Name: Hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van achterwortelganglia in Knaagdieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van dorsale wortelganglia in knaagdieren. Deze snelle methode minimaliseert weefselschade en ondersteunt neurobiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen David Kiel, Aarhus University, danken voor het filmen en bewerken. VirtualDub-software werd gebruikt voor het verwerken van microscoopvideosequenties. We danken het Deense Onderzoeksinstituut voor Translationele Neurowetenschappen - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, voor toegang tot apparatuur en de Aarhus University Research Foundation, EU 7FP-project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) en The Lundbeck Foundation voor financiering.

Alle dieren werden behandeld in volledige overeenstemming met de Deense en Europese regelgeving. Toestemming nummer: 2012-15-2934. 1. Voorbereiding van de spuit voor hydraulische extrusie van het ruggenmerg <ol><li> Voor een volwassen rat, gebruik dan een 10 ml spuit. Voor een volwassen muis gebruikt een 5 ml spuit. Voor pups, gebruik dan een 2,5 ml spuit. </li><li> Stel een niet-filter pipet universeel geschikt voor 2-200 pl pipetten door het trimmen van de grote einde van de pipetpunt totdat deze goed past bij de spuit. Plaats de aangepaste pipet tip over de spuit. Voor pups, gebruik maken van een 23 G of soortgelijke naald in plaats van een aangepaste pipet tip. </li><li> Zuig ijskoude steriele PBS en laat de spuit op het ijs tot verder gebruik. </li></ol> 2. Euthanasie <ol><li> Do breken van de nek niet uit te voeren, omdat dit de wervelkolom verstoren waardoor extrusie onmogelijk. </li><li> Voor volwassen rat / muis, euthanaseren behulp van gas, zoals CO 2 of isofluRane. Deze stoffen zijn schadelijk. Voer euthanasie in een zuurkast en omgaan met de stoffen volgens de richtlijnen instelling. (LET OP: CO 2: H280, P410, P403, isofluraan: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> Om ervoor te zorgen dat het knaagdier is dood, zorgen voor afwezigheid van reflex door knijpen een poot met een pincet. Onthoofden het knaagdier met behulp van grote schaar. Voor pups, euthanaseren door onthoofding. </li></ol></li></ol> 3. Isolatie van de wervelkolom <ol><li> Bestrooi water op de vacht om het haar te controleren. </li><li> Met behulp van een schaar, opengesneden de vacht langs de wervelkolom in een distale richting en isoleer de wervelkolom door te snijden aan beide zijden langs de wervelkolom langs het heupbeen. Snijd het ruggenmerg distaal aan het bekken met een schaar. OPMERKING: De rostrale-caudale as wordt aangeduid als de proximale-distale as gehele protocol. <ol><li> Trim de wervelkolom met een schaar om de proximal- voorkomenmeeste en meest distale gebieden omdat deze de wervelkolom te S-vormige succesvolle ruggenmerg extrusie maken. Controleer of de ruggenmerg zichtbaar is aan beide uiteinden. Als het ruggenmerg niet zichtbaar is, trim de wervelkolom met een schaar tot het ruggenmerg zichtbaar wordt. </li></ol></li></ol> 4. Hydraulische extrusie van het Spinal Cord <ol><li> Plaats een petrischaaltje (100 mm diameter) gevuld met steriele PBS op ijs. </li><li> Strek de wervelkolom door toepassing van een wijsvinger op het gebogen gedeelte (meest proximale uiteinde) van de wervelkolom, waardoor de wervelkolom zoveel mogelijk rechttrekken. <ol><li> Voor pups, vermijd buigen van de wervelkolom, de wervels wordt verstoord waardoor ruggenmerg extrusie onmogelijk. </li></ol></li><li> Plaats de pipetpunt (23 G naald voor pups, als alternatief 18 G naald voor volwassen muizen) aan het meest distale einde van de wervelkolom. Indien correct geplaatst, wordt de tip gestabiliseerd in de spinale holte. </li><li> Controleer of de wervelkolom zoveel mogelijk wordt rechtgetrokken. Solliciteer constante druk, en extrusie van de ruggenmerg in de petrischaal op ijs. Controleer of het ruggenmerg op ijs vochtig gehouden door hem in PBS totdat verdere behandeling. