3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen
27 april 2017
Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.
Het algemene doel van deze methode voor magnetische celaggregatie en dynamische maturatie is om de in vitro chondrogenese van mesenchymale stromale cellen of MSC's te verbeteren. Magnetische aggregatie van stamcellen in plaats van chondrogenese als celcondensatie is een vroege sleutelstap in het kraakbeenregeneratieproces. Nadat de stamcellen in scaffolds zijn opgesloten, kunnen de scaffolds worden verplaatst naar een cellulaire bioreactor om de dynamische maturatie van de cellen te beoordelen.
De belangrijke dynamische methode kan worden toegepast op andere biosystemen zoals spier-, hart- of vasculair herstel. Maar zoals je zult zien, is het zeer geschikt voor kraakbeenregeneratie. Visuele demonstratie van de magnetische celzaaien en de dynamische celmaturatie met behulp van de werkelijke bioreactor is cruciaal omdat deze twee technieken moeilijk te leren zijn via tekstinstructies alleen.
Om het micromagneetapparaat voor aggregaatvorming te construeren, plaatst u eerst een magnetische tip van 750 micrometer diameter in elk van de drie centimeter gaten in een aluminiumplaat van zes millimeter dik en plaatst u de plaat boven een permanent neodymiummagneet. Om een apparaat voor scaffoldzaaien te construeren, snijdt u eerst hard polystyreen in vierkanten van 2,4 vierkante centimeter en plaatst u magneten met een diameter van drie millimeter en een lengte van zes millimeter op gelijke afstand over een oppervlakte van 1,6 vierkante centimeter. Plaats vervolgens het apparaat boven een permanent neodymiummagneet.
Om menselijke MSC's te labelen, kweekt u eerst de stamcellen in compleet MSC-groeimedium bij 37 graden Celsius bij 5% koolstofdioxide tot ze 90% confluent zijn. Aspirateer en spoel de cellen vervolgens met Serum drie RPMI-medium zonder glutamine en voeg 10 milliliter ijzeroxide-nanodeeltje-oplossing toe per 150 vierkante centimeter kweekflakje voor een incubatie van 30 minuten in de celkweekincubator. Aan het einde van de incubatie, spoelt u de cellen vijf minuten met Serum drie RPMI-medium zonder glutamine om de nanodeeltjes die nog aan het plasmamembraan zijn gehecht, te internaliseren.
Vervang vervolgens het RPMI in elke flacon met 25 milliliter compleet MSC-groeimedium en plaats de cellen 's nachts terug in de celkweekincubator. De volgende ochtend, los de magnetische cellen met acht milliliter 0,5% Trypsin-EDTA per flacon. Verzamel de gedissocieerde cellen vervolgens door centrifugatie.
We suspenderen de pellets voor het tellen en plaatsen een glazen bodem 35 millimeter celkweek Petri-schaal op elk magnetisch apparaat. Om de aggregaten magnetisch te vormen, voegt u drie milliliter chondrogeen medium toe aan elke Petri-schaal en depositeert u voorzichtig niet meer dan acht microliter van 2,5 keer 10 tot de 5e gelabelde cellen per aggregaat. Het is cruciaal dat de cellen niet te langzaam of te snel worden gedeponeerd.
En ook niet te dichtbij of te ver van het magnetisme. Wanneer alle aggregaten zijn geplaatst, laat u de sferoïden gedurende 20-30 minuten zonder verstoring vormen. Breng vervolgens de aggregaten over naar de celkweekincubator.
Op dezelfde dag, vormt u aggregaten door 2,5 keer 10 tot de 5e gelabelde stamcellen te centrifugeren in 15 milliliter kegelbuisjes met 1,5 milliliter chondrogeen medium. Om de scaffolds magnetisch te zaaien, plaatst u één gedroogd pullulan/dextran-polysaccharide poreuze scaffold per Petri-schaal en verdunt u 2 keer 10 tot de 6e gelabelde cellen in 350 microliters chondrogeen medium zonder TGFbeta3. Pipetteer de cellen voorzichtig op de scaffolds en incubeer de structuren bij 37 graden Celsius om volledige celpenetratie mogelijk te maken.
