Name: Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Leer eencellige genexpressieprofilering met FACS en qPCR met interne standaarden voor het kwantificeren van mRNA-niveaus. Deze methode biedt een kosteneffectief alternatief voor RNA-Seq met nauwkeurige transcripttellingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag bedanken V. Kapoor in de CCR ETIB Flow Cytometry Core voor haar hulp bij het uitvoeren van de cel sortering tijdens de ontwikkeling van dit protocol. We danken ook M. Raffeld en de CCR LP Moleculaire Diagnostiek Unit en J. Zhu en de NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core voor hun hulp bij het uitvoeren van de qPCR tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Program van de NIH.

<ol><li>Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+Robustness+in+T+Cell+Activation+from+Regulated+Heterogeneity+in+Protein+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels.</a> Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+variability+in+the+p53+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oscillations and variability in the p53 system.</a> Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Transcriptional+Bursting+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).</li>
<li>Senecal, A., Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Factors+Modulate+c-Fos+Transcriptional+Bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+control+of+expression+mean+and+variance+by+epigenetic+features+at+different+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci.</a> Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).</li>
<li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li>
<li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li>
<li>Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Pulses+Diversify+Target+Gene+Expression+Dynamics+in+an+mRNA+Half-Life-Dependent+Manner+and+Delineate+Co-regulated+Target+Gene+Subnetworks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks.</a> Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).</li>
<li>Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+p53-Mdm2+feedback+loop+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells.</a> Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).</li>
<li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+30+years+of+p53%3A+growing+ever+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li>
<li>Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+human+p53-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of human p53-regulated genes.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/pcr-technologies-guide.pdf">PCR Technologies: A Technical Guide</a>. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).</li>
<li>Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+initiation%3A+a+mechanism+for+triggering+p53+pulses+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage.</a> Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Flow+Cytometry%3A+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry: Principles and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Real-time+PCR%22">Real-time PCR</a>. , Taylor & Francis. (2006).</li>
<li>Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+co-expression+measures%3A+mutual+information%2C+correlation%2C+and+model+based+indices%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).</li>
<li>Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARACNE%3A+An+Algorithm+for+the+Reconstruction+of+Gene+Regulatory+Networks+in+a+Mammalian+Cellular+Context%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context.</a> BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).</li>
<li>Haff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitative+PCR+using+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Improved quantitative PCR using nested primers.</a> PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).</li>
<li>Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biol. 17, 77(2016).</li>
<li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben voorgesteld een werkwijze voor het isoleren van afzonderlijke zoogdiercellen van een populatie van hechtende cellen gekweekt in kweek en voor het testen van de expressie van ongeveer 96 genen in elke cel. Goede voorbereiding vooraf is essentieel voor deze methode goed te werken. Vooral ontwikkelen en testen primerparen die specifiek zijn voor de transcripten van belang (stap 1,2-1,3) tijdrovend maar belangrijke stappen, zoals de primers bepaalt de kwaliteit van de eencellige metingen. Zodra betrouwbare primerp...