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Figuur 1: Vertegenwoordiger ruggenmerg. Hydraulisch geëxtrudeerd ruggenmerg. Van links naar rechts: volwassen rat, volwassen muis, muis pup. Lumbale vergrotingen gekenmerkt door doos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 5. Identificatie van ganglia (DRG) <ol><li> Splitsing van de wervelkolom in twee gelijke langsdelen met een schaar en plaats de gespleten wervelkolom onder de microscoop. </li><li> Identificeer de T13 wervel segment door<html> lokaliseren van de bevestigingsplaats van de meest distale costae de wervelkolom aandacht niet aan de costae de buurt intercostale zenuwen verwarren. De meest distale costae zijn bevestigd aan het proximale gedeelte van de wervel segment T13 en T13 de DRG zich distaal wervel T13 en proximaal aan wervel L1. </li><li> Identificeer gelijktijdige DRG in de distale richting. Voor een volwassen rat, gelijktijdige DRG verschijnen wit met duidelijk zichtbare dorsale en ventrale wortels. Voor een volwassen muis, gelijktijdig DRG verschijnen wit met duidelijk zichtbare dorsale en ventrale wortels. Voor pups, gelijktijdige DRG&#39;s verschijnen als heldere bollen. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Figuur 2: Identificatie van DRG in wervelkolom na extrusie van het ruggenmerg. De wervelkolom is gesplitst waardoor visualisatie van DRG zoals met pijlen. Geïllustreerd door volwassen rat en muis pup.<html> ref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. 6. Isolatie van DRG <ol><li> Aantal Petrischalen (30 mm in diameter) volgens de specifieke DRG&#39;s te isoleren, bijvoorbeeld L3, L4, L5. Vul het Petri gerechten met ijskoude steriele PBS en leg ze op ijs. </li><li> Met behulp van micro schaar, knippen dorsale en ventrale wortels dicht bij de DRG mogelijk worden gelost terwijl het vermijden van beschadiging van de DRG. </li><li> Met het puntje van gesloten pincet voorzichtig schep DRG en overbrengen naar de overeenkomstige genummerde petrischaaltjes. </li></ol><img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Figuur 3: Representatieve geïsoleerd DRG. Van links naar rechts: volwassen rat, volwassen muis, muis pup.&quot;_blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. 7. Verwerking van weefsels voor verdere analyse <ol><li> Western blotting <ol><li> Isoleer het weefsel gebied van belang, zoals het ruggenmerg lumbale uitbreiding. Indien nodig, scheiden het ruggenmerg in ipsilaterale en contralaterale zijden en verder in dorsale en ventrale horens. </li><li> Plaats het weefsel in lysisbuffer zoals TNE lysisbuffer (10 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 in tweemaal gedestilleerd H 2 O) die geschikte enzymremmers op ijs. </li><li> Homogeniseer het weefsel gedurende ongeveer 30 s op ijs met behulp van een mechanisch malen stamper. </li><li> Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 16.000 xg bij 4 ° C en het supernatant gebruikt voor verdere verwerking volgens standaardprotocollen 5, 6 of laat de supernatant bij -20 ° C tot verder gebruik. </li></ol></li><li> RNA-analyse <ol><li> Isoleer het weefsel van belang. </li><li> Onmiddellijk in zijn weefsel in RNA stabilisatie oplossing van het RNA voor opslag stabiliseren. </li><li> Isoleer RNA volgens standaardprotocollen 7. </li><li> Converteren RNA in cDNA en qPCR uitgevoerd volgens standaardprotocollen 7. </li></ol></li><li> immunohistochemie <ol><li> Voor vers ingevroren weefsel (van toepassing op ruggenmerg): <ol><li> Bereid droog ijs poeder door het verpulveren van droge ijsblokjes tot een bedrag dat overeenkomt met twee eetlepels poeder. Bedek droog ijsblokjes in een doek en verpulveren de kubussen met een hamer. Plaats zilverfolie (ongeveer 5 cm x 5 cm) op een laag droog ijsblokjes en hebben betrekking op de zilverfolie met droog ijs poeder. </li><li> Plaats het ruggenmerg gebied geselecteerd voor verdere analyse op de droge poeder ijs met een pincet, laat het snap-vries, en de overdracht van het ruggenmerg naar een cryo buis. Houd het op droog ijs te allen tijde of op te slaan bij -80 ° C tot verder geleide. </li><li> Transfer het ruggenmerg naar een cryostaat (-20 ° C). Indien nodig, trim het ruggenmerg in de cryostaat. Plaats het ruggenmerg inbedden materiaal binnen de cryostaat om het hechten aan de