Na vijf minuten voegt u voorzichtig drie milliliter chondrogeen medium toe aan de Petri-schaal en brengt u de scaffolds terug naar de celkweekincubator voor vier dagen om de cellen toe te laten migreren door de scaffoldporiën. Op dezelfde dag, zaait u ook een andere set scaffolds met 2 keer 10 tot de 6e gelabelde stamcellen zoals gedemonstreerd en incubeer de cellen zonder de magneet om uniform gezaaide scaffolds als positieve controles te verkrijgen. Voor chondrogenese in scaffolds op dag vijf verwijdert u het magnetische apparaat van alle scaffolds en brengt u de statische scaffolds terug naar de celkweekincubator tot dag 25, waarbij het medium twee keer per week wordt ververst.
Voor dynamische celkweek snijdt u ook op dag vijf siliconenbuisjes op de juiste lengte volgens de instructies van de fabrikant en plaatst u de buisjes, de 500 milliliter kweekkamer, de tweerichtingsrotators en de kooien in een steriele microbiologische veiligheidsstation. Volg de instructies van de fabrikant om de buisjes aan de tweerichtingsrotators in de kweekkamer aan te sluiten. Gebruik vervolgens een steriele spatel om voorzichtig twee gecellulariseerde scaffolds in elke kooi over te brengen.
Wanneer alle scaffolds zijn overgebracht, steekt u de kooien door de naalden in het deksel om te voorkomen dat ze tijdens het draaien bewegen. Vul de kweekkamer met chondrogeen medium. Gebruik een steriele antiseptische techniek bij het voorbereiden van de kamers om besmetting van een van de gereedschappen of scaffolds te voorkomen.
Breng vervolgens de kooien in de kamer in en sluit vervolgens de kamer en zet de peristaltiekpomp aan om de buisjes met chondrogeen medium te vullen en luchtbellen te elimineren. Plaats en bevestig de gevulde kamer in de motor van de bioreactor en zet de computer aan die de rotaties van de arm en de kamer regelt. Pas vervolgens een rotatiesnelheid van vijf rotaties per minuut toe op zowel de arm als de kamer, en pas de peristaltiekpomp aan op een stroomsnelheid van 10 rotaties per minuut voor continue voeding van de gecellulariseerde scaffolds.
Om op dag acht een scaffold-vrij 3D-aggregatconstruct te genereren, start u de fusie door twee aggregaten in contact te plaatsen in chondrogeen medium om acht dubbele aggregaten te vormen. Vervolgens versmelt u op dag 11 twee dubbele aggregaten om vier viervoudige aggregaten te vormen en vormt u op dag 15 de uiteindelijke structuur door de vier viervoudige aggregaten samen te smelten. Weefsels gevormd door magnetische fusie vertonen een significante toename in collageen II-express
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een magnetische benadering voor het condenseren van mesenchymale stromale cellen (MSCs) om chondrogenese te verbeteren. De methode omvat dynamische rijping in een bioreactor, waarbij mechanische stimulatie wordt toegepast om de productie van de extracellulaire matrix te verbeteren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Kraakbeenregeneratie
- Tissue engineering
Achtergrond
- Chondrogeneze is cruciaal voor kraakbeenherstel.
- Celcondensatie is een essentiële vroege stap in het regeneratieproces.
- Dynamische rijping kan de eigenschappen van cellulaire constructen verbeteren.
- Magnetische aggregatie biedt een nieuwe benadering voor celzaaien.
Doel van het onderzoek
- Om de in vitro chondrogenese van MSC's te verbeteren.
- Om de effectiviteit van magnetische celaggregatie aan te tonen.
- Om de impact van dynamische rijping op kraakbeenregeneratie te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Magnetische aggregatie van stamcellen.
- Gebruik van scaffolds voor celbeperking.
- Dynamische rijping in een bioreactor.
- Visuele demonstraties van technieken.
Belangrijkste resultaten
- Magnetische aggregatie condenseert MSC's succesvol.
- Dynamische rijping verhoogt de productie van de extracellulaire matrix.
- De methode is toepasbaar op andere weefseltypes dan kraakbeen.
