleotiden ligatie oplossing) zowel 1: 5 in 0,1% Triton X-100 en 5% NGS in PBS, met een totaal volume van 320 ui voor een 8-kamer schuif (ongeveer 40 pi per cm 2) . Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min. </li><li> Verwijder de kamers van het glasplaatje en voeg de verdunde probes. Incubeer in een vochtige incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Bereid ligatie oplossing. Meng 8 ui ligase, 64 ui 5 x ligatie voorraad en 248 ul H 2 O. </li><li> Tik de vloeistof af van de glijbaan, en was 2 x 5 min in 1x Wash Buffer A (geleverd bij de kit). </li><li> Voeg ligatie-oplossing en incubeer in een vochtige incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Bereid amplificatie oplossing. Mix 4 pl polymerase, 64 pi 5x versterking voorraad en 252 ul H 2 O. Vermijd licht van deze stap verder. </li><li> Tik off vloeistof van de glijbaan, en was 2 x 2 min in 1x Wash Buffer A. </li><li> Voeg de amplification oplossing en incubeer in het donker vochtigheid incubator bij 37 ° C gedurende 100 min. </li><li> Tik de vloeistof af van de glijbaan, en was 2 x 10 minuten in 1 x Wash Buffer B (geleverd bij de kit). Was gedurende 1 minuut in 0.01x Wash Buffer B. </li><li> Droog de glijbaan en monteer met 250 pi van een commercieel montage medium (met DAPI) per slide. </li></ol></li></ol></li><li> Onderzoek fluorescentiesignalen onder een microscoop met een 10x oculair en 20X objectief. Acquire beelden van een CCD-camera. </li></ol>

<ol><li>Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+isoforms%2C+a+new+family+of+cellular+proteins+involved+in+viral+replication%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?</a> Biochimie. 108, 20-24 (2015).</li>
<li>Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+NF90+is+required+for+interleukin-2+mRNA+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization.</a> Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).</li>
<li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF90-NF45+complex+functions+as+a+negative+regulator+in+the+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway.</a> Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).</li>
<li>Dresios, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+stress-induced+protein+Rbm3+binds+60S+ribosomal+subunits%2C+alters+microRNA+levels%2C+and+enhances+global+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).</li>
<li>Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+expression+of+mouse+Rbm3%2C+a+cold-shock+protein%2C+in+Sertoli+cells+of+cryptorchid+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).</li>
<li>Wellmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-regulated+expression+of+the+RNA-binding+proteins+RBM3+and+CIRP+by+a+HIF-1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).</li>
<li>Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-inducible+RBM3+inhibits+PERK+phosphorylation+through+cooperation+with+NF90+to+protect+cells+from+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress.</a> FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+of+the+Mouse+Mx1+Protein+with+the+Influenza+A+Virus+Nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).</li>
<li>Jarvius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+phosphorylated+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta+using+a+generalized+proximity+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-protein+interactions+in+cross-talk+pathways+reveals+CRKL+protein+as+a+novel+prognostic+marker+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn verschillende voordelen evenals tekortkomingen voor beide methoden. Als relatief nieuwe techniek, een duidelijk voordeel van nabijheid ligatie assay is het haalbaar om eiwit-eiwit interacties op single-cell level in plaats van een partij van heterogene cellen helderen. Beelden met een hoge resolutie en omvang (bijvoorbeeld door confocale microscoop) de mogelijkheid voor de kwantificering door het tellen van enkele fluorescerende vlekken. Daarentegen kan de conventionele combinatie van co-immunoprecipita...

