Name: Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Leer een trans-scleraal subretinaal injectietechniek om menselijke RPE-cellen in rattenogen te transplanteren met minimaal retinaschade. Deze zelfsluitende methode biedt een veilige en reproduceerbare aanpak voor stamceltherapieën bij degeneratieve retinopathieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij willen Patty Lederman bedanken voor haar hulp bij de chirurgie en Susan Borden RPE cel voorbereiding. We erkennen ook NYSTEM C028504 voor de financiering voor dit project. Justine D. Miller wordt ondersteund door de NIH grant F32EY025931.

Alle procedures waarbij dieren zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) op de State University of New York in Albany.
1. vóór injectie voorbereiding
<ol><li>
Voorbereiding van een hRPESC-RPE celsuspensie Opmerking: Al de volgende stappen worden uitgevoerd in steriele weefselkweek kap en vertrouwdheid met steriele basistechniek is vereist.<ol>
<li>Primaire hRPE cellen isoleren van menselijke donor ogen leeftijd 50-90 jaren en cultuur cellen in 24-Wells-platen12. Cryopreserve van de cellen bij passage 1, dooi desgewenst en cultuur passage 2 (P2) cellen voor 4-5 weken (figuur 1A) voor injectie.</li>
		<li>Verwijder het kweekmedium12 en voorzichtig spoelen wells tweemaal met 500 µL vooraf opgewarmd 1 X Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder Calcium & Magnesium (1 x DPBS-CMF) door toevoeging van 1 X DPBS-CMF in putjes met behulp van een precisiepipet 1.000 µL en verwijderen met behulp van een vacuüm.</li>
		<li>300 µL trypsine/DNAse toevoegen aan elk putje. Incubeer de cellen van de hRPESC-RPE in trypsine/DNAse (4 kU DNase per 1 mL van 0,25% trypsine-EDTA) gedurende 4 minuten bij 37 ° C te distantiëren van de cellen.</li>
		<li>Controleer de cellen onder de Microscoop om te zien of ze hebben afgerond. Incubeer de cellen in trypsine/DNase voor een extra 2 min als ze niet nog hebben afgerond blijven.</li>
		<li>Zodra de cellen worden naar boven afgerond, gebruik een pipet 1.000 µL triturate de vrijstaande cellen uit de put en de overdracht van de trypsine/DNase met vrijstaande cellen in een buis 15 mL kegelvormig met gelijke hoeveelheid voorverwarmde kweekmedium, naar de inactivering van de trypsine/DNase.</li>
		<li>Spoel putjes met voorverwarmde 1 X DPBS-CMF zachtjes op en neer, waarbij met name rond de randen van de put; deze cellen vervolgens toevoegen aan de vorige conische buis.</li>
		<li>Centrifugeer de conische buis bij 286 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet van de cellen.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 1 mL gestolde voedingsbodem.</li>
		<li>Met behulp van een hemocytometer cellen tellen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 286 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet van de cellen.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in steriele evenwichtig zout oplossing (BSS) op 50.000 cellen/µL (te leveren 50.000 cellen in 1 µL volume tijdens subretinal injectie).</li>
		<li>Breng de definitieve celsuspensie (CS) in een microcentrifuge van 1,7 mL tube en blijven in een mengsel van ijs-water tot gebruik van de injectie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding voor cel injector
	<ol>
<li>Plaats een steriele 33-gauge schuine naald in de injectiespuit en schroef strak te monteren de injector.</li>
		<li>Spoel de injector met 100% ethanol 5 - 6 keer.</li>
		<li>Spoel de injector met 70% ethanol 5 - 6 keer.</li>
		<li>Spoel de injector met BSS 5 - 6 keer.</li>
		<li>Markeer de injector naald met een steriele zwarte viltstift op een positie van 600 µm afstand van het puntje van de naald onder de ontleden Microscoop (figuur 1B).</li>
		<li>Plaats de injector op een micromanipulator voor injectie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. subretinal injectie
<ol><li>
Chirurgische gebied en dierlijke voorbereiding
	<ol>
<li>Weeg een 4-5 week oud RCS rat (60-100 g) en anesthetize met behulp van het uitvoeringssysteem van Isofluraan damp. Opmerking: Voor het opwekken van anesthesie houden het Isofluraan debiet op 5%. Bevestig de diepte van de verdoving door te drukken op de poten, en dan het debiet te verminderen tot 2-3% voor onderhoud van de verdoving tijdens de operatie.</li>
		<li>Plaats een steriele chirurgie-gordijn, met een verwarming pad onder, op het podium van het ontleden Microscoop om te een steriele chirurgische instelgebied.</li>
		<li>De rat overbrengen in het chirurgische gebied en plaats van de rat in een neus kegel aangesloten op de Isofluraan systeem te handhaven van de verdoving.</li>
		<li>Dekking van de rat lichaam met gaas. Knijp de rat's teen om te bevestigen de volledige verdoving.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trans-scleral subretinal injectie onder de Microscoop
	<ol>
<li>Breng een druppel oog smeermiddel op de rat unoperated oog.</li>
		<li>Plaats de rat op zijn rechterkant met haar linkeroog geconfronteerd met het plafond voor injectie, haar hoofd naar de surgeon's rechterhand en haar terug naar de chirurg.</li>