Afzonderlijke cellen in een populatie kan sterk verschillende reacties op een uniforme fysiologische stimulus 1, 2, 3, 4 vertonen. De genetische variatie van cellen in een populatie is één mechanisme voor deze verschillende reacties, maar er zijn ook een aantal niet-genetische factoren die de variabiliteit van de reacties kan verhogen, zelfs in een klonale populatie van cellen. Bijvoorbeeld kan de hoeveelheid melk eiwitten en andere belangrijke signaalmoleculen afhankelijk van een cel per cel basis, hetgeen leidt tot variatie in stroomafwaartse genexpressieprofielen. Bovendien kan genactivatie optreden bij kortdurende uitbarstingen van transcripten 5, 6 die kan worden beperkt tot een relatief klein aantal transcripten per burst 7, 8, 9. zodanigstochasticity in genactivering kan aanzienlijk bijdragen tot variabiliteit in biologische reacties en een selectief voordeel verschaffen in microörganismen 10 en zoogdiercellen 1, 2 reageert op een fysiologische stimulus. Door zowel genetische en niet-genetische bronnen van variatie, kan het genexpressie profiel van elke bepaalde cel in reactie op een stimulus sterk afwijken van de gemiddelde genexpressieprofiel verkregen uit de meting van de massa respons. Vaststelling van de mate waarin individuele cellen geven variabiliteit in reactie op een stimulus vereist technieken voor isolatie van afzonderlijke cellen, het meten van de expressieniveaus van transcripten van belang en de geautomatiseerde analyse van de resulterende expressieplasmide gegevens. Er zijn verschillende manieren voor het bepalen van genexpressie in enkele cellen, die een breed scala van kosten, het aantal transcripten gesondeerd ennauwkeurigheid van de kwantificering. Bijvoorbeeld eencellige RNA-Seq biedt een grotere scherptediepte transcript dekking en het vermogen om duizenden verschillende transcripten voor de hoogst uitgedrukte genen in individuele cellen te kwantificeren; echter kunnen de kosten voor een dergelijke sequentie diepte onbetaalbaar, maar kosten blijven dalen. Omgekeerd, enkel-molecuul RNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH smRNA) biedt nauwkeurige kwantificering van transcripten voor zelfs low-genen tot expressie tegen een redelijke prijs per gen van belang; echter, kan slechts een klein aantal doelgenen worden getest in een bepaalde cel van deze benadering. Kwantitatieve PCR-gebaseerde testen beschreven in dit protocol, te midden tussen deze technieken. Deze assays maken gebruik van een microfluïdische real-time PCR machine te kwantificeren 96 transcripten plaats in een tijd tot 96 cellen. Terwijl elk van de bovengenoemde methoden heeft hardwarefuncties, de kosten van elke afzonderlijke qPCR assay relatieflaag. Dit protocol is een bewerking van een door een fabrikant van een microfluïdische real-time PCR machine (Protocol ADP 41, Fluidigm) voorgesteld. Om de schatting van het absolute aantal van elke transcript in een PCR-gebaseerde aanpak mogelijk te maken, hebben we het protocol om gebruik te maken van de interne controle van bereide target-gen amplicons die over meerdere experimenten kan worden gebruikt maken uitgebreid. Als voorbeeld van deze techniek wordt de kwantificering van de expressie van genen gereguleerd door de tumorsuppressor p53 in MCF-7 humane borstcarcinoomcellen 11 beschreven. De cellen worden blootgesteld aan een chemisch agens dat DNA dubbelstrengige breuken induceert. Eerdere studies hebben aangetoond dat de p53 respons op DNA dubbelstrengs breuken vertoont veel heterogeniteit in individuele cellen, zowel wat p53 niveaus 12 en bij de activering van verschillende doelgenen 11. Bovendien p53 regelt de expressie van meer dan 100goed gekarakteriseerde target genen betrokken bij tal stroomafwaartse paden, zoals celcyclus, apoptose, senescentie en 13, 14. Aangezien de p53-gemedieerde respons in elke cel is complex en variabel, de analyse van het systeem beschikt over een benadering waarbij bijna 100 doelgenen kan gelijktijdig geprobed in individuele cellen, zoals hieronder beschreven. Met kleine aanpassingen (zoals alternatieve methoden voor eencellige isolatie en lysis) Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala van zoogdier celtypen, transcripties en cellulaire reacties te bestuderen. Met een goede voorbereiding vooraf, kan een rondje celsortering en genexpressie metingen worden uitgevoerd volgens dit protocol over een periode van drie dagen. De volgende timing wordt voorgesteld: van tevoren, selecteert u de transcripties van belang, te identificeren en valideren van de primerparen dat de cDNA versterken van die transcrIPTS, en de voorbereiding van de normen en primer mixen met behulp van deze primers. Op dag 1 na celtherapie, oogst en de cellen te sorteren, voert reverse transcriptie en specifieke amplificatie en behandeling van de monsters met een exonuclease om niet opgenomen primers te verwijderen. Op dag 2, het uitvoeren van kwaliteitscontroles op gesorteerde cellen met behulp van qPCR. Tenslotte op dag 3, meet de genexpressie in de cellen gesorteerd met behulp microfluïdische qPCR. Figuur 1 vat de stappen betrokken.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>DNA Suspension Buffer</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample &amp; Assay Loading Reagent Kit</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 media</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Certified (US)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatin</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal Sealing Film, Sterile</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.05%</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC Controller HX (loading machine)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR Analysis software&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB software</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eencellige gene expression profiling met behulp van facs en qpcr met interne standaarden

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Meetingen van genexpressie van bulkpopulaties van cellen kunnen de aanzienlijke transcriptomische variatie van individuele cellen binnen die populaties verdoezelen. Metingen van genexpressie op enkele cellen kunnen helpen bij het beoordelen van de rol van ruis in genexpressie, het identificeren van correlaties in de expressie van paar genen en het onthullen van subpopulaties van cellen die anders reageren op een stimulus. Hier beschrijven we een procedure om de expressie van maximaal 96 genen te meten in enkele zoogdiercellen die zijn geïsoleerd uit een populatie die groeit in weefselkweek. Cellen worden door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gesorteerd in lysebuffer, en de mRNA-soorten van belang worden reverse-getranscripteerd en geamplificeerd. Genexpressie wordt vervolgens gemeten met behulp van een microfluïdische real-time PCR-machine, die maximaal 96 qPCR-assays uitvoert op maximaal 96 monsters tegelijk. We beschrijven ook het genereren en gebruik van PCR-ampliconstandaarden om de schatting van het absolute aantal van elk transcript mogelijk te maken. In vergelijking met andere methoden om genexpressie in enkele cellen te meten, maakt deze aanpak de kwantificering van meer verschillende transcripten mogelijk dan RNA FISH tegen een lagere kostprijs dan RNA-Seq.

