Name: Human Lung dendritische cellen: ruimtelijke verdeling en fenotypische Identification in Endobronchiale biopten middels immunohistochemie en flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Ontdek protocollen voor het verwerken van endobronchiale biopten om long-dendritische cellen te bestuderen met immunohistochemie en flowcytometrie. Deze methoden helpen onderzoekers bij het begrijpen van longimmuniteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de vrijwilligers die klinisch materiaal hebben bijgedragen aan dit onderzoek bedanken. We zijn ook dankbaar voor het personeel van het ministerie van Volksgezondheid en Clinical Medicine, Division of Medicine / Respiratory Medicine, University Hospital, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) voor het verzamelen van alle klinische materiaal. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan AS-S van de Zweedse Research Council, de Zweedse Hart-Lung Foundation, de Zweedse Stichting voor Strategische Research, en het Karolinska Institutet.

LET OP: Dit onderzoek werd in Umeå, Zweden goedgekeurd door de regionale Ethical Review Board. 1. bronchoscopie monstername Endobronchiale biopten van Mensgebonden <ol><li> Verkrijgen geïnformeerde toestemming van alle deelnemers. </li><li> Behandel patiënten met orale midazolam (4-8 mg) en intraveneuze glycopyrronium (0,2-04 mg) 30 minuten vóór de bronchoscopie. Solliciteer lokale verdoving met lidocaïne in het strottenhoofd en de bronchiën. Dat het onderwerp gorgelen met ~ 3 ml lidocaine 4% en 3 ml van toepassing op de tong basis en in het strottenhoofd via een injectiespuit strottenhoofd. Optimaliseer de lokale anesthesie met 8-10 doses van lidocaïne spray. Voer deze stap met het onderwerp zitten. </li><li> Steek een flexibele video bronchoscoop via de mond via een plastic mondstuk met het onderwerp in rugligging. Gebruik een speciaal gemaakte nevel katheter de topische anesthesie van het distale trachea en bronchi via de bronchoscoop voltooien. Hier gebruikt een dosis van ongeveer5-10 ml lidocaïne 2%. </li><li> Neem 6-9 endobronchiale mucosale biopsies van de hoofdcarina en de belangrijkste bronchiale divisies met behulp gefenestreerde pincet (Figuur 1). Naar aanleiding van de bronchoscopie en voor het verlaten van het ziekenhuis, laat het onderwerp rust voor 2-4 uur en hem / haar met een lichte maaltijd. </li></ol> 2. Inbedding de biopten in Glycol methacrylaat (GMA) Resin NB: De GMA immunokleuring protocol werd oorspronkelijk bij Southampton University, histochemie Research Unit 17 ontwikkeld. <ol><li> Fixatie: Voor immunohistochemie, verwijder de biopten van de tang en plaats ze direct in glazen flesjes met 3 ml ijskoude gedehydrateerd aceton en proteaseremmers (fenylmethylsulfonylfluoride (35 mg / 100 ml aceton) en joodaceetamide (370 mg / aceton 100 ml )). Fix het weefsel gedurende de nacht bij -20 ° C (figuur 2). OPMERKING: De volgende stappen moeten worden performed in een zuurkast met geschikte nitril. De inbedding kit bevat componenten die overgevoeligheid, irritatie en / of allergische huidreacties kan veroorzaken. Al het afval moet worden afgevoerd als gevaarlijk afval. </li><li> Uitdroging: Verwijder de aceton met remmers en vervangen door verse gedroogde aceton (zonder inhibitoren) gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT). Verwijder het aceton en vervangen door methylbenzoaat gedurende 15 min. </li><li> Infiltratie: Bereid een werkoplossing van 5% methylbenzoaat oplossing glycol methacrylaat monomeer; 10 ml is voldoende voor een flesje. Kunststofleidingen Pasteur pipetten, afzuigen van de oplossing methylbenzoaat en vervangen door 3 ml behandelingsoplossing. Incubeer de biopten en overmaat behandelingsoplossing bij 4 ° C gedurende 2 uur; Pasteur pipetten kan worden bij alle volgende oplossing veranderingen, waaronder inbedding oplossing. </li><li> Ruil de verwerking oplossing om de 2 uur (3x 2 uur incubatie), zodat de totale infiltratie tijd van de biopsies in de behandelingsoplossing ten minste 6 uur. Invoegpapier labels in het boveneinde van de inbedding capsules biopsies identificeren. </li><li> Bereid een inbedding oplossing van 75 mg benzoyl- peroxide in 10 ml methacrylaat monomeer. Voeg 0,25 ml N, N-dimethylaniline poly (ethyleenoxide) (gaspedaal) de inbedding oplossing om de polymerisatiereactie te starten. Verwijder de behandelingsoplossing en plaats een biopt in de desbetreffende inbedding capsule behulp van een tang. </li><li> Langzaam vult de inbedding capsule naar de top met het inbedden oplossing en sluit de dop. Vermijd de biopsie te verstoren en het creëren van grote luchtbellen. Incubeer de capsules bij 4 ° C totdat de hars volledig is gepolymeriseerd. </li><li> Bewaar de ingebedde biopsieën bij -20 ° C in een 50 ml buis met circa 5 g silicagel. </li></ol> 3. Opdeling van GMA-ingebedde Endobronchiale Biopsieën <ol><li> Microscoop slide coating: Was de microscoop dia&#39;s in eenvaatwasser op een normale cyclus. Bedek de dia&#39;s en laat ze aan de lucht