		<li>Elke snorharen die betrekking hebben op het oog met een kleine schaar te trimmen.</li>
		<li>Een kleine hoeveelheid ogen wassen van de temporele kant van het linker oog te druppelen en het verzamelen van de overmaat aan de neus zijkant met een applicator katoen te spoelen van het oog.</li>
		<li>De pupil verwijden met 1% tropicamide en 2,5% phenylephrine (vers gemaakt van 10% phenylephrine door het in steriele zoutoplossing 0,9% verdunnen op de dag van de operatie) voor een na injectie OCT examen door toepassing van een druppel van elk.</li>
		<li>Trek voorzichtig de huid rondom het oog 4 - 6 maal te openen van het ooglid, zodat het oog iets proptosed voor gemakkelijkere toegang tot de regio's aan de limbus posterior is.</li>
		<li>Toepassing van een daling van eye wash en houd het oogje vochtig.</li>
		<li>Zachtjes triturate de CS (bereid in stap 1.1.12) en laadt u de injector met 1.2 µL CS. De extra 0.2 µL wordt gebruikt voor het compenseren van injectie terugvoer. Opmerking: Op basis van onze metingen, over 5,000-8,000 cellen zijn verloren in de terugvoer met een injectie van 50.000 cellen/µL die gelijk is aan ongeveer 10-16% van cel verlies en een extra van 0.2 µL CS werd geïnjecteerd ter compensatie van het verlies van deze cel.</li>
		<li>Plaats de injector gevuld met CS op een micromanipulator (of hebt een assistent die houden) verticaal als RPE cellen neiging om gemakkelijk te zinken in suspensie.</li>
		<li>Een daling van 0,5% proparacaine (lokale topische verdoving) van toepassing op het oog en verwijder de overmaat met een applicator katoen. Opmerking: Deze stap moet onderdrukken het hoornvlies reflex en dat het oog knippert tijdens opeenvolgende stappen.</li>
		<li>Gebruik pincet greep het bindvlies posterieure aan de limbus, nasally draaien van het oog en til het bindvlies zodat een "tent".</li>
		<li>Gebruik schaar te snijden de bovenkant van de "tent" uit te maken van een kleine opening in het bindvlies en bloot de onderliggende sclera.</li>
		<li>Pincet kunt op de rand van de resterende marge van het bindvlies naast de limbus grip en het oog nasally draaien zodat de bestaat as onder een hoek van ongeveer 30 graden ten opzichte van de bovenkant van de tabel (Figuur 1 c is). Voortdurende aangrijpend van het bindvlies marge is nodig om een contra kracht tijdens naald invoegingen en om het oog op een optimale hoek.</li>
		<li>Als u wilt een pilot gat voor cel injectie, plaatst u het einde van een naald steriel schuine 31-gauge insuline op 1200-1500 µm posterieure aan de limbus met de opening van het puntje naar boven.</li>
		<li>De hoek van de insuline naald zodanig aanpassen dat het is 10-15 graden boven de sclera (tangentiële aan een denkbeeldige vlak op de beoogde injectieplaats). Penetreren langzaam de sclera-vaatvlies complex tot een diepte van de naald van ongeveer 500 µm. In de gepigmenteerde rat verdwijnt het einde van de naald' ' onder de gepigmenteerde vaatvlies. Voor het merk van insuline naald gebruikt hier, is de afstand van het puntje van de naald tot de schuine kant 500 µm.</li>
		<li>Zorgvuldig trekken de naald van de insuline (een zeer kleine effusie van bloed kan worden gezien).</li>
		<li>Als overmatig bloeden is genoteerd, kan een speer oog worden toegepast om te wissen van het gat, indien nodig. Aanhoudende bloedingen achter de speer toepassing geeft aan een schip beschadigd zijn.</li>
		<li>Begeleiden de RPE cel-geladen injector naald in de pilot gat, met de opening naar beneden, en onder een hoek van ongeveer 10-15 graden ten opzichte van de lokale oppervlak van de sclera.</li>
		<li>Steek voorzichtig de injector naald in het pilot gat tot een diepte van ongeveer 500 µm voor toegang tot de subretinal ruimte. Er moet over een 100 µm marge tussen de rand van het zwarte pen merk en het punt waar de naald is bedekt door de gepigmenteerde vaatvlies (Figuur 1 c en 1 D).</li>
		<li>Vraag de assistent van zachtjes druk de plunjer van de injectiespuit te injecteren van het juiste volume van cellen (ongeveer 1.2 µL). Wees bereid om enige contra kracht als assistent persen op de plunjer. Opmerking: Voorafgaande mock praktijk met de Office-assistent kan bieden zowel de chirurg als assistent met de nodige ervaring met deze stap.</li>
		<li>Terwijl visueel gericht op de pen mark rand, de injector op zijn plaats voor 25-30 s houden en vervolgens langzaam het intrekken van de injector. Een kleine hoeveelheid van de Terugvloeiing wordt meestal waargenomen. Opmerking: Indien geen terugvoer wordt waargenomen, kan zijn er een intravitreal injectie. Als u terugvoer via de zegel of cellen vullen onder de sclera ziet, was de injectie te ondiep.</li>
		<li>Spoel de efflux van de cel van de injectieplaats met de steriele eye wash 3 keer en verzamelen de overmaat met een applicator katoen.</li>
		<li>Breng een druppel oog glijmiddel op het bediende oog en de rat overbrengen in de OCT station de locatie van de getransplanteerde cellen en de grootte van de subretinal bleb te onderzoeken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. na injectie behandeling
<ol><li>
Anti-inflammatoire en pijn reliever behandeling