objectplaatje. </li><li> Snijd het ruggenmerg in de gewenste dikte, bijvoorbeeld 5 micrometer, en laat op glasplaten. Verwarm de glasplaten met een vinger onmiddellijk vóór weefselverzameling beter verankeren. Houd overgebleven weefsel in cryo buizen bij -80 ° C tot verder gebruik. </li><li> Laat de secties op glasplaten in de cryostaat tot klaar voor post-fixing. </li><li> Post-fix secties door onderdompeling in 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeren kleuring volgens standaardprotocollen 8. </li></ol></li><li> Vaste weefsel voor cryo snijden (van toepassing op ruggenmerg en DRG) <ol><li> Fix ruggenmerg en DRG&#39;s in 4% PFA (2 uur voor het ruggenmerg, 1,5 uur voor de muis DRG en 4 uur voor rat DRG) bij4 ° C (plaats ruggenmerg horizontaal geplaatst om te voorkomen dat bevestiging in een gebogen positie). </li><li> Breng het weefsel tot 25% w / v sucrose overnacht bij 4 ° C. Het weefsel kan worden opgeslagen in 25% w / v sucrose aangevuld met enkele druppels 10% natriumazide microbiële contaminatie bij 4 ° C tot verder gebruik te voorkomen. Indien nodig, trim het ruggenmerg te maken van de lumbale uitbreiding alleen op een silicone boord of iets dergelijks. </li><li> Gebruik de punt van een papieren handdoek zuigen overmaat sucrose oplossing van het weefsel. </li><li> Vul een cryo mal helft met het inbedden van materiaal. Duw eventuele luchtbellen aan de zijkanten van de cryo mal met hulpmiddelen zoals gesloten pincet. </li><li> Plaats het weefsel op de inbedding materiaal met behulp van een pincet en zorgen voor de gewenste weefsel oriëntatie. </li><li> Vul het cryo mal volledig met het inbedden van materiaal en duw eventuele luchtbellen zo ver mogelijk van het weefsel mogelijk (bijvoorbeeld door het gebruik van gesloten pincet). </li><li> Vul een petrischaal (100 mmin diameter) met 2-methylbutaan. Deze stof is schadelijk. Voer deze stap in een zuurkast en omgaan met de stof volgens instelling richtlijnen (LET OP: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Plaats de petrischaal op een laag van droog ijs en voeg twee droge ijsblokjes de petrischaal. Plaats de cryo schimmel in de petrischaal en laat de inbedding materiaal om volledig te bevriezen. </li><li> Houd de ingebed weefsel op droog ijs te allen tijde en bij -80 ° C omwikkeld met Parafilm tot verdere verwerking. </li><li> Snijd het weefsel op een cryostaat (-20 ° C) in de gewenste dikte, bijvoorbeeld 5 micrometer. </li><li> Voeren kleuring volgens standaardprotocollen 8. </li></ol></li><li> Vaste weefsel voor paraffine-inbedding (van toepassing op ruggenmerg en DRG) <ol><li> Fix ruggenmerg en DRG&#39;s in 4% PFA (2 uur voor het ruggenmerg 1,5 uur voor muizen en DRG&#39;s 4 h voor rat DRG) bij 4 ° C (place ruggenmerghorizontaal geplaatst om te voorkomen dat bevestiging in een gebogen positie). </li><li> Breng het weefsel tot 25% w / v sucrose overnacht bij 4 ° C. Het weefsel kan worden opgeslagen in 25% w / v sucrose aangevuld met enkele druppels 10% natriumazide microbiële contaminatie bij 4 ° C tot verder gebruik te voorkomen. </li><li> Isoleer het weefsel gebied van belang, zoals het ruggenmerg lumbale uitbreiding. </li><li> Vul een inbedding mal helft met paraffine. </li><li> Afkoelen de inbedding mal kort door het op de koeling gebied van de inbedding machine om de paraffine licht verharden. Dit zorgt voor een betere positionering weefsel. </li><li> Plaats het weefsel in de gewenste oriëntatie in de inbedding mal. Vul het inbedding mal met paraffine en onmiddellijk te koelen. </li><li> Plaats de paraffine bevattende inbedding vorm bij 4 ° C gedurende de nacht volledig laten uitharden en verwijder het paraffineblok met het weefsel van de matrijs insluiten. </li><li> Cut secties ona microtoom in de gewenste dikte, bijvoorbeeld 5 micrometer. </li><li> Voeren kleuring volgens standaardprotocollen 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li>
<li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li>
<li>JoVE Science Education Database. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot ">http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot </a> (2016).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2583035/">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li>
