Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat
12 augustus 2017
Subretinal injectie is veel toegepast in preklinische studies van stamcel substitutietherapie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. In dit gevisualiseerde artikel beschrijven we een minder riskant, reproduceerbaar zijn en juist gewijzigd subretinal injectietechniek via de trans-scleral-benadering te leveren van cellen in de ogen van de rat.
Het algemene doel van deze video is om een reproduceerbare transsclerale subretinale injectietechniek te introduceren om humane retinale pigmentepitheel-, of RPE-cellen, in de subretinale ruimte van de ogen van knaagdieren te brengen met een minimaal risico op netvliesbeschadiging. Dit wordt bereikt door eerst een kleine incisie in de temporale conjunctiva achter de limbus te maken om het onderliggende sclera bloot te leggen. Vervolgens wordt een afgeschuinde 31-gauge insulinenaad gebruikt om het sclera-kerncomplex te doorboren door de naald 500 micron of ongeveer de helft van de punt in het weefsel in te brengen met de afgeschuinde zijde omhoog om een pilootgat te maken.
Vervolgens wordt een afgeschuinde 33-gauge injectienaad die aan een spuit is bevestigd, in het pilootgat geleid en op een specifieke hoek en diepte ingebracht, het injectiegat verzegelt zichzelf nadat de naald is teruggetrokken en er is geen naald of weefsellijm nodig. Degeneratieve retinopathieën bestaan uit een breed spectrum van ziekten die verschillende retinale celtypen betreffen. Wereldwijd komt de meest voorkomende ziekte, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, of AMD, voor bij ouderen en leidt tot permanente blindheid.
De pathologische veranderingen die optreden bij AMD omvatten een initiële degeneratie van retinale gepigmenteerde epitheliale cellen, of RPE. RPE-verlies leidt tot disfunctie of dood van retinale fluororeceptoren. Huidige farmacologische behandelingen voor vroegstadium AMD zijn beperkt tot het vertragen van de progressie of het verlichten van symptomen.
Dit in combinatie met een beperkt regeneratief potentieel van het netvlies betekent dat er geen effectieve behandeling is om het zicht te herstellen. Het Neural Stem Cell Institute heeft onlangs een populatie volwassen stamcellen geïdentificeerd in de RPE-celpopulatie. Deze cellen kunnen worden gebruikt als bron voor stamcelvervangende therapie.
Momenteel voert ons instituut preklinische studies uit om de werkzaamheid en veiligheid van RPE-stamceltransplantatietherapie in een degeneratief RPE-ratdiermodel te onderzoeken. In deze studie gebruiken we een transsclerale, subretinale injectietechniek om RPE-stamcellen in de ratogen te brengen, tussen de retinale en RPE-lagen. Onze methode is een eenvoudige en betrouwbare manier om cellen met succes in de subretinale ruimte te brengen.
U hebt de volgende reagentia en apparatuur nodig. 1% tropicamide en 2,5% fenylephrine, vers gemaakt van 10% fenylephrine, door het te verdunnen in steriele 0,9% saline op de dag van de operatie, worden gebruikt om de pupil te verwijden. Oogbespuiting wordt gebruikt om het oog te spoelen en het niet-geopereerde oog vochtig te houden.
Een oogsmeermiddel wordt gebruikt om het niet-geopereerde rechteroog vochtig te houden tijdens de operatie. 0,5% proparacaine wordt gebruikt als plaatselijke verdoving. Een oogsmeermiddel wordt gebruikt op het geopereerde linkeroog tijdens het OCT-scannen.
Een minimale hoeveelheid materiaal en apparatuur is nodig voor deze techniek. Gedetailleerde informatie over apparatuur en reagentia die in deze techniek worden gebruikt, is beschreven in het protocol. Een 10 microliter spuit wordt gebruikt om cellen te injecteren.
Voor de injectie monteren we eerst de injector en steriliseren het met ethanol. Plaats een steriele, 33-gauge afgeschuinde naald in de spuit en schroef deze stevig vast om de injector samen te stellen. Spoel de injector met 100% ethanol, vervolgens 70% ethanol en vervolgens gedeïoniseerd gedistilleerd water, achtereenvolgens vijf tot zes keer elk.
Markeer de injectornaald met een steriele zwarte marker op een positie 600 micron vanaf de punt van de naald. Plaats de injector op een micromanipulator voor injectiegebruik. Humane RPE-cellen worden bereid op de dag van de operatie en worden in ijswatermengsel bewaard.
Tritureer de celsuspensie voorzichtig en laad de injector met 1,2 microliter, de extra 0,2 microliter wordt gebruikt om injectieterugstroom te compenseren, om een volume van één microliter injectie te garanderen. Plaats de injector gevuld met de celsuspensie op de micromanipulator, of laat een assistent deze verticaal vasthouden, omdat RPE-cellen gemakkelijk in oplossingen zinken. Bereid het steriele chirurgische gebied voor door een steriele operatiepad met een verwarmingspad eronder op het podium van de dissectiemicroscoop te plaatsen.
Alle procedures met dierdierproeven zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee aan de State University of New York in Albany. Weeg het dier en anesthesiseer het met behulp van het isofluraangeleveringssysteem zoals hier getoond. Breng de rat over naar het chirurgische gebied zodra deze is geanesthetiseerd en plaats deze in een neuskoker die is aangesloten op het isofluraansysteem om de anesthesie te handhaven.