	<ol>
<li>Injecteren van buprenorfine op 0,1 mg/kg lichaamsgewicht in een zoutoplossing subcutaan te verminderen van de pijn.</li>
		<li>Injecteren dexamethason op 1,6 mg/kg lichaamsgewicht in een zoutoplossing door intraperitoneale injectie (I.P.) voor controle van de ontsteking.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dierlijke herstel
	<ol>
<li>De rat terugkomen in de kooi herstel onder een warmte lamp te handhaven van de lichaamstemperatuur.</li>
		<li>Observeer de bediende oog voor tekenen van bloeding.</li>
		<li>Observeer de rat om ervoor te zorgen dat het komt uit de narcose.</li>
		<li>Het herstelde dier terug naar een verse kooi en markeren van de kooi met een kaartje van de chirurgie en controleren dagelijks op tekenen van nood, oogbeschadigingen en/of bloeding of hoornvlies opaciteit. De dierenarts hiervan onverwijld in kennis als er zorgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>De Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).</li>
<li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li>
<li>Ambati, J., Fowler, B. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22794258">Mechanisms of agerelated macular degeneration.</a> Neuron. 75, 26-39 (2012).</li>
<li>Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+Pathogenesis%2C+natural+course%2C+and+laser+photocoagulation-induced+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li>
<li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+and+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells and retinal repair.</a> Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+Stargardt%27s+macular+dystrophy%3A+follow-up+of+two+open-label+phase+1%2F2+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies.</a> Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).</li>
<li>Stanzel, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RPE+Stem+Cells+Grown+into+Polarized+RPE+Monolayers+on+a+Polyester+Matrix+Are+Maintained+after+Grafting+into+Rabbit+Subretinal+Space%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).</li>
<li>Blenkinsop, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+retinal+pigment+epithelial+stem+cell-derived+RPE+monolayers+exhibit+key+physiological+characteristics+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).</li>
<li>Salero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+RPE+can+be+activated+into+a+multipotent+stem+cell+that+produces+mesenchymal+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).</li>
<li>Davis, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RPE+Stem+Cell-Derived+RPE+Preserves+Photoreceptors+in+the+Royal+College+of+Surgeons+Rat%3A+Method+for+Quantifying+the+Area+of+Photoreceptor+Sparing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).</li>
<li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+Subretinal+Injections+in+Rodents+to+Deliver+Retinal+Pigment+Epithelium+Cells+in+Suspension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension.</a> J Vis Exp. (95), e52247(2015).</li>
<li>Lopez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+Retinal+Pigment+Epithelium+Modifies+the+Retinal+Degeneration+in+the+RCS+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).</li>
<li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+Transplantation+of+MACS+Purified+Photoreceptor+Precursor+Cells+into+the+Adult+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina.</a> J Vis Exp. (84), e50932(2014).</li>
<li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Common+Anesthetics+on+Eye+Movement+and+Electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram.</a> Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).</li>
<li>McGill, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+central+nervous+system+stem+cells+-+neuroprotection+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration.</a> Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).</li>
<li>Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+retinal+pigment+epithelium+cells+are+retained+in+the+cell+cycle+and+proliferate+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo.</a> Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).</li>
<li>Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafting+of+ARPE-19+and+Schwann+Cells+to+the+Subretinal+Space+in+RCS+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).</li>
<li>Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+corneal+opacities+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Induced corneal opacities in the rat.</a> Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De subretinal injectietechniek afgebeeld in dit artikel is via de trans-scleral weg, waar de injector naald de buitenlagen van de muur van het oog (sclera-vaatvlies-RPE complex doordringt) zonder nadelige gevolgen voor de neurale retina of het glasvocht holte verstoren. Een alternatieve trans-vitreal-aanpak heeft een potentieel risico van lens schade leidt tot cataract, aangezien knaagdieren lens het grootste deel van het glasvocht holte beslaat. Vergeleken met deze methode, onze techniek is minder riskant en minimale tr...