Een algemeen overzicht van het protocol wordt weergegeven in figuur 1, inclusief stappen voor celtherapie, het isoleren van afzonderlijke cellen door FACS, het genereren en pre-amplificatie van cDNA-bibliotheken van eencellige lysaten, de bevestiging van eencellige cDNA bibliotheken gesorteerde putten, en de meting van genexpressie door qPCR. Ter voorbereiding van eencellige isolatie en genexpressie-analyse, i...

We beschrijven een methode om enkele zoogdiercellen te sorteren en om de expressie van maximaal 96 doelgenen van belang in elke cel te kwantificeren. Deze methode omvat het gebruik van interne qPCR-standaarden om de schatting van absolute transcripttellingen mogelijk te maken.

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van de mRNA-niveaus in individuele cellen met behulp van microfluidische qPCR met interne standaarden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de single-cell biologie, zoals de vraag of celpopulaties op een karakteristiek verschillende manier reageren op een stimulus. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er de expressie van meer genen kan worden gemeten dan met RNA-FISH, tegen lagere kosten dan met RNA-Seq in individuele cellen.We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we protocollen onderzochten om genexpressie in enkelvoudige cellen te meten via microfluïdische qPCR. We wilden bestaande methoden aanpassen om het absolute aantal verschillende transcripten in enkelvoudige cellen nauwkeuriger te schatten. De procedure voor het sorteren van cellen zal worden gedemonstreerd door William Telford, de manager van de flowcytometrie-faciliteit die door mijn laboratorium wordt gebruikt.Nadat de amplicons van de genen van belang zijn gegenereerd en gezuiverd volgens het tekstprotocol, combineert u 18 µL van elk gezuiverd amplicon in een low-binding microcentrifugebuis van 2,0 mL, en voegt u vervolgens DNA-suspensiebuffer toe tot 1.800 µL, zodat de concentratie van elk amplicon 5 × 10⁶ moleculen per µL is. Vortex de 5e6-standaard grondig en verdeel deze in aliquots van 20 µL in low-binding PCR-buisjes. Nadat de MCF7 p53-Venus-cellen zijn uitgeplaat volgens het tekstprotocol, voegt u 400 ng/mL neocarzinostatine toe aan de cellen en behandelt u deze gedurende 3, 8,5, 14 of 24 uur.Om lysisbuffer te maken, combineert u de reagentia die in deze tabel staan vermeld. Breng 92,4 µL van de buffer over naar een aparte buis om te dienen als lysisbuffer voor de ampliconstandaarden. De resterende lysisbuffer is bedoeld voor de cellen.Bereid E.coli DNA voor en voeg dit toe aan de lysisbuffer voor de cellen, volgens het tekstprotocol. Om standaarden voor te bereiden, labelt u zes centrifugebuisjes met een lage bindingscapaciteit. Voeg 90 µL DNA-suspensiebuffer toe aan de 5e5-buis.Voeg 90 µL buffer met 6,2 pg/µL E.coli DNA toe aan elk van de overige vijf buisjes en houd alle buisjes op ijs. Nadat een aliquot van de 5e6 standaard uit de opslag is gehaald, wordt het buisje kort gevortexd en vervolgens gecentrifugeerd om te garanderen dat de vloeistof zich onderin het buisje bevindt; voeg vervolgens met een low-binding pipetpunt 10 µL van de 5e6 standaard toe aan het 5e5 buisje. Vortex, centrifugeer en plaats het buisje terug op ijs.Pipette vervolgens 10 µL uit de 5e5-buis in de 5e4-buis, vortex de buis kort, centrifugeer deze en plaats de buis terug op ijs. Herhaal de seriële verdunningen voor elke buis door 10 µL uit de vorige buis over te brengen, totdat alle buizen een verdunning van de standaard bevatten. Nadat de PCR-buisjes met lysisbuffer zijn voorbereid, worden met een 12-kanaals pipette negen µL cellysisbuffer uit de rij PCR-buisjes verdeeld over elke well van de eerste zeven rijen van een PCR-plaat.Verdeel zeven µL standaard lysisbuffer over elke well van de laatste rij van de plaat; voeg vervolgens met low-binding pipetpunten twee µL standaard toe aan elke well van de onderste rij volgens de plaatkaart. Voeg twee µL van 3,1 pg/µL E.coli DNA toe aan de 10-cel en 100-cel wells, en voeg vervolgens twee µL van 6,2 pg/µL E.coli DNA toe aan de wells zonder cellen. Nadat de fluorescence activated cell sorter is geprogrammeerd om te sorteren in een 96-well plaat volgens de plaatkaart, dient de machine te worden gericht door een lege PCR-plaat af te sluiten en de teststroom te gebruiken om druppels en PBS op de afsluiting van de lege plaat te sorteren.Als de druppels niet op de juiste positie landen, veeg deze dan van het oppervlak van de afdichting af, kalibreer de cel sorter opnieuw volgens de instructies van de fabrikant van het apparaat en herhaal dit totdat de druppels in de sorteerstroom correct worden afgezet. Oogst de cellen door trypsinisatie en resuspendeer ze in 0,5 milliliters PBS met 2%FBS, en breng ze vervolgens over naar een flowcytometrie-buis. Om de cellen te sorteren, plaatst u de buis met de celsuspensie in de