Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en In Situ Proximity Ligatie Assay

Het algemene doel van dit experiment is om de voor- en nadelen van co-immunoprecipitatie, of co-ip, en de proximity ligatie assay, of pla, te vergelijken bij het visualiseren van eiwit-eiwit interacties in verschillende cellulaire compartimenten. De hier gepresenteerde vergelijking van twee verschillende methoden kan wetenschappers helpen om te beslissen welke het best geschikt is voor hun specifieke doel bij het onderzoeken van de verdelingspatronen van eiwit-eiwit interacties in de kern en het cytoplasma van een cel. Het belangrijkste voordeel van co-ip is om authentieke eiwit-eiwit interacties te detecteren.

Daartegenover staat dat het voordeel van pla is om eiwit-eiwit interacties in een snelle manier op het niveau van één cel te analyseren. Na het kweken en oogsten van hex293 cellen volgens het tekstprotocol, tot 3 keer 10 tot de 6e cellen, voeg 300 microliters koude cytoplasmatische extractieoplossing toe, en vortex de cellen op de hoogste snelheid gedurende 15 seconden. Incubeer het extract op ijs gedurende 30 minuten, en vortex het monster elke 10 minuten tijdens de incubatie gedurende vijf seconden.

Voeg vervolgens 16,5 microliters koude cytoplasmatische extractieoplossing toe, vortex gedurende vijf seconden en incubeer het monster op ijs gedurende vijf minuten. Vortex het extract gedurende vijf seconden en centrifugeer het monster bij 16.000 x g en 4 graden Celsius gedurende vijf minuten. Breng het supernatant over in een nieuw voorgekoeld buisje en houd het op ijs tot gebruik, gebruik vervolgens één milliliter koud PBS om de onoplosbare pellets drie keer te wassen door op en neer te pipetteren en verwijder het PBS na elke wasbeurt.

Voeg vervolgens 150 microliters koude nucleaire extractieoplossing toe, vortex gedurende 15 seconden en incubeer op ijs gedurende één uur. Elke 10 minuten tijdens de incubatie, vortex het monster gedurende 15 seconden en gebruik een 200 microliter tip om de oplossing 10 keer te pipetteren. Vortex het buisje gedurende 15 seconden en centrifugeer het monster bij 16.000 x g bij 4 graden Celsius gedurende 10 minuten, breng vervolgens het supernatant met het nucleaire extract over in een nieuw voorgekoeld buisje en houd het op ijs tot gebruik.

Verwijder 10% van het volume van nucleaire en cytoplasmatische extracten als inputs, voeg vervolgens koud PBS toe aan de resterende extracten tot een eindvolume van één milliliter. Houd op ijs tot gebruik. Nadat de proteïne g geconjugeerde magnetische kralen indien nodig zijn voorgeklaard, combineer 40 microliters van proteïne g geconjugeerde magnetische kralen met vier microgram snel polyklonaal anti-RBM3 antilichaam, of snel IGG als negatieve controle in 200 microliters PBST.

Incubeer tot kamertemperatuur op een roter voor 40 minuten. Plaats de buisjes op een magnetische rack, verwijder en gooi het supernatant. Was vervolgens de kralen met 200 microliters PBST eenmaal.

Voeg een milliliter verdunde lisaten toe aan de kralen en incubeer op een roter bij vier graden Celsius gedurende de nacht. De volgende dag, plaats de buisjes op de magnetische rack en aspireer het supernatant. Voeg 0,5 milliliter PBST toe aan de kralen en was ze drie keer op een roter bij vier graden Celsius, met een vaste snelheid van 20 tpm gedurende 10 minuten.

Elueer het eiwit van de kralen door 40 microliters monsterstof toe te voegen, verwarm vervolgens het monster gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius. Na het centrifugeren van de kralen, breng het vocht over in een nieuw 1,5 milliliter buisje. Om immunocytische chemie uit te voeren, zaai HEK293 cellen bij 1,5 keer 10 tot de vierde cel per kamer in een achtkamerige polydelysine gecoate glijbaan.

In 0,4 milliliter DMEM gesupplementeerd met 10%FPS en 100 eenheden per milliliter penstrep. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5%kooldioxide gedurende 48 uur, aspireer vervolgens het medium en gebruik 4%PFA om de cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een laminare flowkast te fixeren. Aspireer vervolgens de PFA en gebruik 0,5 milliliter PBS per kamer om de cellen drie keer te wassen.

Voeg 0,5%tritonX100 met 5%NGS en PBS toe om de cellen permeabel te maken en te blokkeren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende één uur. Vervolgens, na het verdunnen van anti NF90 monoklonaal en anti RBM3 polyklonaal primaire antilichamen een op honderd, voeg primaire antilichamen toe aan de putjes en incubeer op de shaker bij vier graden Celsius gedurende de nacht. De volgende dag, gebruik 0,5 milliliter PBS om de kamers drie keer voor 10 minuten elk te wassen.

Om immunocytische chemie uit te voeren, voeg een een op vijfhonderd verdunning van groen fluorescerend kleurstof gekoppelde antimuis en rood fluorescerend kleurstof gekoppelde antikonijn antilichamen toe aan de cellen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende één uur. Voeg een een op vijfduizend verdunning van DAPHE NBPS toe om de kernen tegen te kleuren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, was vervolgens de monsters met PBS zoals eerder. Verwijder de kamers van de glazen glijbaan en droog ze. Gebruik vóór het gebruik van 250 microliters montagemedium per glijbaan om ze te monteren.

Om buisproximiteit ligatie assay sondes voor te bereiden, verdun na het incuberen van cellen en primaire antilichamen en wassen zoals zojuist aangetoond, de voorbereide sondes een op vijf in 0,1%tritonx100 en 5%NGS en PBS, in een totaal volume van 320 microliters voor één achtkamerige glijbaan. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Verwijder de kamers van de glazen zijde en voeg de verdunde sondes toe, vervolgens incubeer de kamers in een vochtigheids incubator bij 37 graden Celsius gedurende één uur.

Bereid een ligatieoplossing voor door acht microliters ligase, 64 microliters 5x ligatie stock en 248 microliters water te mengen. Tap het vocht van de glijbaan en gebruik een x wasbuffer A om de monsters twee keer gedurende vijf minuten elk te wassen