Nucleaire factor 90 (NF90) is een multi-isovorm eiwit met tal van functies, waaronder de reactie op virale infectie, regulering van interleukine-2 post-transcriptie en regulering van miRNA biogenese 1-3. RBM3 een RNA-bindend eiwit, die deze vertaling en miRNA biogenese en kan worden geïnduceerd door verschillende stressoren waaronder hypothermie en hypoxie 4-6. Onlangs vonden we NF90 en RBM3 in een eiwitcomplex 7. De interactie van NF90 en RBM3 essentieel eiwit kinase RNA-achtige endoplasmatisch reticulum kinase (PERK) moduleren in ongevouwen eiwit reactie 7. Zowel NF90 en RBM3 bevinden zich hoofdzakelijk in de kern, maar een klein deel van NF90 en RBM3 shuttle naar het cytoplasma en binden er elkaar voor specifieke functies, bijv PERK activiteit te reguleren. Daarom is het belangrijk om de distributie van NF90-RBM3 interacties visualiseren subcellulair compartiment die kunnen duidenhun verschillende rollen in respectievelijke compartimenten. Decennia geleden, gist twee-hybride (Y2H) ontwikkeld om de interactie te detecteren tussen twee eiwitten 8. Echter, als gevolg van kunstmatige constructie van gefuseerde eiwitten, vals-positieve resultaten van de toepassing van deze methode beperkt. Lange tijd, co-immunoprecipitatie was hoofdtechniek analyseren eiwit-eiwit interacties, vooral bij endogene omstandigheden 9. Aan de gezamenlijk immunogeprecipiteerd eiwitcomplex analyseren Western blot is de meest geschikte techniek, terwijl massaspectrometrie wordt gebruikt bij super gevoeligheid en nauwkeurigheid gewenst. De laatste jaren heeft nabijheid ligatie assay ontwikkeld als een nieuwe methode om eiwit-eiwit interacties in zowel cellen en weefsels te detecteren in situ 10,11. Hier hebben we de meest populaire co-immunoprecipitatie en relatief nieuwe methode nabijheid ligatie assay werkwijze vastleggen NF90-RBM3 interactie in subcellulaire fracties. We hebben ook gesproken over de voordelen en beperkingen van beide technieken.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle&rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>Hoge glucose 4.500 mg/L</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (PenStrep)</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908.3</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>DRBP76 (NF90/NF110) antibody</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612154</td><td>gebruik 1:1.000 voor WB en 1:100 voor ICC/PLA</td></tr><tr><td>RBM3 antibody</td><td>ProteinTech</td><td>14363-1-AP</td><td>gebruik 1:1.000 voor WB en 1:100 voor ICC/PLA</td></tr><tr><td>Lamin A/C antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2032</td><td>gebruik 1:1.000 voor WB</td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>gebruik 1:1.000 voor WB</td></tr><tr><td>normal rabbit IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit IgG, HRP-linked secundaire antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#7074</td><td>gebruik 1:5.000 voor WB</td></tr><tr><td>anti-mouse HRP secundaire antibody</td><td>Carl Roth</td><td>4759.1</td><td>gebruik 1:5.000 voor WB</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Blotting Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>#1705060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide</td><td>Corning BioCoat</td><td>354632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA&nbsp; probe Anti-rabbit MINUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Detection Reagents Red</td><td>Sigma</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Wash Buffers Fluorescence</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Mounting Medium with DAPI</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>AX-70</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>SPOT</td><td>Insight 2MP Firewire</td><td></td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Fujifilm</td><td>Super RX</td><td></td></tr><tr><td>Film processing machine</td><td>Fujifilm</td><td>FPM-100A</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door co-immunoprecipitatie en<em&gt; in situ</em&gt; proximity ligatie assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Eiwit-eiwitinteracties zijn betrokken bij duizenden cellulaire processen en vinden plaats in een specifiek ruimtelijk context. Traditioneel is co-immunoprecipitatie een populaire techniek om eiwit-eiwitinteracties te detecteren. Daaropvolgende Western blot-analyse is de meest gebruikelijke methode om geco-immunoprecipiteerde eiwitten te visualiseren. Recentelijk is de proximity ligation assay een krachtig hulpmiddel geworden om eiwit-eiwitinteracties in situ te visualiseren en biedt de mogelijkheid om eiwit-eiwitinteracties door deze methode te kwantificeren. Net als conventionele immunocytochemie is de proximity ligation assay techniek ook gebaseerd op de toegankelijkheid van primaire antilichamen voor de antigenen, maar in tegenstelling detecteert proximity ligation assay eiwit-eiwitinteracties met een unieke techniek die rolling-circle PCR omvat, terwijl conventionele immunocytochemie alleen co-lokalisatie van eiwitten laat zien.
Nuclear factor 90 (NF90) en RNA-bindend motief eiwit 3 (RBM3) zijn eerder aangetoond als interacterende partners. Ze zijn voornamelijk gelokaliseerd in de celkern, maar migreren ook naar het cytoplasma en reguleren signaalroutes in het cytoplasmatische compartiment. Hier vergeleken we de NF90-RBM3 interactie in zowel de kern als het cytoplasma door co-immunoprecipitatie en proximity ligation assay. Daarnaast bespraken we de voordelen en beperkingen van deze twee technieken bij het visualiseren van eiwit-eiwitinteracties met betrekking tot ruimtelijke verdeling en de eigenschappen van eiwit-eiwitinteracties.