cel sorter, opent u de afdichting van de plaat met lysisbuffer en sorteert u de gewenste cellen zorgvuldig in de plaat volgens de plaatmap.Om ervoor te zorgen dat enkelvoudige cellen met maximale zuiverheid worden gesorteerd, dient de machine in de single cell-modus te worden bedreven en moet standaard flowcytometrie-gating worden gebruikt op basis van forward en side scatter. Gebruik na de run een nieuwe steriele thermische seal om de plaat af te sluiten en centrifugeer deze bij 400 ×g bij 4 °C gedurende één minuut; plaats de plaat vervolgens in de thermocycler en voer het eerder voorbereide RT-STA-programma uit. Na het centrifugeren van de voltooide RT-STA-plaat wordt een 12-kanaals pipet gebruikt om 3,6 µL verdunde exonuclease I over elke well van de plaat te verdelen.Sluis de plaat af en centrifugeer deze kort, plaats de plaat vervolgens in de thermocycler en voer het exo I-programma uit. Om de expressie van het housekeeping-gen in elk monster te meten, bereid 900 µL DNA-bindende kleurstof qPCR-mastermix voor 96 reacties voor met primers van een van de geselecteerde housekeeping-genen. Verdeel negen µL mastermix over elke well van een 96-well PCR-plaat en voeg vervolgens één µL monster van de monsterplaat toe aan de overeenkomstige well van de PCR-plaat.Voer de plaat uit op een real-time PCR-apparaat met een thermisch cyclusprotocol dat is voorgesteld door de fabrikant van de mastermix of volgens een standaardprotocol, analyseer vervolgens de monsters en maak een plaatkaart voor monstermengsels op basis van het tekstprotocol. Label een plaat als monstermengsels en verdeel vervolgens, met behulp van een achtkanalenpipet, 3,3 µL van het mengsel van mastermix en monsterlaadreagens over elke put van een 96-well PCR-plaat. Vortex elke PCR-plaat met monsters gedurende 10 seconden en centrifugeer deze op 500 ×g gedurende 10 seconden.Verwijder de afdekking en breng 2,7 µL van elk positief één-celmonster over naar de overeenkomstige put op de plaat met monstermengsels voor de één-celputs die op de plaatkaart zijn aangegeven. Verwijder de sticker van de onderkant van een nieuwe microfluïdische qPCR-chip en druk vervolgens, met een spuit met controlelijn-vloeistof terwijl de dop er nog op zit, elke accumulatieveer naar beneden om deze los te maken en injecteer elke accumulator met 100 tot 200 µL controlelijn-vloeistof. Plaats de chip in de laadmachine en voer het prime-script uit, en breng vervolgens met een achtkanals pipet 4,5 µL van elk assay-mengsel over naar de linkerkant van de microfluïdische qPCR-chip.Het is essentieel om te voorkomen dat er luchtbellen onderin de wells ontstaan. Dit zal leiden tot problemen bij het laden. Om dit te voorkomen, raakt u met de pipetpunt de zijkant van de well aan en pipetteert u vervolgens alleen tot de eerste stop.Breng 4,5 µL van elk monster-mengsel over naar de rechterkant van de microfluidische qPCR-chip, plaats de chip vervolgens in de laadmachine en voer het 'load mix'-script uit. Wanneer het 'load mix'-script is voltooid, controleer dan of er geen strepen over de chip lopen, wat zou duiden op een laadprobleem; gebruik vervolgens plakband om voorzichtig eventuele stofdeeltjes van de chip te verwijderen, plaats de chip in de microfluidische real-time PCR-machine en voer het script voor gegevensverzameling uit. Analyseer ten slotte de gegevens volgens het tekstprotocol.Deze figuur laat de expressieniveaus zien van een housekeeping-gen gemeten via qPCR om te bepalen in welke wells een enkele cel is terechtgekomen. Monsters die een cel bevatten, vertonen lage CT-waarden. Monsters zonder cel vertonen veel hogere CT-waarden.De putjes voor de ampliconstandaard moeten gelijkmatig verdeelde amplificatiecurven vertonen. Er moet daarnaast een duidelijke scheiding zijn in de curven voor de putjes zonder cellen, met 10 cellen en met 100 cellen. Seed-DNA-monsters die daadwerkelijke cellen vertegenwoordigen, worden selectief gekozen uit meerdere gesorteerde 96-wellplaten en samengevoegd in één enkele plaat ter voorbereiding op microfluïdische qPCR.Deze heat map vat de resultaten van de microfluidische qPCR samen. De kleurvariatie in elke kolom toont de variabiliteit in de expressie van elk gen tussen verschillende cellen. De twee rijen die veel donkerder zijn dan de rest, vertegenwoordigen zeer waarschijnlijk foutieve monsters.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uw werkgebied vrij te houden van RNase en DNA, vooral bij het maken van de standaarden en de lysisbuffer. De pre-PCR-stappen van dit protocol zijn gevoelig voor contaminatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de expressie van meerdere genen van belang in individuele cellen kunt kwantificeren.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals single molecule RNA FISH, worden uitgevoerd om metingen van de mRNA-abundantie in individuele cellen te valideren.