Het menselijke netvlies gelegen aan de achterzijde van het oog-functies als een lichte zintuiglijke weefsel en speelt een cruciale rol in de perceptie van de visie. Netvlies cel dysfunctie of celdood daarom veroorzaakt visie problemen of permanente blindheid. Aandoeningen waarbij degeneratie of disfunctie van cellen in verschillende lagen van het netvlies staan bekend als retinale degeneratieve ziekten, waaronder AMD de meest voorkomende en de belangrijkste oorzaak van onomkeerbare blindheid bij ouderen in ontwikkelde landen is 1,2. Het pathologisch proces van LMD wordt geassocieerd met "drusen" accumulatie tussen de RPE-laag en de onderliggende Bruch membraan, dat op zijn beurt RPE steun van fotoreceptor fysiologie schaadt, wat leidt tot neurale atrofie van het retinale en visie verlies3, 4,5. Tot dusver is er geen remedie voor geavanceerde droge AMD (niet-neovascular). De opkomst van stamcel therapie als een nieuw paradigma in regeneratieve geneeskunde brengt de hoop de disfunctionele of dode RPE cellen te vervangen door gezonde cellen afgeleid van stamcellen. Sterker nog, uitgebreide Preklinische studies van verplanten stamcellen (b.v., menselijke embryonale stamcellen)-afgeleide cellen RPE RPE-degeneratieve diermodellen geweest uitgevoerd6,7, waarvan sommige hebben stapte over naar de klinische proeven8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Onlangs, een alternatieve bron van stamcellen die inwoner in de menselijke RPE laag, de menselijke RPE stamcellen (hRPESCs), door onze lab werd geïdentificeerd en wordt momenteel gebruikt in preklinische studies van hRPESC afgeleid-RPE cel (hRPESC-RPE) transplantatie therapie voor AMD 10 , 11 , 12 , 13.
De subretinal injectietechniek wordt toegepast in de preklinische studies die hierboven vermeld door meerdere groepen, met inbegrip van onze fractie. Er zijn twee algemene benaderingen voor subretinal injectie in dieren: trans-vitreal en trans-scleral. De trans-vitreal-aanpak heeft het voordeel van de chirurg zijnde kundig voor het einde van de naald direct observeren doordringt het anterior oog staat, kruist de hele vitreal holte grenzend aan de lens, en dringt het netvlies aan de achterkant met het oog op het bereiken van de subretinal ruimte14,15,16. Nochtans, vereist het verstoren van het netvlies op twee locaties (anterior en posterior), draagt het risico van beschadiging van de lens, en kan resulteren in terugvoer van cellen in het glasvocht wanneer de naald wordt teruggetrokken. In tegenstelling, de trans-sclera-benadering, in principe, vermijdt betrokkenheid van de retina en glasvocht en terugvoer verlaat het oog. In gepigmenteerde knaagdieren, de chirurg kan aanvankelijk penetratie van de sclera observeren, maar na de passage in de gepigmenteerde vaatvlies, het einde van de naald is niet meer zichtbaar. Zonder directe observatie, overtredingen van het netvlies is gebruikelijk en kan leiden tot retinale dissectie en levering van cellen en/of bloed in het glasvocht. Bovendien, omdat het oog oppervlak is gebogen, het is zeer moeilijk om te weten welke naald hoeken en diepten zijn het meest effectief voor trans-scleral injecties.
In dit gevisualiseerde artikel introduceren we een methode van de trans-scleral subretinal injectie op de hoogte gebracht door het gebruik van post chirurgische evaluaties met optische coherentie tomografie (OCT), waarmee een gedetailleerd onderzoek van de injectieplaats. Onze trans-scleral injectietechniek maakt gebruik van gedefinieerde locaties, hoeken en diepten voor injectie naalden tot zeer lage chirurgisch trauma en hoge betrouwbaarheid. Hier tonen we specifiek de injectie van hRPESC-RPE cellen in de subretinal ruimte van de RCS rat, een pre-klinische model van menselijke AMD. Met deze methode injectie verlost we succesvol en consequent hRPESC-RPE cellen in de subretinal ruimte van RCS rat ogen met een zeer hoog slagingspercentage. Injectie van cellen bleek eerder leiden tot behoud van de RCS-researchdieren ten minste 2 maanden na injectie13. Deze procedure wordt uitgevoerd onder de Microscoop ontleden en is eenvoudig te leren. Het vereist twee mensen (een chirurg en een assistent) voor het uitvoeren van de injectie en de gemiddelde tijd van injectie voor elk dier is minder dan 5 minuten. De gedefinieerde hoeken en diepten voor injectie naalden maken het mogelijk voor laboratoria, waar OCT niet beschikbaar is, om succesvolle subretinal injectie. Het zorgt voor zeer reproduceerbaar subretinal toegang en kan worden gebruikt, niet alleen voor cel transplantatie, maar ook voor drug delivery en gen-therapieën.