Isolatie en karakterisering van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng en foetale Placenta
3 april 2017
Hier presenteren we een protocol voor de ontleding van menselijke navelstreng (UC) en foetale placenta monster in koord bekleding (CL), Wharton's gelei (WJ), cord-placenta junctie (CPJ) en foetale placenta (FP) voor het isoleren en karakterisering van mesenchymale stromale cellen (MSC's) met de explantaatkweek techniek.
Het algemene doel van dit protocol is om mesenchymale stromale cellen te isoleren uit vier verschillende perinatale weefselbronnen, de navelkoordvoering, Wharton's jelly, navelkoord-placenta overgang en foetale placenta. Deze methode kan helpen het veld van stamcelbiologie te bevorderen, alternatieve geneeskunde door speciaal kwaliteit mesenchymale stamcellen te verkrijgen, op een niet-invasieve manier. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het productief grote aantallen hoogwaardige homogene celpopulaties oplevert uit verschillende perinatale weefselbronnen.
Multipotente navelkoord-mesenchymale stromale cellen afgeleid van deze techniek kunnen worden gebruikt om verschillende ziekten en aandoeningen te behandelen, omdat ze primitiever zijn dan mesenchymale stamcellen geïsoleerd uit volwassen weefsels. Deze methode kan inzicht geven in de kenmerken van mesenchymale stromale cellen uit verschillende segmenten en specifieke niches van het koord en de placenta. Begin door de monster in een 150 millimeter petrischaal op ijs in een bioveiligheidscabinet te plaatsen en gebruik een naald en spuit om het weefsel meerdere keren te spoelen met ijskoud PBS.
Wanneer alle bloedklonters zijn verwijderd, onderzoek het monster zorgvuldig om de verschillende anatomische regio's te identificeren. Gebruik vervolgens een pincet om het foetale uiteinde van het navelkoord vast te grijpen en gebruik een schaar om voorzichtig een incisie te maken aan de bovenkant van de navelkoord-placenta overgang. Maak een tweede incisie onder de overgang om de navelkoord-placenta overgang van de placenta te scheiden.
En splits de gescheiden weefsels in individuele petrischalen. Snijd vervolgens het navelkoord longitudinaal om de bloedvaten en de omringende Wharton's jelly volledig bloot te leggen zonder het epitheel te verstoren. Gebruik een scalpel om de Wharton's jelly weg te schrapen van de bloedvaten en het interepithelium van de subamnion.
Verwijder vervolgens de bloedvaten en breng eventueel overgebleven perivasculare jelly onder en rond de bloedvaten over naar de Wharton's jelly-schaal en plaats het resterende navelkoordvoeringweefsel in zijn eigen schaal. Wanneer alle weefsels zijn gedissecteerd, vervang het PBS in elke schaal met drie tot vijf milliliter trypsine en gebruik een schaar om elk weefselmonster in stukken van een tot twee millimeter te snijden voor een 30 minuten incubatie bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide. Gebruik een fasecontrastmicroscoop om de gedeeltelijke vertering te observeren door de afgifte van cellen uit het weefsel te visualiseren.
Aan het einde van de periode van gedeeltelijke vertering, neutraliseer de trypsine met een gelijk volume kweekmedium en breng de monsters over in afzonderlijke 50 milliliter conische buizen. Laat de weefselstukken drie minuten bezinken. Zuig vervolgens voorzichtig het supernatant af en plateer 15 tot 20 gedeeltelijk verteerde weefselstukken per monster in individuele 75 vierkante centimeter weefselkweekkolven.
Voeg vervolgens negen milliliter kweekmedium toe voor een incubatie van twee tot drie dagen bij 37 graden Celsius. Ververs het kweekmedium na drie dagen en onderzoek de xplanten door fasecontrastmicroscopie op celuitgroei. Wanneer de celgroei 70 procent confluentie bereikt, dissocioeer de cellen in één tot twee milliliter trypsinoplossing per kolf, draai de kolf om een gelijkmatige coating met de enzymoplossing te verkrijgen en incubeer de culturen gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius.
Neutraliseer vervolgens de reactie met één tot twee milliliter kweekmedium. Verzamel de cellen door centrifugatie, resuspendeer het pellet in kweekmedium voor subculture in een zaaidensiteit van één keer tien tot de vierde cellen per vierkante centimeter. De cellen uit de navelkoordvoering en Wharton's jelly-culturen vertonen waarden van kolonievormende efficiëntie van respectievelijk 59 en 80 kolonies.