<li>Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014).</li>
<li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWatson%2C+C+%22The+Mouse+Nervous+System%22">The Mouse Nervous System</a>. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).</li>
<li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy%3A+implications+for+studies+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li>
<li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20084054">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li>
<li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wanneer de wervelkolom wordt verstoord, bijvoorbeeld door cervicale dislocatie, de ruggenmerg splitsen tijdens extrusie. Als het ruggenmerg kan worden geëxtrudeerd, kan de wervelkolom iets afgesneden buiten en binnen de extrusie poging kan worden herhaald. Indien het gehele ruggemerg noodzakelijk voor verdere analyse, namelijk bestaande uit de cervicale uitbreiding en de lumbale vergroting, de wervelkolom moet alleen worden bijgesneden. Als alleen de lumbale vergroting noodzakelijk voor verdere analyse, moet het ruggenmerg worden getrimd volgens de onderhavige protocol. De wervelkolom moet worden rechtgetrokken met behulp van de vingertoppen aan de extrusie te verlichten. Het protocol geldt voor knaagdieren van alle leeftijden en wordt hier geïllustreerd door een volwassene muizen (8 weken), een muis pup (5 dagen) en volwassen ratten (10 weken). Afhankelijk van het type dier en de stam, kan het aantal thoracale en lumbale secties variëren 9, </sup&gt; 10, 11. Afhankelijk van de eiwitten te analyseren, volwassen knaagdieren worden geperfuseerd met enzym remmende oplossingen voorafgaand aan euthanasie. Als het uitvoeren van een experiment met eenzijdige zenuwletsel, kan het ruggenmerg worden gesplitst in ipsilaterale en contralaterale zijden met behulp van ultra-fijne pincet direct na de extrusie. Verder kan elke zijde worden gesplitst in dorsale en ventrale zijden. Het weefsel kan vervolgens worden verwerkt voor verdere analyses, zoals Western blotting. Transcardial perfusie-fixatie met PFA vóór ruggenmerg extrusie moet worden vermeden, aangezien dit maakt het ruggenmerg niet flexibel en voorkomt ruggenmerg hydraulische extrusie. Hydraulische ruggenmerg extrusie zal afscheuren de dorsale wortels. Voor experimenten waarbij bevestigd dorsale wortels nodig zijn, wordt laminectomie aanbevolen. Bovendien worden spinale hersenvliezen verloren hydraulische extrusie, die kan worden vermeden door standaard laminectomie Hydraulische extrusie van het ruggenmerg en DRG isolatie kan ook worden uitgevoerd met geoxygeneerd kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) plaats ijskoude PBS. Het gebruik van ACSF maakt behoud van het geïsoleerde weefsel in een betere fysiologische omgeving, hetgeen vooral van belang bij latere elektrofysiologische opnames 12, 13. Een alternatief kan zijn ACSF PBS dat 1 g / l glucose voor het genereren van primaire DRG culturen 14. Hydraulische extrusie van het ruggenmerg is een beduidend snellere methode dan de traditionele manier ruggenmerg isolatie door laminectomie, waardoor weefsel doorlooptijd en dus minder kans op schade aan eiwitten. Perfusie met een hechtmiddel voorafgaand aan het isoleren van het ruggenmerg door laminectomie kan het risico van weefselbeschadiging tijdens dissectie en tijdens de laatste verwijdering van het verminderenruggenmerg van de wervelkolom. Echter, weefsel fixatie de weg staat aan de toepasselijkheid ervan op analyses, zoals Western blotting. Hydraulische extrusie opbrengsten structureel beschadigd weefsel 3 geschikt voor een breder scala van analyses. Consistente identificatie van DRG&#39;s kan moeilijk zijn. Dit is echter essentieel voor weefselanalyse, bijvoorbeeld na heupzenuw letsel. Nummering van de DRG volgens hun lokalisatie ten opzichte van de costae, kan DRG consistent geïdentificeerd. Kleuring van ruggenmergweefsel en DRG kunnen worden geoptimaliseerd door middel van de geïllustreerde weefselbehandeling variaties in Protocol stap 7.