drogen. </li><li> Bereid een bekledingsoplossing van 10% poly-L-lysine (PLL) oplossing in gedestilleerd water. Dompel de dia&#39;s in coating-oplossing gedurende 5 minuten, en laat ze vervolgens aan de lucht drogen. Bewaar droge-PLL-gecoate glaasjes in hun originele dozen. </li><li> Wassen glasplaten stroken met 0,1% Tween 20 in gedestilleerd water. Spoel het glas met 70% ethanol en droog met keukenpapier. Geslepen glas bladen van de glazen strook met een mes maker. Bewaar de bladen in een container die beweging voorkomt dat de snijrand niet beschadigd of gekerfd. </li><li> Biopsie trimmen: Plaats de biopsie capsule in een capsule splitter en gekapt elke kant met behulp van een koolstof-staal single-edge mes. Verwijder de GMA-ingebedde biopsie en plaats deze stevig in een bankschroef. Trim overtollige GMA van rond de biopsie met behulp van de stalen blad. </li><li> GMA snijden. <ol><li> Bereid 0,05% ammonia-oplossing met gedestilleerd water. Plaats het glas mes en biopsie in the microtoom. Lijn de biopsie blok met het blad door aanpassing van de meshouder en de hoek van de biopsie blok zodat het blad plat rust tegen het oppervlak van het blok. </li><li> Snijd 2 pm dikke secties met behulp van de microtoom op een langzame snijsnelheid en een tang om de overdracht en zweven hoofdstukken over de ammoniak water. Float de secties voor 45-90 sec, waardoor zachte antigen retrieval en ontvouwen van de sectie. </li><li> Pick-up secties met microscoopglaasje. Controleer de biopsie histologie door snel te kleuren met toluidine blauw. </li><li> Droog de objectglaasjes op een hete plaat ingesteld op 50 ° C en 500 pi gefilterde toluidine blauwkleuring toepassing op een gedeelte met een kunststof pasteurpipet. Verwarm de sectie op de hete plaat totdat er een groene ring begint te ontstaan ​​aan de rand van de vlek, en dan was het af met water. </li><li> Met behulp van een lichtmicroscoop, controleer dan de biopsie histologie. Secties gebruikt voor immunohistochemie moeten goede gebieden van onbeschadigd lamina bevattenpropria en epitheel, met zo weinig klieren en slechts gladde spieren mogelijk. </li><li> Zoals in paragraaf 3.4.2, gesneden secties die goed histologie hebben en pak ze met PLL-gecoate microscoopglaasjes voor immunohistochemische kleuring. Snijd ten minste twee secties van elke biopsie voor analyse. Droge dia ten minste 1 uur. Na het drogen kan secties in folie verpakt en tot 2 weken bewaard bij -20 ° C, of ​​zij kunnen direct worden immunostained. </li></ol></li></ol> 4. Immunohistochemische kleuring van GMA-ingebedde Endobronchiale Biopsieën OPMERKING: Natriumazide is giftig. Bereid de 0,1% natriumazide oplossing in een zuurkast en uit de buurt van zuren. Contact met zuren giftig gas. <ol><li> Tekenen rond secties met behulp van een diamant getipt pen en schik de dia&#39;s op een kleuring rek. </li><li> Voer een Peroxidase blok. Bereid een peroxidase blok oplossing van 0,3% waterstofperoxide in 0,1% natriumazide oplossing. Apply 1 ml peroxidase blok secties en incubeer gedurende 30 minuten. </li><li> Bereid een wasoplossing van 0,05 M Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), pH 7,6. Was de glaasjes in TBS, 3 x 5 min. </li><li> Bereid een 1% BSA in DMEM blokkeeroplossing. Doe dit op voorhand en in grote volumes, hoeveelheid en bevriezen totdat het nodig is. Giet de dia&#39;s en incubeer de secties in blok oplossing gedurende 30 minuten om niet-specifieke antilichamen te blokkeren bindend. Als aspecifieke binding nog steeds optreedt, omvatten een 30 min incubatiestap met 5% serum blok van dezelfde soort als het secundaire antilichaam. </li><li> Verdun primair antilichaam (CD45 of CD1a) in TBS met de gewenste concentratie (CD45 verdund bij 1: 1000; CD1a verdund op 1: 1,00) en deze toepassen op dia&#39;s. Coverslip de secties en incubeer overnacht bij RT. </li><li> Was de glaasjes in TBS driemaal. Verdun gebiotinyleerd secundair antilichaam (gericht tegen de primaire antilichaam gastheersoort, in casu konijnen anti-muizen F (ab &#39;2)) in TBS om de gewenste concentratie (1:300 verdunning) en deze toepassen op dia&#39;s. Incubeer gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Bereid een streptavidine- biotine-peroxidase complex ten minste 30 minuten voor gebruik. Zorg ervoor dat er genoeg is om alle dia&#39;s te dekken. Was de glaasjes in TBS driemaal. Breng de oplossing van de glijbanen en incubeer gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Was de glaasjes in TBS driemaal. Bereid 3-amino-9-ethylcarbazool (AEC) peroxidase substraatoplossing (gemaakt volgens de instructies van de fabrikant). Toepassen op de dia en incubeer gedurende 20-30 min of totdat de gewenste kleurintensiteit ontwikkelt. </li><li> Spoel de dia&#39;s in stromend water gedurende 5 minuten. Tegenkleuring de secties met gefilterde Mayer&#39;s hematoxyline oplossing gedurende 2 minuten. Was de dia&#39;s in stromend water gedurende 5 minuten. </li><li> Giet de dia&#39;s en hebben betrekking op de secties met permanente waterig