De waarde van de kolonievormende efficiëntie van de navelkoord-placenta overgang cellen is echter vergelijkbaar met die waargenomen voor beenmerg mesenchymale stamcellen, wat suggereert dat afgeleide cellen van de navelkoord-placenta overgang hogere prolifertieve en zelfvernieuwende capaciteiten hebben. Een metrische analyse van de enkele celsuspensies geïsoleerd uit deze perinatale weefsels geeft aan dat de percentages positieve cellen voor specifieke mesenchymale stamcelmarkers uit alle vier weefselbronnen vergelijkbaar zijn met die uitgedrukt door standaard beenmerg afgeleide mesenchymale cellen. De mediane fluorescentie-intensiteit verhoudingen wijzen er echter op dat afgeleide cellen van Wharton's jelly en navelkoord-placenta overgang erg vergelijkbaar of hoger zijn dan die van de navelkoordvoering in foetale placenta-afgeleide cellen.
Interessant is dat, ondanks hun variërende kolonievormende efficiëntie waarden, alle cellen uit de verschillende perinatale bronnen vergelijkbare niveaus van pluripotentiemarkers vertonen bij kwantitatieve RTPCR analyse, behalve de afgeleide mesenchymale stromale cellen van de navelkoord-placenta overgang, die de hoogste expressieniveaus vertoonden voor alle geteste pluripotentiemarkers. Verder differentiëren mesenchymale stromale cellen geïsoleerd uit alle perinatale bronnen gemakkelijk in adipogene, chondrogene en osteogene celtypen, evenals het aantonen van trilineaire differentiatie. Hoewel het differentiatiepotentieel varieert afhankelijk van de mesenchymale stromale celbron.
Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee tot drie uur worden voltooid als het efficiënt wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om laterale techniek te oefenen en kruisbesmetting tussen de weefselbronnen te vermijden. Deze techniek heeft de weg gebaand voor onderzoekers om de aard van stamcelniches in perinatale weefsels te onderzoeken.
Overzicht
Dit protocol beschrijft de dissectie van de menselijke navelstreng en foetale placenta om mesenchymale stromale cellen (MSC's) te isoleren met behulp van de explantaatcultuurtechniek. De methode maakt de karakterisering van MSC's uit verschillende perinatale weefselbronnen mogelijk, wat bijdraagt aan vorderingen in de stamcelbiologie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamcelbiologie
- Regeneratieve Geneeskunde
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Mesenchymale stromale cellen (MSC's) hebben een therapeutisch potentieel vanwege hun multipotentie.
- Perinatale weefsels zijn rijke bronnen van primitieve MSC's.
- Dit protocol heeft tot doel de opbrengst van hoogwaardige MSC's uit de navelstreng en placenta te verhogen.
- Inzicht in de kenmerken van MSC's uit verschillende weefselbronnen kan bijdragen aan hun klinische toepassingen.
Doel van de studie
- Om MSC's te isoleren uit het omhulsel van de navelstreng, de gelei van Wharton, de overgang tussen navelstreng en placenta en de foetale placenta.
- Om de kwaliteit en kenmerken van MSC's afkomstig uit deze weefsels te evalueren.
- Om een niet-invasieve methode te bieden voor het verkrijgen van MSC's voor onderzoek en therapeutisch gebruik.
Gebruikte methoden
- Dissectie van de navelstreng en placenta in afzonderlijke anatomische regio's.
- Gebruik van trypsine voor gedeeltelijke digestie van weefselmonsters.
- Cultuur van gedissecteerde weefsels onder specifieke mediumcondities.
- Beoordeling van celgroei en karakterisering met behulp van microscopie en flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- Hoge kolonievormende efficiëntie waargenomen in cellen uit de gelei van Wharton en de overgang tussen navelstreng en placenta.
- Alle MSC's vertoonden soortgelijke pluripotentiemarkers, met variaties in de expressieniveaus.
- MSC's demonstreerden het vermogen om te differentiëren in meerdere lineages.
- De techniek kan efficiënt in twee tot drie uur worden voltooid.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het isoleren van hoogwaardige MSC's uit perinatale weefsels.
- Inzicht in de eigenschappen van MSC's uit verschillende bronnen kan hun therapeutische toepassingen verbeteren.
- Verdere exploratie van stamcelniches in perinatale weefsels wordt aangemoedigd.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt de isolatie van mesenchymale stromale cellen (MSC's) uit verschillende perinatale weefselbronnen mogelijk, wat een niet-invasief en ethisch gunstig alternatief biedt voor MSC's afgeleid uit beenmerg. Door anatomische regio's te vergelijken, zoals de navelstreng-placenta-overgang (CPJ), de gelei van Wharton (WJ), de wand van de navelstreng (CL) en de foetale placenta (FP), ondersteunt deze methode de validatie van targets en het mechanistisch verminderen van risico's in trajecten voor regeneratieve geneeskunde. De hogere kolonievormende efficiëntie en expressie van pluripotentiemerkers die waargenomen worden in CPJ-afgeleide MSC's, bieden voorspellend vertrouwen voor toepassingen in celtherapie, wat helpt bij de identificatie van lead-kandidaten en portfoliotriage.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door MSC's te isoleren uit specifieke perinatale niches met variërende proliferatie- en zelfvernieuwingscapaciteiten.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele validatie van multipotentie in adipogene, chondrogene en osteogene lijnen.