Het algemene doel van deze methode is het ruggenmerg isoleren alsook DRG 1 identificeren en te isoleren, 2. Hydraulische extrusie van het ruggenmerg is een beduidend snellere methode dan de traditionele manier ruggenmerg isolatie door laminectomie, dwz door het breken van de wervelkolom een voor een, en dit reduceert de kans op weefselbeschadiging veroorzaakt door de dissectie proces 3, 4 . DRG kan moeilijk te identificeren zijn. Correcte identificatie is van groot belang voor tissue-analyse, bijvoorbeeld na heupzenuw letsel. Nummering van de DRG volgens hun lokalisatie ten opzichte van de costae, kan DRG consistent geïdentificeerd. Weefsel geïsoleerd door technieken die hier getoond kunnen worden toegepast op een groot aantal analyses zoals Western blotting 5,6, 7 en qPCR immunohistochemische kleuring 8. Bij de identificatie DRG, is het belangrijk om rekening te houden dat bekend het aantal ruggemerg segmenten te variëren met diersoort en stam 9, 10, 11. De voordelen bij het uitvoeren van deze werkwijze in muizen het grote aantal genetisch gemodificeerde varianten beschikbaar en de relatief lage kosten behuizing. De voordelen in het gebruik van ratten zijn de relatief hoge opbrengst en weefsel als betrekken zenuw verwondingen, zal de procedure worden verlicht met de grootte.

<table><tbody><tr><td>Bonn schaar, extra fijn, recht, 8,5 cm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 14084-08</td><td>Voor het open snijden van het ruggenmerg voorafgaand aan het isoleren van DRG's (volwassen muis, volwassen rat); Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td># 5427 R</td><td>Voor centrifugatie van gehomogeniseerd weefsel</td></tr><tr><td>Cryostat microtoom</td><td>Leica Biosystems</td><td># CM 3050 S</td><td>Voor het snijden van het ingebedde weefsel voorafgaand aan het kleuren; Andere model en fabrikant kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Pincet, Dumont, # 3</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11231-30</td><td>Voor het hanteren van het ruggenmerg na extrusie; Andere fabrikant/type kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Pincet, Dumont, # 5</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11252-20</td><td>Voor isolatie van DRG's (volwassen muis, volwassen rat, pup); Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Isofluraan (furaan) IsoFlo Vet 100%</td><td>Abbott</td><td># 002185</td><td>Voor euthanisatie; Andere fabrikant kan worden gebruikt; VOORZICHTIG: giftig</td></tr><tr><td>Iso-pentaan GPR rectapur</td><td>VWR chemicals</td><td># 24872.298</td><td>Voor snap-freezing van weefsel; Andere fabrikant kan worden gebruikt; VOORZICHTIG: giftig</td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Leica Biosystems</td><td># RM 2155</td><td>Voor het snijden van paraffine-ingebed weefsel; Andere model en fabrikant kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Paraffinewas pellets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 76243</td><td>Voor paraffine-inbedding; Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Paraffine weefsel inbedding station</td><td>Leica Biosystems</td><td># EG1160</td><td>Voor paraffine-inbedding van weefsel voor later snijden; Andere model en fabrikant kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Pellet pestel, motor snoerloos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># Z359971-1EA</td><td>Voor mechanische homogenisatie van geïsoleerd weefsel voorafgaand aan Western blotting; Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Petrischaal, 35 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td># 121V</td><td>Voor opslag van geïsoleerde DRG's; Andere fabrikant en maat kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Petrischaal, 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># P7741</td><td>Voor extrusie van het ruggenmerg; Andere fabrikant en maat kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Fosfatase remmer, Phosstop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 04906845001</td><td>Fosfatase remmer cocktail voor toevoeging aan TNE-lysis buffer indien nodig; Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Pipettipunt, 1-200 &mu;L, geen filter</td><td>Sarstedt</td><td># 