single-cell-gene-expression-profiling-using-facs-qpcr-with-internal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Enkele cel expressie profilering maakt een gedetailleerde analyse van genexpressie van individuele cellen. Beschrijven we methoden voor de isolatie van cardiomyocyten, en het voorbereiden van de daaruit voortvloeiende lysaten voor zowel hele transcriptoom microarray of qPCR van specifieke doelen.

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

Werkwijze voor het isoleren van een retinacellen en vervolgens amplificatie van de cDNA beschreven. Single-cell transcriptomics onthult de mate van cellulaire heterogeniteit aanwezig is in een tissue en onthult nieuwe marker-genen voor zeldzame celpopulaties. De bijbehorende protocol kan worden aangepast aan verschillende celtypen te passen.

Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.

Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

Enkele cel genexpressie test is noodzakelijk om inzicht stamcel heterogeniteiten.

Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

Ontworpen chromosomen van het Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, kunnen worden onderscheiden van hun natuurlijke tegenhangers met behulp van een PCR-gebaseerde genotyperingstest genaamd PCRTagging, die een aanwezigheid/afwezigheid-endpoint heeft. Hier beschrijven we een high-throughput real-time PCR detectiemethode voor PCRTag genotypering.

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Dit protocol beschrijft hoe de expressie van een groot scala van genen op het klonale niveau te beoordelen. Single-cell RT-qPCR levert zeer betrouwbare resultaten met een sterke gevoeligheid voor honderden monsters en genen.

Eencellige genexpressie met behulp van Multiplex RT-qPCR heterogeniteit van Rare lymfoïde populaties karakteriseren

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Deze methode beschrijft de stappen om de kwaliteit en kwantiteit van sequentiegegevens te verbeteren die kunnen worden verkregen uit formeel vaste paraffine-embedded (FFPE) RNA-monsters. We beschrijven de methodologie om de kwaliteit van FFPE-RNA-monsters nauwkeuriger te beoordelen, sequencingbibliotheken voor te bereiden en de gegevens van FFPE-RNA-monsters te analyseren.

Optimalisatie voor sequencing en analyse van gedegradeerde FFPE-RNA Samples

Single molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) is een methode om niveaus en lokalisatie van specifieke RNA's op het niveau van één cel nauwkeurig te kwantificeren. Hier rapporteren we onze gevalideerde laboratoriumprotocollen voor natte-bench verwerking, beeldvorming en beeldanalyse voor eencellige kwantificering van specifieke RNA's.

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Leer eencellige genexpressieprofilering met FACS en qPCR met interne standaarden voor het kwantificeren van mRNA-niveaus. Deze methode biedt een kosteneffectief alternatief voor RNA-Seq met nauwkeurige transcripttellingen.

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Meer video's verkennen