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>1xDulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline without Calcium &amp; Magnesium (1xDPBS-CMF)</td><td>Corning Cellgro</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Balanced Salt Solution (BSS)</td><td>Alcon</td><td>00065079550</td><td></td></tr><tr><td>Sterile eye wash</td><td>Moore Medical</td><td>75519</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 0.9% saline</td><td>Hospira</td><td>488810</td><td></td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)</td><td>Akorn</td><td>17478026312</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)</td><td>Bausch &amp; Lomb</td><td>24208058559</td><td></td></tr><tr><td>Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock</td><td>Bausch &amp; Lomb</td><td>42702010305</td><td>Dit wordt gebruikt om 2,5% Phenylepherine te maken</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Patterson</td><td>433502</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323051610</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>615090040</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>2546.70-5</td><td></td></tr><tr><td>Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel</td><td>Novartis</td><td>78042947</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops</td><td>Alcon</td><td>00065143105</td><td></td></tr><tr><td>hRPESC-RPE cellen</td><td>Commercieel niet verkrijgbaar</td><td></td><td>Zie "Referentie #12" voor celisolatie en onderhoud.</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes (15 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>62554002</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge cap met o-ring</td><td>LPS inc</td><td>L233126</td><td></td></tr><tr><td>Capless Microcentrifuge tubes (1,7 ml)</td><td>LPS inc</td><td>L233041</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Sterile alcoholdoekjes</td><td>McKesson</td><td>58-204</td><td></td></tr><tr><td>Sterile katoenen doppen</td><td>McKesson</td><td>24-106-2S</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Weck-Cel spiesen</td><td>Beaver-Visitec International&nbsp;</td><td>0008680</td><td></td></tr><tr><td>Sterile chirurgische kleedjes&nbsp;</td><td>McKesson</td><td>25-515</td><td></td></tr><tr><td>Gaas</td><td>McKesson</td><td>16-4242</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil-spuit (10 ul)</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanofil</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil afgeschuinde 33-gauge naald</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-spuitenalnden 31-gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>328418</td><td></td></tr><tr><td>Rat toothed forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>555041FT</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Circulating water T pomp&nbsp;</td><td>Stryker</td><td>TP700</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingspad</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-814</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesiesysteem voor dieren</td><td>World Precision Instruments</td><td>EZ-7000</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Ohaus</td><td>PA1502</td><td></td></tr><tr><td>Stereo-microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscooplichtbron</td><td>Schott</td><td>ACE-serie</td><td></td></tr><tr><td>Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System</td><td>Bioptigen</td><td>R2210</td><td></td></tr><tr><td>Sterile zwarte markeerstift</td><td>Viscot Industries</td><td>1416S-100</td><td></td></tr><tr><td>Miniatuur meetlat</td><td>Ted Pella Inc</td><td>13623</td><td></td></tr><tr><td>Infrarood Basking Spot Lamp&nbsp;</td><td>EXO-TERRA</td><td>PT2144</td><td>Dit wordt gebruikt als verwarmingslamp voor dieren tijdens de post-operatieve herstel&nbsp; fase</td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een verfijnde protocol voor trans-scleral subretinal transplantatie van menselijke retinale pigment epitheliale cellen in de ogen van de rat