montage medium. Droog de objectglaasjes bij 80 ° C in een droogoven. Laat de dia&#39;s om af te koelen, en vervolgens monteer ze met DPX en plaats een dekglaasje. </li></ol> 5. Staining Analyse <ol><li> Analyseer de secties 40x vergroting met behulp van een lichtmicroscoop met een gemonteerde camera verbonden met een computer. Opmerking: Voor mobiele analyse Aantal positief gekleurd, kernhoudende cellen in de lamina propria en bronchiale epitheel intact, exclusief gebieden van gladde spier, klieren, grote bloedvaten, en verkeerde of beschadigd weefsel. </li><li> Middel de cellen en corrigeren gemiddelde aantal cellen voor het gebied van de lamina propria en de lengte van het epitheel. Het gebied van de lamina propria en de lengte van het epitheel kan worden berekend met een beeldanalyseprogramma. </li></ol> 6. enzymatische afbraak van Endobronchiale Biopsieën <ol><li> Wassen biopsies: een steriele tang, plaats intact biopsieën in een 15 ml conische buis met 10 ml Hank&#39;s gebufferde zoutoplossing (HBSS) (figuur 3). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een schudapparaat bij 30 rpm. Breng de biopten een steriele dish door decanteren van de inhoud van de 15 ml buis met HBSS. </li><li> Verstoren slijm met DTT: Vervang HBSS in de buis met 10 ml HBSS bevattende 5 mM 1,4-dithiothreitol (DTT). Breng de biopten terug in de 15 ml buis met steriele pincet. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een schudapparaat bij 30 rpm. </li><li> Vortex de buis zachtjes gedurende 15 sec. Breng de biopsieën op een steriele schaal door decanteren van de inhoud van de 15 ml buis met HBSS en DTT. </li><li> de biopten overbrengen aan het kweekmedium: Vervang de HBSS en DTT in de buis met 10 ml RPMI 1640 kweekmedium. Breng de biopten terug in de 15 ml buis met steriele pincet. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een schudapparaat bij 30 rpm. </li><li> Verteren biopsies met collagenase en DNase. <ol><li> Bereid een oplossing van collagenase digestie II (0,25 mg / ml) en DNase (0,2 mg / ml) in voorverwarmde RPMI bevattende 1 M HEPES-oplossing. Voeg 500 ul van ontsluitingsoplossing per putje in een 48-well tissue culture plaat. </li><li> Plaats 1 biopsie per putje in de spijsvertering oplossing. Incubeer de plaat op een schuddend platform voor 60 min bij 37 ° C bij 220 rpm. Pipet op en neer na 30 minuten opnieuw te verspreiden de biopten, en na 60 min, om het weefsel volledig te splitsen. </li></ol></li><li> Het voorbereiden van enkele cel suspensies. <ol><li> Zwembad samen de verteerde biopten van de putjes in een 50 ml buis door deze door een 40 um cel zeef. Verzamel de overige cellen door het wassen van de putjes met ijskoude FACS buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 2% foetaal runderserum). </li><li> Knijp het restmateriaal op de cel zeef met de achterkant van de plunjer van een injectiespuit. Centrifugeer de gedigereerde cellen bij 400 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml ijskoude FACS buffer. Tel de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer en trypan blauwe vlekken op de levensvatbaarheid van de cellen te beoordelen. </li></ol></li></ol><ol><li> Resuspendeer de celpellet ongeveer 1 x 10 6 cellen in 200 ui FACS-buffer. </li><li> Toevoegen cellevensvatbaarheid kleurstof voor uitsluiting van dode cellen volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Voeg 5 ul van FcR blokkerende reagens en incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg celoppervlak antilichamen tegen CD45 (2 ui), geslacht (CD3, CD20, CD56, CD66abce en CD14; 2 pi elk), CD16 (0,5 ui), HLA-DR (3 ui), CD11c (5 ui), CD123 (5 ui), cd1c (3 ui) en CD103 (2 ui) en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Details betreffende antilichamen kunnen worden gevonden in het gedeelte werkwijzen, maar titreren en optimaliseren van de antilichamen om de precieze flowcytometer gebruikt. Wassen overtollige antilichamen met PBS gedurende 5 minuten bij 400 x g. Het verwerven van de monsters verse op een flowcytometer of voorafgaand vaststellen van de cellen in 1% paraformaldehyde later acquisition. </li><li> Identificeer humane DCs in longen biopten met behulp van een flowcytometrie test 18 (figuur 4). Opmerking: Het gebruik van een stromingscytometrie-analyse software, worden immuuncellen onderscheiden van andere longcellen door gating op CD45. Dode cellen kunnen worden uitgesloten als cellen die positief zijn voor de LIVE-/ DEAD kleurstof zijn. Van alle levende CD45 + cellen, geslacht cellen (B-cellen, T-cellen, NK-cellen, neutrofielen en monocyten) worden uitgesloten met een cocktail van antilichamen tegen CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 en CD16 in een kanaal. Naar aanleiding van dat, HLA-DR + cellen de identificatie van alle menselijke DCs zal toestaan. MDC kan worden onderscheiden van PDC&#39;s op basis van de expressie van CD11c en het gebrek aan CD 11 c, respectievelijk. MDC kan verder worden onderverdeeld in cd1c + MDC of CD141 +. </li></ol>