70.1189.105</td><td>Voor hydraulische extrusie; Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Protease remmer, Complete</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 05892791001</td><td>Protease remmer cocktail voor toevoeging aan TNE-lysis buffer indien nodig; Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>RNAlater oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># R0901</td><td>Voor RNA stabilisatie voor opslag; Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Rneasy Protect Mini KiT</td><td>Qiagen</td><td># 74124</td><td>Voor RNA isolatie; Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Schaar; Swann-Morton chirurgisch mes nr. 11</td><td>Swann-Morton</td><td># REF0203</td><td>Voor isolatie van de lumbale wervelkolom; Andere fabrikant/type kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Schaar, recht, type 3, 25 mm snijkant</td><td>Bochem</td><td># 4070</td><td>Voor isolatie van de wervelkolom; Andere fabrikant/type kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Schaar, 130 mm snijkant</td><td>Hounisen</td><td># 1902.0130</td><td>Voor isolatie van het ruggenmerg (volwassen rat)</td></tr><tr><td>Verenschaar, recht, 8 mm snijkant</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 15009-08</td><td>Voor het open snijden van de wervelkolom voorafgaand aan het isoleren van DRG's (pup) en voor het isoleren van DRG's (volwassen muis, volwassen rat, pup); Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Standaard spuiten, 2,5 mL, 5 mL, 10 mL</td><td>Terumo</td><td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td><td>Voor hydraulische extrusie; Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop MZ12.5 met objectief 1X en oculaire 10X</td><td>Leica</td><td># 10446370</td><td>Andere fabrikant/type kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Steriele PBS</td><td>GIBCO</td><td># 10010-015</td><td>Voor hydraulische extrusie; Kan ook worden gemaakt volgens standaard protocollen</td></tr><tr><td>Spuitnaald 23 G x 1", 0,6 x 25 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-2325R</td><td>Voor hydraulische extrusie in pups; Andere fabrikant/type kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Spuitnaald 18 G x 1 1/2, 1,2 x 40 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-1838S</td><td>Alternatief voor pipettip voor hydraulische extrusie in volwassen muizen; Andere fabrikant kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td># 4583</td><td>Weefsel inbeddingsmateriaal voor later cryosectie</td></tr><tr><td>TNE-lysis buffer</td><td>VWR chemicals</td><td># 10128-582</td><td>Voor weefsel lysis voorafgaand aan Western blotting; Andere fabrikant kan worden gebruikt; Kan ook worden gemaakt volgens standaard protocollen</td></tr></tbody></table>

hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van achterwortelganglia in knaagdieren

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditioneel wordt het ruggenmerg geïsoleerd door middel van laminectomie, d.w.z. door de wervels van de wervelkolom een voor een open te breken. Dit is zowel tijdrovend als kan het resulteren in schade aan het ruggenmerg veroorzaakt door het dissectieproces. Hier laten we zien hoe het ruggenmerg kan worden uitgedrukt met behulp van hydraulische druk. De behandelingstijd wordt aanzienlijk verkort tot slechts enkele minuten, wat waarschijnlijk de schade aan eiwitten vermindert. Het lage risico op schade aan het ruggenmergweefsel verbetert de daaropvolgende immunohistochemische analyse. Door hydraulische extrusie van het ruggenmerg uit te voeren in plaats van traditionele laminectomie, kunnen de knaagdieren verder worden gebruikt voor DRG-isolatie, waardoor het aantal dieren wordt verminderd en analyse mogelijk is van weefsels van hetzelfde knaagdier. We demonstreren een consistente methode om de DRG's te identificeren en isoleren volgens hun lokalisatie ten opzichte van de ribben. Het is echter belangrijk om deze methode aan te passen aan het specifieke gebruikte dier, aangezien het aantal segmenten van het ruggenmerg, zowel thoracaal als lumbaal, kan variëren afhankelijk van het diersoort en de stam. Daarnaast illustreren we verdere verwerkingsvoorbeelden van de geïsoleerde weefsels.

