Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Het algemene doel van deze procedure is om de niveaus van mRNA in individuele cellen te kwantificeren met behulp van microfluïdische qPCR met interne standaarden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van enkelcellig onderzoek, zoals of celpopulaties van cellen op een karakteristiek verschillende manieren reageren op een stimulus. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de expressie van meer genen kan meten dan RNA FISH tegen lagere kosten dan RNA-Seq in enkele cellen.

We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we protocollen onderzochten om genexpressie in enkele cellen te meten door microfluïdische qPCR. We wilden bestaande methoden aanpassen om het absolute aantal verschillende transcripten in enkele cellen nauwkeuriger te schatten. Het demonstreren van de celsorteerprocedure zal worden gedaan door William Telford, de manager van de flowcytometriefaciliteit die door mijn lab wordt gebruikt.

Na het genereren en zuiveren van amplicons van genen van belang volgens het tekstprotocol, combineer 18 microliters van elk gezuiverd amplicon in een 2,0 milliliter lage binding microcentrifugebuis, voeg dan DNA-suspensiebuffer toe tot 1.800 microliters zodat de concentratie van elk amplicon vijf keer 10 tot de zesde moleculen per microliter is. Vortex de 5e6 standaard grondig en verdeel deze in 20 microliter porties in lage binding PCR buizen. Na het plateren van MCF7 p53-Venus cellen volgens het tekstprotocol, voeg 400 nanogram per milliliter neocarzinostatin toe aan de cellen en behandel ze gedurende drie, 8,5, 14 of 24 uur.

Om lysisbuffer te maken, combineer de reagentia die in deze tabel zijn vermeld. Breng 92,4 microliters van de buffer over naar een afzonderlijke buis om te dienen als lysisbuffer voor de amplicon standaarden. De resterende lysisbuffer zal voor de cellen zijn.

Bereid en voeg E.coli DNA toe aan de lysisbuffer voor de cellen, volgens het tekstprotocol. Om standaarden voor te bereiden, label zes lage binding centrifugebuizen. Voeg 90 microliters DNA-suspensiebuffer toe aan de 5e5 buis.

Voeg 90 microliters buffer toe die 6,2 picogram per microliter E.coli DNA bevat aan elk van de andere vijf buizen en houd alle buizen op ijs. Nadat u een aliquot van de 5e6 standaard uit de opslag hebt verwijderd, vortex de buis kort, draai deze vervolgens om ervoor te zorgen dat de vloeistof zich op de bodem van de buis bevindt, en voeg vervolgens met behulp van een lage binding pipettetip 10 microliters van de 5e6 standaard toe aan de 5e5 buis. Vortex, draai en zet de buis terug op ijs.

Pipetteer vervolgens 10 microliters van de 5e5 buis in de 5e4 buis, vortex de buis kort, draai deze en zet de buis terug op ijs. Herhaal de seriële verdunning met elke buis, ontvang 10 microliters van de vorige buis totdat alle buizen een verdunning van standaard hebben. Na het voorbereiden van PCR buizen met lysisbuffer, verdeel met behulp van een 12-kanaals pipetteerder negen microliters cel lysis buffer van de rij van PCR buizen in elke put van de eerste zeven rijen van een PCR plaat.

Verdeel zeven microliters standaard lysis buffer in elke put van de laatste rij van de plaat, en voeg vervolgens met behulp van lage binding pipettetips twee microliters standaard toe aan elke put van de onderste rij volgens het plaatkaart. Voeg twee microliters van 3,1 picogram per microliter E.coli DNA toe aan de 10 cel en 100 cel putten, en voeg vervolgens twee microliters van 6,2 picogram per microliter E.coli DNA toe aan de geen cel putten. Nadat u de fluorescentie geactiveerde celsorteerder hebt geprogrammeerd om in een 96-welplate te sorteren volgens het plaatkaart, om de machine te richten, verzegel een lege PCR plaat en gebruik de teststroom om druppels en PBS op de verzegeling van de lege plaat te sorteren.

Als de druppels niet op de juiste positie landen, veeg ze dan van het oppervlak van de verzegeling, kalibreer de celsorteerder opnieuw volgens de instructies van de machinefabrikant en herhaal dit tot de druppels in de sorteerstroom correct worden afgezet. Oogst cellen door trypsinisatie en schors ze opnieuw op in 0,5 milliliter PBS met 2%FBS, en breng ze vervolgens over naar een flowcytometriebuis. Om cellen te sorteren, steekt u de buis met de celsuspensie in de celsorteerder, opent u de verzegeling op de plaat van lysisbuffer en sorteert u de cellen van belang zorgvuldig in de plaat volgens het plaatkaart.

Om ervoor te zorgen dat enkele cellen met maximale zuiverheid worden gesorteerd, laat u de machine in de enkele celmodus draaien en gebruikt u standaard flowcytometrie gating op basis van voorwaarts en zijwaarts verstrooiing. Gebruik na de run een nieuwe steriele thermische verzegeling om de plaat te verzegelen en centrifugeer deze gedurende 400 keer g gedurende vier graden Celsius gedurende één minuut, plaats vervolgens de plaat in de thermische cyclus en voert u het eerder voorbereide RT-STA programma uit. Nadat u de voltooide RT-STA plaat hebt gecentrifugeerd, gebruikt u een 12-kanaals pipetteerder om 3,6 microliters van verdunde exonuclease I te verdelen in elke put van de plaat.

Verzegeld en draait u de plaat kort, plaatst u de plaat vervolgens in de thermische cyclus en voert u het exo I programma uit. Om de expressie van het huishoudgen in elk monster te meten, bereidt u 900 microliters DNA-bindend kleurstof qPCR mastermix voor 96 reacties voor met behulp van primers van een van de geselecteerde huishoudgenen. Verdeel negen microliters van de mastermix in elke put van een 96-wel PCR plaat, en voeg vervolgens één microliter van het monster van de monstersplaat toe aan de overeenkomstige put van de PCR plaat.

Laat de plaat draaien op een real-time PCR machine met behulp van een thermische cyclusprotocol dat wordt voorgesteld door de mastermixfabrikant of volgens een standaardprotocol, en analyseer vervolgens de monsters en maak een monstersmix plaatkaart volgens het tekstprotocol. Label een plaat monstersmix en verdeel vervolgens met behulp van een achtkanaals pipetteerder 3,3 microliters van de monstersmix