<ol><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+dendritic+cells+at+the+innate-adaptive+immune+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface.</a> J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).</li>
<li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+lung+dendritic+cells+at+the+origin+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma.</a> Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).</li>
<li>Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+monocyte-derived+cells%3A+Two+complementary+and+integrated+functional+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems.</a> Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).</li>
<li>Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+human+pulmonary+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).</li>
<li>Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+rare-event+detection+and+analysis+of+dendritic+cell+subsets+in+broncho-alveolar+lavage+fluid+and+peripheral+blood+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry.</a> Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).</li>
<li>Masten, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+myeloid+and+plasmacytoid+dendritic+cells+in+human+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung.</a> J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).</li>
<li>Ten Berge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+isolating+dendritic+cells+from+human+bronchoalveolar+lavage+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid.</a> J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).</li>
<li>Yu, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD1c%2B+dendritic+cells+drive+the+differentiation+of+CD103%2B+CD8%2B+mucosal+effector+T+cells+via+the+cytokine+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta.</a> Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).</li>
<li>Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+potent+and+poorly+functional+human+lung+accessory+cells+based+on+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence.</a> J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).</li>
<li>Sertl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+with+antigen-presenting+capability+reside+in+airway+epithelium%2C+lung+parenchyma%2C+and+visceral+pleura%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura.</a> J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).</li>
<li>van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+immunophenotype+of+mononuclear+phagocytes+and+dendritic+cells+in+the+human+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).</li>
<li>Schlitzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+transcription+factor-dependent+CD11b%2B+dendritic+cells+in+human+and+mouse+control+mucosal+IL-17+cytokine+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses.</a> Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Analysis+of+Myeloid+Cells+in+Human+Blood%2C+Bronchoalveolar+Lavage%2C+and+Lung+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
<li>Haniffa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissues+contain+CD141hi+cross-presenting+dendritic+cells+with+functional+homology+to+mouse+CD103%2B+nonlymphoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells.</a> Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).</li>
<li>Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+resin+sections%3A+a+comparison+of+resin+embedding+techniques+for+small+mucosal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies.</a> Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).</li>
<li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seventeen-colour+flow+cytometry%3A+unravelling+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).</li>
<li>Baharom, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cells+and+Monocytes+with+Distinct+Inflammatory+Responses+Reside+in+Lung+Mucosa+of+Healthy+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans.</a> J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammatory+responses+in+the+airways+and+peripheral+blood+after+short-term+exposure+to+diesel+exhaust+in+healthy+human+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers.</a> Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).</li>
<li>Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+density%2C+distribution%2C+and+surface+phenotype+of+intraepithelial+class+II+major+histocompatibility+complex+antigen+%28Ia%29-bearing+dendritic+cells+%28DC%29+in+the+conducting+airways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways.</a> J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).</li>
<li>Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+flow+cytometry%3A+helping+to+make+sense+of+high-dimensional+immunology+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data.</a> Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dit document beschrijft hoe u een gedetailleerde ruimtelijke en fenotypische karakterisatie van longweefsel-ingezeten DCs bij gezonde mensen te genereren met behulp van immunohistochemie en flowcytometrie op endobronchiale mucosale biopten tijdens bronchoscopie verzameld. In de volgende paragrafen kritische stappen in het protocol worden in detail besproken. Kritische Stappen met het Protocol Snijden en immunohistochemie: Het is cruciaal om de biopsie blokken bij -2...