Figuur 1 toont aan dat NF90 en RBM3 zowel kerneiwitten en slechts een kleine fractie aanwezig in het cytoplasma. Met name zijn er drie verschillende banden gekleurd positief voor RBM3. De kleinste net onder 20 kDa geeft de juiste maat van RBM3 (het voorspelde molecuulgewicht van RBM3 is 17 kDa). De oorsprong van de twee andere banden nog worden onderzocht. Co-immunoprecipitatie experimenten met RBM3 als lokaas eiwit bleek dat NF90-RBM3 interacties overwegend in de kern e...

Eiwit-eiwit interacties kunnen zowel in de kern als in het cytoplasma van een cel optreden. Om deze interacties te onderzoeken, worden traditionele co-immunoprecipitatie en moderne proximity ligatie-assay toegepast. In deze studie vergelijken we deze twee methoden om de verdeling van NF90-RBM3 interacties in de kern en het cytoplasma te visualiseren.

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Het algemene doel van dit experiment is om de voor- en nadelen van co-immunoprecipitatie, of co-ip, en de proximity ligation assay, of pla, te vergelijken bij het visualiseren van eiwit-eiwitinteracties in verschillende cellulaire compartimenten. De hier gepresenteerde vergelijking van twee verschillende methoden kan wetenschappers helpen te bepalen welke methode beter geschikt is voor hun specifieke doel bij het onderzoeken van de distributiepatronen van eiwit-eiwitinteracties in de nucleus en het cytoplasma van een cel. Het belangrijkste voordeel van co-ip is het kunnen detecteren van authentieke eiwit-eiwitinteracties.Daarentegen is het voordeel van PLA dat in situ eiwit-eiwitinteracties snel op enkelcelniveau kunnen worden geanalyseerd. Nadat de HEK293-cellen zijn gekweekt en geoogst volgens het tekstprotocol, voegt u aan 3 × 10⁶ cellen 300 µL koude cytoplasmatische extractie-oplossing toe en vortexen deze cellen 15 seconden op de hoogste snelheid. Incubeer het extract 30 minuten op ijs en vortex het monster tijdens de incubatie elke 10 minuten gedurende vijf seconden.Voeg vervolgens 16,5 µL koude cytoplasmatische extractie-oplossing toe, vortex vijf seconden en incubeer het monster vijf minuten op ijs. Vortex het extract vijf seconden en centrifugeer het monster bij 16 000 ×g en 4 °C gedurende vijf minuten. Draag het supernatant over naar een nieuwe, vooraf gekoelde buis en bewaar dit op ijs tot gebruik; was vervolgens de onoplosbare pellets drie keer met 1 mL koude PBS door herhaaldelijk te pipetteren en de PBS na elke wasbeurt te verwijderen.Voeg vervolgens 150 µL koude nucleaire extractie-oplossing toe, vortex 15 seconden en incubeer gedurende één uur op ijs. Vortex het monster elke 10 minuten tijdens de incubatie 15 seconden en pipetteer de oplossing 10 keer met een 200 µL tip. Vortex de buis 15 seconden en centrifugeer het monster bij 16.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten; breng vervolgens het supernatant dat het nucleaire extract bevat over in een nieuwe, vooraf gekoelde buis en bewaar deze op ijs tot gebruik.Verwijder telkens 10% van het volume van de nucleaire en cytoplasmatische extracten als inputs, en voeg vervolgens koud PBS toe aan de overgebleven extracten tot een eindvolume van één milliliter. Bewaar op ijs tot gebruik. Combineer, indien nodig na het preclearen van de met proteïne G geconjugeerde magnetische beads, 40 µL met proteïne G geconjugeerde magnetische beads met vier µg rapid polyklonaal anti-RBM3 antilichaam, of rapid IGG als negatieve controle in 200 µL PBST.Incubeer tot kamertemperatuur op een rotator gedurende 40 minuten. Plaats de buisjes in een magnetisch rek, verwijder vervolgens het supernatant en gooi dit weg. Was de beads daarna één keer met 200 µL PBST.Voeg één milliliter verdunde lysaten toe aan de beads en incubeer deze op een rotator bij vier graden Celsius gedurende de nacht. Plaats de buisjes de volgende dag in het magnetisch rek en aspireer het supernatant. Voeg 0,5 milliliter PBST toe aan de beads en was deze drie keer op een rotator bij vier graden Celsius, met een vaste snelheid van 20 rpm gedurende 10 minuten.Elueer het eiwit van de beads door 40 µL monsterbuffer toe te voegen en verhit het monster vervolgens 10 minuten lang bij 70 °C. Centrifugeer de beads en breng de vloeistof over naar een nieuwe buis van 1,5 mL. Om immunocytochemie uit te voeren, worden HEK293-cellen gezaaid met een dichtheid van 1,5 × 10⁴ cellen per kamer in een eight-chamber slide die gecoat is met poly-L-lysine.In 0,4 milliliters DMEM aangevuld met 10% FPS en 100 units per milliliter penstrep. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur, aspireer vervolgens het medium en gebruik 4% PFA om de cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten te fixeren in een laminaire flowkast. Aspireer daarna de PFA en gebruik 0,5 milliliters PBS per chamber om de cellen drie keer te wassen.Voeg 0,5%tritonX100 met 5%NGS en PBS toe om de cellen te permeabiliseren en te blokkeren en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens, nadat de anti NF90 monoklonale en anti RBM3 polyklonale primaire antilichamen 1:100 zijn verdund, de primaire antilichamen toe aan de wells en incubeer deze overnight op de shaker bij vier graden Celsius. Was de kamers de volgende dag drie keer gedurende telkens 10 minuten met 0,5 milliliters PBS.Om immunocytochemie uit te voeren, voegt u een verdunning van 1:500 van groen fluorescerende kleurstof-geconjugeerde anti-muis- en rood fluorescerende kleurstof-geconjugeerde anti-konijnantilichamen toe aan de cellen en incubeert u deze gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg een verdunning van 1:5.000 van DAPHE NBPS toe om de kernen tegen te kleuren en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, waarna de monsters zoals voorheen met PBS worden gewassen. Verwijder de kamers van de glazen objectglas en droog deze, voordat u 250 µL monteermedium per objectglas gebruikt om ze te monteren.Om probes voor de proximity ligation assay in buisjes voor te bereiden, verdunt u na het incuberen van de cellen en primaire antilichamen, en het wassen zoals zojuist gedemonstreerd, de vooraf gemaakte probes 1:5 in 0,1% tritonx100, 5% NGS en PBS, in een totaalvolume van 320 µL voor één slide met acht kamers. Incubeer de oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de kamers van de glazen zijde en voeg de verdunde probes toe, en incubeer de kamers vervolgens in een vochtigheidsincubator bij 37 °C gedurende één uur.Bereid een ligatie-oplossing door acht µL ligase, 64 µL 5x ligatie-stock en 248 µL water te mengen. Tik de vloeistof van de slide af en gebruik onex wasbuffer A om de monsters twee keer gedurende vijf minuten te wassen. Voeg de ligatie-oplossing toe aan de monsters en incubeer deze in een bevochtigingsincubator bij 37 °C gedurende 30 minuten.Bereid de amplificatieoplossing voor door vier µL polymerase, 64 µL 5x amplificatievoorraad en 252 µL water te mengen, en wikkel de buis in folie om deze tegen licht te beschermen. Tap vervolgens de vloeistof van de objectglas af en gebruik 1x wasbuffer A om de monsters twee keer te wassen gedurende telkens twee minuten. Voeg de amplificatieoplossing toe aan de monsters en incubeer deze gedurende 100 minuten bij 37 °C in een donkere, vochtige incubator.Tap vervolgens de vloeistof op zoals voorheen en was de monsters twee keer gedurende 10 minuten in wasbuffer B, gevolgd door één keer wassen in 0,1 x wasbuffer B. Droog tot slot het preparaat en monteer de monsters met 250 microliters commercieel monteermedium met DAPHE, examineer de fluorescentie onder een microscoop en leg beelden vast met een CCD-camera. Co-immunoprecipitatie-experimenten met RBM3 als bait-eiwit toonden aan dat NF90-RBM3-interacties hoofdzakelijk in de nucleus aanwezig zijn en een minderheid in het cytoplasma wordt aangetroffen. In dit immunofluorescentie-experiment zijn zowel NF90 als RBM3 in de nucleus zichtbaar.Beide eiwitten zijn in C2 ook aangetroffen in het cytoplasma, en beide eiwitten vertonen een perfecte colocalisatie in elk compartiment. Zoals in deze afbeeldingen te zien is, onthulde de proximity ligation assay het patroon van NF90-RBM3-interacties, dat zeer vergelijkbaar is met conventionele immunocytochemie, waarbij de meeste interacties in de nucleus van de meeste cellen plaatsvinden. Slechts een klein percentage van de cellen vertoonde een overwegend cytoplasmatische distributie van NF90-RBM3-interacties.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat PLA, hoewel handiger, eiwit-eiwitinteracties niet direct weerspiegelt. Co-ip detecteert daarentegen gerichte interacties. Daarnaast bepaalt de specificiteit van het primaire antilichaam de kwaliteit van het resultaat.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u, afhankelijk van uw eigen experimentele doel, een geschikte methode kiest om proteïne-proteïne-interacties in verschillende cellulaire compartimenten te bestuderen.