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degeneratieve retinale ziekten zoals leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD) zijn de belangrijkste oorzaak van onomkeerbaar gezichtsverlies wereldwijd. AMD wordt gekenmerkt door de degeneratie van retinale pigment epitheliale (RPE) cellen, die een monolayer van cellen functioneel ondersteunen en anatomisch verpakken rond het neurale netvlies. Huidige farmacologische behandelingen voor de niet-neovascular AMD (droge AMD) alleen vertragen de progressie van de ziekte maar niet herstellen visie, vergend studies gericht op het identificeren van nieuwe therapeutische strategieën. De degeneratieve RPE cellen vervangen door gezonde cellen houdt belofte voor de behandeling van droge AMD in de toekomst. Uitgebreide Preklinische studies van stamcel vervangende therapieën voor AMD betrekken de transplantatie van stamcellen cel afkomstige RPE cellen in de subretinal ruimte van diermodellen, waarin de subretinal injectietechniek wordt toegepast. De meest gebruikte in deze preklinische dierstudies aanpak is door middel van de trans-scleral route, die wordt bemoeilijkt door het ontbreken van directe visualisatie van het einde van de naald en kan vaak leiden tot retinale schade. Een alternatieve benadering via het glasvocht zorgt voor directe waarneming van de naald oorspronkelijke eindpositie ligt, maar het draagt een hoog risico van chirurgische trauma's zoals meer oog weefsels worden verstoord. We hebben een minder riskant en reproduceerbare methode van gemodificeerde trans-scleral injectie die gebruikmaakt van gedefinieerde naald hoeken en diepten succesvol en consequent leveren RPE cellen in de rat subretinal ruimte en Vermijd sterke netvlies beschadiging ontwikkeld. Cellen die zijn geleverd op deze manier hebben eerder aangetoond doeltreffend in de Royal College of Surgeons (RCS) rat gedurende ten minste 2 maanden. Deze techniek kan worden gebruikt, niet alleen voor cel transplantatie, maar ook voor de levering van kleine moleculen of gentherapieën.