De longen zijn voortdurend in contact met de buitenomgeving en zijn zeer gevoelig voor zowel onschadelijke deeltjes en microben met het vermogen om ziekte te veroorzaken. Daarom is het essentieel voor het immuunsysteem potente immune responsen tegen binnendringende pathogenen te monteren, maar het is even belangrijk om tolerantie te behouden om geïnhaleerde antigenen die geen ziekte veroorzaken. Potente immune surveillance, wordt het ademhalingssysteem bekleed met een netwerk van immuuncellen, waaronder dendritische cellen (DCs). DCs zijn professionele antigeenpresenterende cellen met het unieke vermogen om naïeve T-cellen te activeren. In menselijke longen, resident DC treedt een antigeen en vervolgens verwerken en transporteren deze naar de long-drainerende lymfeknopen voor presentatie aan en activering van T-cellen 1, 2, 3. In het menselijke immuunsysteem, kan DCs worden onderverdeeld in verschillende subgroepen, met Distinct maar overlappende functies: cd1c + en CD141 + myeloïde DCs (MDCs) en CD123 + plasmacytoide DCs (PDC&#39;s) 4, 5. Terwijl de meest gedetailleerde kennis over humane DCs afkomstig uit studies in bloed, is het nu duidelijk dat de menselijke longen ook haven zeldzame populaties van DC subsets met T-cel stimulerende capaciteit 6, 7, 8, 9. Echter, accumuleren gegevens blijkt dat immuuncellen, zoals DCs verschillen in frequentie, fenotype en functie afhankelijk van de anatomische locatie 10. Derhalve is het belangrijk om immuuncellen bestuderen van de desbetreffende weefsel hun bijdrage aan lokale immuniteit en tolerantie begrijpen. Bij elkaar genomen, dit onderstreept de noodzaak om long-resident DCs studeren bij de aanpak van longziekten, ondanks het bloed DC&#39;s die meer direct beschikbaar en toegankelijk<html> bij mensen. De eerste studies die long-DCs resident bij mensen onderzocht zich primair op morfologie en de expressie van één markers, zoals HLA-DR en CD 11 c, in weefselsecties middels immunohistochemie 11, 12, 13. Daarentegen recentere studies doorgaans gebruikt flowcytometrische analyses verschillende immuuncelsubklassen bestuderen. Aangezien het moeilijk is om een ​​celoppervlak marker die uniek identificeert een bepaald DC deelverzameling vinden potentiële beperking van studies die alleen vier kleuren flowcytometrie is het risico van het opnemen celpopulaties met gelijke fenotypische markers als DCs. Zo wordt CD11c uitgedrukt op alle myeloïde DC en de meeste monocyten. Anderzijds, in studies toepassing geavanceerdere flowcytometrie panelen werden goedaardige longweefsel van chirurgische resectie patiënten typisch gebruiktxref &quot;&gt; 10, 14, 15, 16, hoewel het onduidelijk is of deze zeldzame populaties werkelijk representatief DCs bij gezonde proefpersonen. Kortom, zijn studies grotendeels beperkt door het feit dat operatief verwijderd of volledig menselijk longweefsel schaars. Om een ​​aantal van deze beperkingen te overwinnen, dit werk wordt beschreven hoe u een gedetailleerde analyse van de ruimtelijke verdeling en een fenotypische identificatie van DCs in mucosale endobronchiale biopsieën verkregen bij gezonde vrijwilligers die een bronchoscopie ondergaan, uit te voeren. Verschillende kleine biopten kunnen worden verzameld van elk individu en vervolgens kan worden ingebed voor het snijden en analyse met behulp van immunohistochemie of enzymatisch verteerd voor geavanceerde flowcytometrische analyse. Via long weefsel in de vorm van endobronchiale biopsieën verkregen bronchoscopies verleent het voordeel dat het mogelijk de st voerenUdy op gezonde vrijwilligers, anders dan open chirurgie van de longen die voor de hand liggende redenen, is beperkt tot patiënten die thoracale chirurgie. Bovendien het weefsel dat wordt bemonsterd tijdens een bronchoscopie van gezonde vrijwilligers fysiologisch normaal, in tegenstelling tot een niet-getroffen gebied van longweefsel bij patiënten met een longziekte. Anderzijds, de biopsieën zijn klein en het aantal cellen teruggehaald, zelfs als pooling meerdere biopten, beperkt het soort analyses kunnen worden uitgevoerd. Hoewel de huidige werk richt zich op DCs, de beschreven kan direct worden uitgebreid methoden om andere (immuun) cellen van belang dat in het menselijk mucosale longweefsel wonen bevatten. Bovendien zijn de protocollen zijn ook direct van toepassing op monsters verkregen van patiënten die lijden aan pulmonaire ziekten waarbij bronchoscopie hoort bij stellen van de diagnose, zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), sarcoïdose, of longkanker.