- Visuele hulpmiddelen verbeteren het begrip van complexe technieken.
Conclusies
- De magnetische benadering is effectief voor chondrogénese.
- Dynamische rijping is zeer gunstig voor cartilage tissue engineering.
- Deze methoden kunnen worden aangepast voor andere regeneratieve toepassingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Magnetische aggregatie van stamcellen pakt een kritiek knelpunt in kraakbeenregeneratie aan door gecontroleerde celcondensatie mogelijk te maken, een voorwaarde voor chondrogene differentiatie. In combinatie met dynamische rijping in een bioreactor verbetert deze benadering de afzetting van de extracellulaire matrix, waardoor de voorspellende waarde van in vitro-modellen voor het minimaliseren van risico's bij kraakbeenherstelstrategieën wordt vergroot. De methode ondersteunt doelwitvalidatie en assayontwikkeling door een reproduceerbaar, schaalbaar systeem te bieden voor het evalueren van het chondrogene potentieel onder fysiologisch relevante mechanische prikkels.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van chondrogene hypothesen mogelijk via magnetisch gestuurde stamcelcondensatie, wat inzicht geeft in vroege functionele targets bij kraakbeenvorming.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde methode om celverdichting te induceren, waardoor de variabiliteit in assays voor chondrogenese in vroege stadia wordt verminderd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert scaffold-vrije 3D-aggregaten en magnetisch gezaaide scaffolds met een verhoogde expressie van collageen II en aggrecan, wat kwantitatieve read-outs voor chondrogene differentiatie mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays door consistente aggregaatvorming en bioreactor-gemedieerde rijping, waardoor de reproduceerbaarheid over screeningcampagnes wordt verbeterd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Toont de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie aan door een verhoogde matrixproductie onder dynamische kweek te laten zien, wat de biomechanica van natuurlijk kraakbeen weerspiegelt.
- Operationele waarde: Faciliteert risicogebaseerde beslissingen over verdere ontwikkeling door magnetische seeding en bioreactor-rijping te correleren met een verbeterde depositie van de extracellulaire matrix.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van stamcelcondensatie via 3D-weefselvorming tot dynamische rijping, ter ondersteuning van de identificatie van lead-moleculen en de preklinische evaluatie van kandidaten voor kraakbeenregeneratie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en het verduidelijken van signaalpaden door nauwkeurige controle over de aggregatie van stamcellen mogelijk te maken, een cruciale vroege stap in de chondrogenese.
- Screening: Levert assay-klare biologische systemen met een gestandaardiseerde grootte en verhoogde expressie van matrixmarkers, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen of condities mogelijk maakt.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen, zoals de expressieniveaus van collageen II en aggrecan, waardoor teams chondrogene resultaten tussen experimentele groepen kunnen vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt ontdekkingen met preklinische validatie door aan te tonen dat rijping in een bioreactor de eigenschappen van de extracellulaire matrix verbetert in zowel scaffold-vrije als scaffold-gebaseerde systemen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het genereren van kraakbeenmodellen, dat aanpasbaar is voor verschillende MSC-bronnen en scaffoldtypes voor iteratieve targetvalidatie.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in chondrogene differentiatie door de expressie van collageen II en aggrecaan te versterken via magnetische aggregatie en dynamische rijping.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid van 3D-kraakbeendelen via reproduceerbare magnetische zaaiing en bioreactor-gebaseerde rijping.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit in vroege benaderingen van kraakbeenregeneratie te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van verbeterde depositie van de extracellulaire matrix onder fysiologisch relevante omstandigheden.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, labeling met magnetische nanodeeltjes en het bedienen van bioreactoren.
- Afhankelijk van toegang tot microgefabriceerde magnetische apparaten, chondrogene media en rotationele bioreactorsystemen.
- Noodzaak tot standaardisatie tussen teams van de timing van aggregaatvorming, celdichtheid en maturatieduur voor reproduceerbare resultaten.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het overdragen van de methode naar verschillende MSC-bronnen of scaffoldmaterialen.
- Beperkt door de noodzaak van nauwkeurige controle over het magnetisch veld en het volume van de celsuspensie om consistente aggregaatvorming te garanderen.