Met behulp van de techniek die in dit artikel beschreven we consequent geleverd hRPESC-RPE cellen in de subretinal ruimte voor RCS rats door het juist beheersen van de locatie, de hoek en de diepte van de injector naald invoegen in het weefsel (figuur 1B-D ). Onmiddellijk volgende transplantatie, een OCT onderzoek werd uitgevoerd om de injectieplaats en de subretinal bleb gemaakt door de getransplanteerde cellen te nemen. Post chirurgische OCT evaluatie d...

Subretinal injectie is veel toegepast in preklinische studies van stamcel substitutietherapie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. In dit gevisualiseerde artikel beschrijven we een minder riskant, reproduceerbaar zijn en juist gewijzigd subretinal injectietechniek via de trans-scleral-benadering te leveren van cellen in de ogen van de rat.

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Het algemene doel van deze video is het introduceren van een reproduceerbare trans-sclerale subretinale injectietechniek om menselijke retinale pigmentepitheelcellen, of RPE-cellen, in de subretinale ruimte van knaagoogenen te brengen met een minimaal risico op netvliesschade. Dit wordt bereikt door eerst een kleine incisie te maken in de temporale conjunctiva posterior aan de limbus om de onderliggende sclera bloot te leggen. Vervolgens wordt een schuine 31-gauge insulinenaald gebruikt om het sclera-kerncomplex te penetreren door de naald 500 microns, of ongeveer de helft van de punt, in het weefsel te steken met de schuine zijde naar boven gericht om een gidsgat te creëren.Vervolgens wordt een afgeplatte injectienaald van 33-gauge, bevestigd aan een spuit, in het gidsgat geleid en onder een specifieke hoek en diepte ingebracht; het injectiegat sluit zichzelf na het terugtrekken van de naald, waardoor geen hechtingen of weefsellijm nodig zijn. Degeneratieve retinopathieën bestaan uit een breed spectrum aan ziekten waarbij verschillende typen retinale cellen betrokken zijn. Wereldwijd komt de meest voorkomende ziekte, leeftijdsgebonden maculadegeneratie, of AMD, voor bij ouderen en

development-refined-protocol-for-trans-scleral-subretinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Celtransplantatie vertegenwoordigt een strategie voor de behandeling van netvliesdegeneratie die wordt gekenmerkt door fotoreceptorverlies. Hier beschrijven we een methode voor verrijking van transplanteerbare fotoreceptoren en hun subretinale enting in volwassen muizen.

Subretinale transplantatie van MACS gezuiverde fotoreceptor precursor cellen in de volwassen muis retina

Stamcellenafgeleide retinale pigmentepitheel (RPE) cellen kunnen voor meerdere toepassingen worden gebruikt, waaronder cel-gebaseerde therapieën voor retinale degeneratie, ziektemodellering en geneesmiddelstudies. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het reproduceerbaar verkrijgen van RPE uit stamcellen.

Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Netvliespigmentepitheel (RPE) vervangende strategieën en gen-gebaseerde therapie in aanmerking komen voor een aantal retinale degeneratieve aandoeningen. Voor klinische toepassing worden grote oog dierlijke modellen moeten chirurgische technieken bij patiënten toepassing bestuderen. Hier presenteren we een konijnenmodel voor subretinale chirurgie gericht RPE transplantatie, die veelzijdig en kostenefficiënt.

Een Step by Step Protocol voor Subretinal Surgery in Rabbits

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Hier wordt een chirurgische techniek gepresenteerd voor het transplanteren van van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) afgeleid netvliesweefsel in de subretinale ruimte van een groot diermodel.

Subretinale transplantatie van menselijk embryonaal stamcel-afgeleid retinaal weefsel in een katachtig groot diermodel

De niet-menselijke primaat (NHP) is een ideaal model voor het bestuderen van menselijke retinale cellulaire therapieën vanwege de anatomische en genetische overeenkomsten. Dit manuscript beschrijft een methode voor submaculaire transplantatie van retinale pigmentepitheelcellen in het NHP-oog en strategieën om intraoperatieve complicaties geassocieerd met maculaire manipulatie te voorkomen.

Retinale pigmentepitheeltransplantatie in een niet-humaan primaatmodel voor degeneratieve retinale ziekten

De subretinale implantatie van retinaal gepigmenteerd epitheel (RPE) is een van de meest veelbelovende benaderingen voor de behandeling van degeneratieve retinale ziekten. De uitvoering van preklinische studies op diermodellen met grote ogen blijft echter een uitdaging. Dit rapport presenteert richtlijnen voor de subretinale transplantatie van RPE op een celdrager in minivarkens.

Subretinale implantatie van RPE op een drager in minivarkens: richtlijnen voor preoperatieve preparaten, chirurgische technieken en postoperatieve zorg

Dit protocol presenteert een transpupillaire zichtgeleide transsclerale benadering om veilig en nauwkeurig subretinale cellulaire transplantaten af te leveren, met een laag aantal chirurgische complicaties, bij muizenontvangers met of zonder retinale degeneratie.

Transpupilgeleide transsclerale transplantatie van subretinale transplantaten in een muismodel voor retinale degeneratie

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de bereiding van post-gecryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen en de subretinale afgifte van deze cellen in rd10-muizen .

Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen

Leer een trans-scleraal subretinaal injectietechniek om menselijke RPE-cellen in rattenogen te transplanteren met minimaal retinaschade. Deze zelfsluitende methode biedt een veilige en reproduceerbare aanpak voor stamceltherapieën bij degeneratieve retinopathieën.

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat

Meer video's verkennen