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Bronchoscopie</td></tr><tr><td>Bronchoscope BF1T160</td><td>Olympus</td><td>BF1T160</td><td></td></tr><tr><td>Lichtbron&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>Exera CV-160</td><td></td></tr><tr><td>Fenestreerbare forceps</td><td>Olympus</td><td>FB21C</td><td>Wordt gebruikt om biopten te nemen</td></tr><tr><td>Bite Block</td><td>Conmed</td><td>1429</td><td>20 mm x 27 mm</td></tr><tr><td>Glucose 25%&nbsp;</td><td></td><td></td><td>500 ml intraveneus</td></tr><tr><td>Glycopyrroniumbromide 0,2 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Intraveneus. Voorkomt afscheiding van slijm/speeksel</td></tr><tr><td>Mengsel Midazolam 1 mg/ml p.o</td><td></td><td></td><td>Kan worden gebruikt voor extra ontspanning</td></tr><tr><td>Lidocaine, 40 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Mond en keel toediening / Gegargeld</td></tr><tr><td>Lidocaine 100 mg/ml spray</td><td></td><td></td><td>Toegediend aan de achterkant van de keel</td></tr><tr><td>Lidocaine 20 mg/ml spray</td><td></td><td></td><td>Toegediend via bronchoscoop aan de luchtwegen</td></tr><tr><td colspan="4">GMA verwerking en inbedding</td></tr><tr><td>Glazen flacons</td><td></td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Moleculaire zeefjes, 4 &#197;</td><td>Alfa Aesar</td><td>88120</td><td>3-4 mm diameter pellets</td></tr><tr><td>Fenylmethysulfonylfluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7626</td><td>0,035 g/100 ml aceton</td></tr><tr><td>Iodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>0,37 g/100 ml aceton</td></tr><tr><td>Polyethyleen-plat&nbsp; TAAB inbedding capsules</td><td>TAAB laboratoria</td><td>C094</td><td>500x 8 mm diameter, polyethyleen, platte bodem capsules</td></tr><tr><td>Capsule houder</td><td>TAAB laboratoria</td><td>C054</td><td>Houdt 25 8 mm capsules</td></tr><tr><td>JB-4 GMA inbeddingskit</td><td>Polysciences</td><td>00226</td><td>Bevat JB-4 oplossing A (0026A-800), JB-4 oplossing B (0026B-3.8), benzoylperoxide (02618-12)</td></tr><tr><td>Methylbenzoaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27614-1L</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel met vochtindicator</td><td>Scharlau</td><td>GE0043</td><td>2,5-6 mm&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">GMA sneden</td></tr><tr><td>Glazen microscoopglazen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10143562CEF</td><td>Gesneden randen, gefroste eind</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-500mL</td><td>1:10 voor werkoplossing</td></tr><tr><td>Glazen stripjes voor ultramicrotomie</td><td>Alkar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Wasoplossing (0,1% Tween20)</td></tr><tr><td>LKB 7800B Knifemaker</td><td>LKB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capsule splitter</td><td>TAAB laboratoria</td><td>C065</td><td></td></tr><tr><td>Koolstofstaal enkelzijdige mesjes</td><td>TAAB laboratoria</td><td>B054</td><td></td></tr><tr><td>Vijzel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniak, 25%</td><td>VWR</td><td>1133.1000</td><td>2 ml in 1 L, 1:500 (0,05%)</td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica RM 2165</td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica CLS 150 XE</td></tr><tr><td>Microscoop met zwenkstandaard</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica MZ6</td></tr><tr><td colspan="4">GMA Immunohistochemie</td></tr><tr><td>Diamantpunt pen</td><td>Histolab</td><td>5218</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide 30% oplossing</td><td>AnalaR Normapur</td><td>23619.264</td><td></td></tr><tr><td>Natriumaziet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>VWR chemicaliën</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>Millipore</td><td>82-045-2</td><td>Probumine BSA diagnostische kwaliteit</td></tr><tr><td>Dulbecco's aangepast arendsmedium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>Anti-menselijke CD45 antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>304002</td><td>Muis monoklonaal, klon HI30, isotype IgG1k. Werkconcentratie van 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Anti-menselijke CD1a antilichaam</td><td>AbD Serotech</td><td>MCA80GA</td><td>Muis monoklonaal, klon NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Werkconcentratie van 10 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>Muis monoklonaal IgG1 isotype controle</td><td>Abcam</td><td>ab27479</td><td></td></tr><tr><td>Muis monoklonaal IgG2a isotype controle</td><td>Dako</td><td>X094301-2</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Elite standaardkit</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>AEC (3-amino-9-ethylcarbazool) peroxidase substraat kit</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4200</td><td></td></tr><tr><td>Mayers hematoxyline</td><td>HistoLab</td><td>01820</td><td></td></tr><tr><td>Permanent Aqueous Montage Medium</td><td>AbD Serotech</td><td>BUF058C</td><td></td></tr><tr><td>Droogoven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPX permanente montageoplossing&nbsp;</td><td>VWR</td><td>360292F</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica DMLB</td></tr><tr><td>Microscoopcamera</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica DFC 320</td></tr><tr><td>Analysesoftware</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica Qwin V3</td></tr><tr><td colspan="4">Enzymatische vertering</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55021C</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001&nbsp;ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platform rocker</td><td>Grant instruments</td><td>PMR-30</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische buizen</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>40