Bedek het lichaam van de rat met gaas en knijp in de teen van de rat om volledige anesthesie te bevestigen. Breng een druppel oogsmeermiddel aan op de rechteroogpositie van de rat, plaats de rat op zijn rechterzijde, met zijn linkeroog naar het plafond gericht voor injectie, zijn hoofd naar de rechterhand van de chirurg en zijn rug naar de chirurg toe. Trim alle snorharen weg die het oog bedekken.
Druppel een kleine hoeveelheid oogspoeling voor de temporale zijde van het linkeroog en verzamel het overtollige aan de nasale zijde met een wattenstaafje om het oog te spoelen. Verwijd de pupil met 1% tropicamide, 2,5% fenylephrine, voor een post-injectie optische coherentietomografie, of OCT-examen, door er een druppel van elk aan te brengen. Breng een druppel oogspoeling aan om het oog vochtig te houden.
Breng een druppel Proparacain aan op het oog en verwijder het overtollige met een wattenstaafje. Masseer voorzichtig de huid rond het oog vier tot zes keer om het ooglid te openen, zodat het oog tijdelijk en lichtjes uit zijn holte komt om een gemakkelijke toegang van de injectienaad te mogelijk te maken. Gebruik een pincet om de conjunctiva achter de limbus vast te grijpen en draai het oog rond om een betere plek voor de operatie te vinden zonder de oculaire spieren
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een transscleraire subretinale injectietechniek voor het afleveren van RPE-cellen in knaagdierenogen. De methode heeft als doel het risico op retinale schade te minimaliseren terwijl reproduceerbaarheid wordt gewaarborgd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oftalmologie
- Stamcellentherapie
Achtergrond
- Subretinale injectie is cruciaal voor stamceltherapieën gericht op leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD).
- AMD is een leidende oorzaak van blindheid bij ouderen.
- Huidige technieken kunnen risico's op retinale schade met zich meebrengen.
- Een veiligere, reproduceerbare methode is nodig voor effectieve celbezorging.
Doel van het onderzoek
- Om een minder risicovolle subretinale injectietechniek te introduceren.
- Om de precisie van celbezorging in de subretinale ruimte te verbeteren.
- Om een methode te bieden die zelf afsluit zonder de noodzaak van hechtingen of lijm.
Gebruikte methoden
- Kleine incisie in het bindvlies om de sclera bloot te leggen.
- Gebruik van een afgeschuinde 31-gauge insulinenaad om een pilootgat te maken.
- Inbrengen van een afgeschuinde 33-gauge injectienaad onder een specifieke hoek.
- Zelfafsluitend injectiegat na terugtrekking van de naald.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt nauwkeurige bezorging van RPE-cellen mogelijk.
- Minimaal risico op retinale schade werd waargenomen.
- De methode is reproduceerbaar over proeven heen.
- Het zelfafsluitende mechanisme elimineert de noodzaak voor aanvullende sluitmethoden.
Conclusies
- Deze transsclerale injectietechniek is een veelbelovende aanpak voor stamceltherapieën.
- Het gaat de risico's aan die gepaard gaan met traditionele methoden.
- Verdere studies kunnen de effectiviteit ervan in klinische toepassingen valideren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reliable delivery of human retinal pigment epithelial (RPE) cells into the subretinal space is a critical challenge in preclinical models for retinal degenerative disease therapies. This refined trans-scleral injection protocol addresses reproducibility and minimizes retinal trauma, directly impacting the predictive confidence of cell-based intervention studies. The method supports robust target validation and de-risks early translational steps for cell and gene therapy pipelines targeting age-related macular degeneration (AMD) and related disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous testing of therapeutic hypotheses for RPE cell replacement in disease-relevant animal models.
- Reduces procedural variability, supporting functional target validation and mechanistic de-risking.
- Facilitates reproducible delivery of candidate cells or molecules, strengthening predictive confidence for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated subretinal delivery systems for downstream efficacy and safety screening workflows.
- Standardizes injection parameters, improving reproducibility and quantitative assessment of cell engraftment.
- Supports scalable, repeatable procedures for evaluating multiple therapeutic candidates in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker development and preclinical validation.
- Enables continuity from discovery through preclinical assessment by minimizing confounding surgical trauma.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for cell and gene therapy assets targeting retinal degeneration.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the preclinical discovery-to-validation continuum for ocular cell therapies, bridging early discovery, lead identification, and translational research phases.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by enabling precise, reproducible cell delivery.
- Screening: Provides a standardized platform for quantitative assessment of cell localization and survival post-injection.
- Analytics: Facilitates OCT-based measurement of injection quality and histological confirmation of cell placement.
- Translational Research: Maintains disease relevance and supports biomarker alignment in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a reproducible, scalable technique adaptable for cell, gene, or small molecule delivery studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in preclinical efficacy studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of subretinal delivery workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing technical failure rates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of ocular cell and gene therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in microsurgical procedures and animal handling.
- Needs access to precision injection equipment and OCT imaging for post-injection assessment.
- Demands cross-team standardization of injection parameters and quality control metrics.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for other species or cell types.
- Potential limitations include the need for specialized training and careful monitoring to avoid off-target effects.