visualization-protein-protein-interaction-nuclear-cytoplasmic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

This video describes the proximity ligation assay to study in situ protein-protein interactions in nematode cells. The close proximity of the proteins of interest generates the circular DNA template with the help of a PLA probe attached to a secondary antibody. The probe is further amplified using the amplification solution, which produces a long single-stranded DNA followed by the hybridization of the detector probe, enabling the localization of protein-protein interactions in cells.

Proximity Ligation Assay to Study In Situ Protein-Protein Interactions

We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) gebruikt Flowcytometrie voor gevoelige detectie van verschillen in de overvloed van gerichte eiwit-eiwit interacties tussen twee monsters. QMI kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid biomateriaal, vereist geen genetisch gemanipuleerde Tags en kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk.

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Cognate J-Domain eiwitten werken samen met de Hsp70 chaperonne om te helpen bij een groot aantal biologische processen, variërend van eiwit vouwen tot afbraak. Hier beschrijven we een in-situ proximity ligatie test, die het mogelijk maakt om deze transitieve gevormde chaperonne machinerie in bacteriële, gist en menselijke cellen te monitoren.

In situ monitoring van transitieve gevormde moleculaire Chaperone-assemblages in bacteriën, gist en menselijke cellen

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Dit protocol toont het gebruik van de nabijheidsligatietest om te sonde voor eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans kiembaan.

In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

De behoefte aan nieuwe benaderingen voor het bestuderen van membraancontactplaatsen (MCS'en) is gegroeid als gevolg van de toenemende interesse in het bestuderen van deze cellulaire structuren en hun componenten. Hier presenteren we een protocol dat eerder beschikbare microscopietechnologieën integreert om intra-organel en inter-organel eiwitcomplexen die zich in MCS'en bevinden te identificeren en te kwantificeren.

Visualisatie en kwantificering van endogene intra-organeleiwitinteracties op ER-mitochondriale contactlocaties door nabijheidsligatietests

Eiwit-eiwitinteracties zijn belangrijk voor het ophelderen van de functie van doeleiwitten, en co-immunoprecipitatie (co-IP) kan PPI's gemakkelijk bevestigen. We transfecteerden tijdelijk een plasmide dat codeert voor een epitoop-gelabeld eiwit in HEK-293-cellen en ontwikkelden een immunoprecipitatiemethode om de binding van twee doeleiwitten gemakkelijk te bevestigen.

Immunoprecipitatie met een Anti-Epitope Tag Affinity Gel om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen

Leer co-immunoprecipitatie en proximity ligation assay vergelijken voor eiwit-eiwit interacties in kern en cytoplasma met HEK293-cellen. Deze methoden helpen onderzoekers bij het selecteren van de juiste techniek.

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en In Situ Proximity Ligatie Assay (Video) | JoVE Journal

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en

Meer video's verkennen