human lung dendritische cellen: ruimtelijke verdeling en fenotypische identification in endobronchiale biopten middels immunohistochemie en flowcytometrie

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

De longen worden voortdurend blootgesteld aan de externe omgeving, die naast onschadelijke deeltjes ook ziekteverwekkers, allergenen en toxines bevat. Om tolerantie te behouden of een immuunrespons te induceren, moet het immuunsysteem ingeademde antigenen op de juiste manier aanpakken. Longdendritische cellen (DC's) zijn essentieel om een delicaat evenwicht te behouden om immuniteit te initiëren wanneer dat nodig is, zonder bijkomende schade aan de longen te veroorzaken door een overdreven ontstekingsreactie. Hoewel er een gedetailleerd begrip is van het fenotype en de functie van immuuncellen zoals DC's in menselijk bloed, is de kennis van deze cellen in minder toegankelijke weefsels, zoals de longen, veel beperkter, omdat studies van menselijke longweefselmonsters, vooral van gezonde individuen, schaars zijn. Dit werk presenteert een strategie om een gedetailleerde ruimtelijke en fenotypische karakterisering van in de long verblijvende DC's in gezonde mensen te genereren die een bronchoscopie ondergaan voor de bemonstering van endobronchiale biopsieën. Er kunnen verschillende kleine biopsieën van elke persoon worden verzameld en vervolgens worden ingebed voor ultrafijne secties of enzymatisch worden verteerd voor geavanceerde flowcytometrische analyse. De beschreven protocollen zijn geoptimaliseerd om maximale informatie op te leveren uit kleine weefselmonsters die onder stabiele omstandigheden slechts een lage frequentie van DC's bevatten. Hoewel het huidige werk zich richt op DC's, kunnen de beschreven methoden direct worden uitgebreid om andere (immuun)cellen van belang in het mucosale longweefsel op te nemen. Bovendien zijn de protocollen ook direct toepasbaar op monsters verkregen van patiënten met longziekten waarbij bronchoscopie deel uitmaakt van het vaststellen van de diagnose, zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), sarcoïdose of longkanker.

Studies karakteriseren ademhalingssysteem weefsel-resident immuuncellen, zoals DCs, beperkt, voornamelijk vanwege het feit dat operatief verwijderd of volledig menselijk longweefsel schaars. Hier, een minder invasieve werkwijze voor het verkrijgen van longweefsel endobronchiale biopsies (EBB) van gezonde vrijwilligers en ontwikkelde protocollen bij de immuuncellen in het weefsel cytometrie studie gebruikt immunohistochemie of flow geschetst. <p class="jove_content" fo:keep-together.w...

In de longen aanwezige immuuncellen, inclusief dendritische cellen (DC's) bij mensen, zijn cruciaal voor de verdediging tegen ingeademde ziekteverwekkers en allergenen. Echter, vanwege de schaarste aan menselijk longweefsel, zijn onderzoeken beperkt. Dit werk presenteert protocollen om humane mucosale endobronchiale biopten te verwerken voor het bestuderen van long-DC's met behulp van immunohistochemie en flowcytometrie.

Human Lung dendritische cellen: ruimtelijke verdeling en fenotypische Identification in Endobronchiale biopten middels immunohistochemie en flowcytometrie

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er veel informatie kan worden gegenereerd uit kleine weefselmonsters die tijdens een bronchoscopie zijn verkregen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de mucosale immunologie, waarbij bronchoscopie deel uitmaakt van het stellen van de diagnose, zoals bij COPD, sarcoïdose of longkanker. De visuele demonstratie van deze procedure stelt personen die nieuw zijn met deze methode in staat om te herkennen wanneer de enzymatische digestie voltooid is. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Greg Rankin, een postdoc uit het laboratorium van onze samenwerkingspartner aan de Ume, samen met Faezzah Baharom.

human-lung-dendritic-cells-spatial-distribution-phenotypic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een sterk gezuiverde bereiding van de muis long dendritische cellen wordt beschreven. Specifieke aandacht wordt gegeven aan de isolatie van de conventionele dendritische cel subset.

Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

We beschrijven een strategie om de rijping en migratie van pulmonale dendritische cellen te volgen in reactie op ovalbumine in de setting van ovalbumine geïnduceerde allergische luchtwegontsteking. Deze strategie kan worden aangepast aan de migratie van pulmonale dendritische cellen te beoordelen in de instellingen van de infectie.

Analyse van de pulmonale dendritische cel maturatie en migratie tijdens de allergische luchtwegontsteking

This video describes the immunohistochemical staining technique to identify dendritic cells from endobronchial biopsies.

Immunohistochemical Staining: A Method for Obtaining Spatial Information from Thin Tissue Sections

This video demonstrates the use of flow cytometry to identify and count various immune cells in bronchoalveolar lavage fluid. Initially, single immune cells are identified using a viability dye, followed by differential staining of surface marker proteins, enabling the precise enumeration of each cell type.

Identification and Enumeration of Immune Cells in Bronchoalveolar Lavage Fluid by Flow Cytometry

We beschrijven een werkwijze voor het precisie-cut Lung Schijfjes (PCLS) en immunokleuring ze naar de lokalisatie van diverse immuun celsoorten te visualiseren in de longen. Ons protocol kan worden uitgebreid tot de locatie en de functie van vele verschillende celtypen te visualiseren onder verschillende omstandigheden.

Precisie-cut Mouse Lung Slices Live Pulmonary visualiseren van dendritische cellen

We beschrijven een methode voor de verwerking van bronchoalveolaire spoeling vloeistof en matched perifeer bloed van chronisch HIV-geïnfecteerde individuen op antiretrovirale therapie om pulmonale HIV-reservoirs te beoordelen. Deze methoden resulteren in de verwerving van zeer zuivere CD4 T-cellen en alveolaire macrofagen die vervolgens kunnen worden gebruikt voor immunophenotypering en HIV-DNA/RNA-quantificaties door ultragevoelige polymerase-kettingreactie.

Verwerking van bronchoalveolaire lavage vloeistof en geëvenaard bloed voor alveolaar macrofaag en CD4+ T-cel Immunophenotypering en HIV-reservoir beoordeling

Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor weefseldissociatie en cellulaire fractioneringsbenaderingen die verrijking van levensvatbare epitheelcellen uit proximale en distale gebieden van de menselijke long mogelijk maken. Hierin worden deze benaderingen toegepast voor de functionele analyse van longepitheelvoorlopercellen door het gebruik van 3D organoïdencultuurmodellen.

Isolatie en verrijking van menselijke longepitheelvoorlopercellen voor organoïde cultuur

Haemophilus influenzae induceert ontsteking in de luchtwegen. Dit artikel zal zich richten op het gebruik van flowcytometrie en confocale microscopie om immuunresponsen door fagocyten en lymfocyten als reactie op deze bacterie te definiëren.

Beoordeling van respiratoire immuunresponsen op Haemophilus Influenzae

In deze studie presenteren we een effectief en reproduceerbaar protocol om de immuunpopulaties van het muriene ademhalingssysteem te isoleren. We bieden ook een methode voor de identificatie van alle aangeboren en adaptieve immuuncellen die zich in de longen van gezonde muizen bevinden, met behulp van een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel.

Flowcytometrische analyse voor identificatie van de aangeboren en adaptieve immuuncellen van muizenlong

Hier wordt een reproduceerbare, betaalbare en robuuste methode gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van primaire bronchiale epitheelcellen voor biobanking op lange termijn en het genereren van gedifferentieerde epitheelcellen door cultuur op de lucht-vloeistofinterface.

Het isoleren van bronchiale epitheelcellen uit gereseceerd longweefsel voor biobanking en het opzetten van goed gedifferentieerde lucht-vloeistof interfaceculturen

Ontdek protocollen voor het verwerken van endobronchiale biopten om long-dendritische cellen te bestuderen met immunohistochemie en flowcytometrie. Deze methoden helpen onderzoekers bij het begrijpen van longimmuniteit.

Human Lung dendritische cellen: ruimtelijke verdeling en fenotypische Identification in Endobronchiale biopten middels immunohistochemie en flowcytometrie (Video) | JoVE Journal

Human Lung dendritische cellen: ruimtelijke verdeling en fenotypische Identification in Endobronchiale biopten middels immunohistochemie en flowcytometrie

Meer video's verkennen