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in het doelwit door CPJ te identificeren als een potente MSC-bron met superieure kolonievormende efficiëntie en expressie van pluripotentiemarkers.
Screening & Assayontwikkeling
- Operationele waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door het verkrijgen van homogene, adherente MSC-populaties met gedefinieerde oppervlaktemarkerprofielen (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105).
- Wetenschappelijke waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via consistente explantaatkweektechnieken en kwantitatieve resultaten zoals colony-forming efficiency en flowcytometrie-metrieken.
- Operationele waarde: Benadrukt de geschiktheid voor screening en schaalbaarheid, waarbij het protocol in twee tot drie uur wordt voltooid, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen in preklinische screeningscascades mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten en de afstemming van translationele biomarkers door het aantonen van het vermogen tot trilineage-differentiatie, een cruciale functionele readout voor preklinische validatie.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het leveren van MSC's die een adherente, fibroblastoïde morfologie en oppervlaktemerkerexpressie behouden die vergelijkbaar is met die van uit het beenmerg afgeleide MSC's.
- Wetenschappelijke waarde: Richt zich op de voorspellende waarde voor risicoreductie door aan te tonen dat CPJ-MSC's efficiënter differentiëren dan andere bronnen, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege ontdekking (Early Discovery) tot leadidentificatie en preklinisch onderzoek, waarbij hypothese-testen, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie worden ondersteund door anatomisch opgeloste MSC-isolatie.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing en de verduidelijking van pathways ondersteunt door vergelijking van MSC-eigenschappen tussen de bekleding van de navelstreng, de gelei van Wharton, de overgang van navelstreng naar placenta en de foetale placenta mogelijk te maken.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay, de reproduceerbaarheid en kwantitatieve resultaten zoals de kolonievormende efficiëntie (59 voor CL, 80 voor WJ, vergelijkbaar met BM voor CPJ) en flowcytometrie-gebaseerde analyse van markerexpressie.
- Analytics: Benadrukt metingen zoals kolonievormende efficiëntie, fluorescentie-intensiteitsratio's en kwantitatieve RTPCR voor pluripotentiemarkers, die teams helpen om condities te vergelijken en de voorspellende waarde te beoordelen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door MSC-differentiatie naar adipogene, chondrogene en osteogene lineages aan te tonen, wat de afstemming van biomarkers en functionele validatie ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, waardoor standaardisatie over verschillende perinatale weefselbronnen mogelijk wordt voor een consistente MSC-voorziening in programma's voor regeneratieve geneeskunde.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, targetvalidatie en vermindering van mechanistische ambiguïteit door anatomisch opgeloste MSC-isolatie en functionele karakterisering.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via explantaatkweek, gedefinieerde digestieparameters en een consistente zaaidichtheid (1×10⁴ cells/cm²).
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium door vroegtijdig in de ontdekkingsfase MSC-bronnen met een hoge potentie, zoals CPJ, te identificeren.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en besluitvorming over verdere ontwikkeling op basis van differentiële proliferatie, zelfvernieuwing en differentiatie-efficiëntie tussen verschillende perinatale MSC-bronnen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in weefseldissectie, steriele celkweek en flowcytometrie voor markeranalyse.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur omvatten fasecontrastmicroscopie, centrifuges, incubatoren (37°C, 5% CO₂), en flowcytometers voor de beoordeling van CD-markers en fluorescentie-intensiteit.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams omvatten consistente protocollen voor weefseldissectie, trypsineneutralisatie en zaaidichtheden om reproduceerbaarheid tussen laboratoria te waarborgen.
- Overwegingen voor adaptatie tussen modelsystemen omvatten het aanpassen van de explantaatgrootte en digestietijd op basis van de weefselbron, aangezien de timing van de uitgroei varieert (3–4 dagen voor CPJ, 7–10 dagen voor CL/WJ, 11–14 dagen voor FP).
- Praktische beperkingen met betrekking tot het bronmateriaal omvatten de noodzaak om kruiscontaminatie tussen weefselbronnen tijdens de dissectie te vermijden en de variabiliteit in kolonievormende efficiëntie en uitgroeitiming tussen anatomische regio's.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Human Umbilical Cord (UC), Cord-Placenta Junction (CPJ), and Fetal Placenta (FP) Processing and Cell Isolation
6:21
Conclusion
4:29
Results: Colony-Forming Efficiency and Mesenchmyal Stromal Cell (MSC) Marker Expression of Perinatal Tissue-Isolated Cells