Hydraulisch geëxtrudeerd ruggenmerg vertonen een glad oppervlak onbeschadigd figuur 1. De uitbreiding lumbale kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd als het verdikte gebied van het ruggenmerg, ingesloten figuur 1. De dorsale en ventrale zijden van het ruggenmerg kan worden geïdentificeerd op het oog volgens de morfologie. In figuur 1 wordt de ventrale zijde naar de kijker, herkenbaar door een duidelijke scheiding langs de gehele ruggemerg. Twee bredere lijnen langs de ruggengraat nauwkeurig worden bepaald rugzijde. Op het meest distale uiteinde, kan de cauda equina soms verbonden blijven bij volwassen ratten en volwassen muizen. Individuele DRG kunnen alleen worden geïdentificeerd die zich bevinden in de ruggengraat, figuur 2. Na afsluiting figuur 3, kunnen de individuele DRG niet worden aangetoond uiterlijk. Indien nodig, is dusbelangrijk om ze duidelijk gescheiden op isolement. Na isolatie kan het ruggenmerg en DRG&#39;s verwerkt en gekleurd zoals beschreven in stap 7.3 en weergegeven in figuur 4. Figuur 4a toont een immunohistochemische kleuring van DRG waar de neuronen en hun omgeving satelliet gliacellen zijn duidelijk zichtbaar. Door correcte identificatie van de DRG is het mogelijk om het effect van heupzenuw letsel analyseren op soma van de verwonde neuronen en hun omgeving satelliet gliacellen. Figuur 4b een Nissl-kleuring van een hydraulisch geëxtrudeerd ruggenmerg waarbij het weefsel intact gereflecteerd door de gladde randen van het profiel. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Figuur 4: representatieve weefselsecties. A. Immunohistochemische kleuring van DRG sectie. B. Nissl gebrandschilderd section hydraulisch geëxtrudeerd ruggenmerg. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier presenteren we een protocol voor hydraulische extrusie van het ruggenmerg evenals identificatie en isolatie van specifieke dorsale wortelganglia (DRG's) in hetzelfde knaagdier. In vergelijking met standaard methoden voor ruggenmergisolatie is deze methode aanzienlijk sneller en vermindert het risico op weefselschade.

Hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van achterwortelganglia in Knaagdieren

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Het algemene doel van deze methode is om het ruggenmerg te isoleren via hydraulische extrusie, evenals om dorsale wortelganglia bij muizen en ratten te identificeren en te isoleren. Dit wordt bereikt door het knaagdier eerst te euthanaseren, gevolgd door decapitatie. De huid wordt langs de wervelkolom ingesneden en gescheiden van het onderliggende weefsel.Vervolgens wordt de wervelkolom gescheiden van het omliggende weefsel door langs beide zijden van de wervelkolom in distale richting voorbij het bekkenbeen te snijden. Daarna wordt de wervelkolom distaal van het bekkenbeen doorgesneden. Een spuit met een aangepaste pipetpunt wordt ingebracht aan het meest distale uiteinde van het ruggenmerg.Door een constante druk uit te oefenen, wordt het ruggenmerg met ijskoud steriel PBS in de op ijs geplaatste Petrischaal geperst. Met een veerschaar wordt de wervelkolom in de lengterichting gesplitst. Vervolgens worden de aanhechtingsplaatsen van de meest distale costa gelokaliseerd.Hiermee kunnen de meest distale thoracale DRG's aan weerszijden, aangeduid als T13, worden geïdentificeerd. Vervolgens kunnen de daaropvolgende DRG's worden bepaald. De DRG's die overeenkomen met de lumbale verdikking van het ruggenmerg bevinden zich distaler.Met veerscharen worden de dorsale en ventrale wortels doorgesneden, waarna de DRG's voorzichtig uit de holte worden geschept en overgebracht naar gelabelde petrischalen met steriele PBS op ijs. Hydraulische extrusie van het ruggenmerg is een aanzienlijk snellere methode dan de traditionele laminectomie, waarbij de wervels één voor één worden gebroken. Deze methode vermindert het risico op weefselschade veroorzaakt door het dissectieproces en levert weefsel op dat geschikt is voor een breed scala aan analyses.Dorsale wortelganglia kunnen over het algemeen moeilijk te identificeren zijn. Een correcte identificatie is echter zeer belangrijk voor verdere analyse van het weefsel, bijvoorbeeld na een beschadiging van de nervus ischiadicus. Door de dorsale wortelganglia te nummeren op basis van de lokalisatie ten opzichte van de costa, kunnen dorsale wortelganglia consistent worden geïdentificeerd.Bereid een spuit voor de extrusie van het ruggenmerg door het brede uiteinde van een ongefilterde pipetpunt af te knippen. De punt zal nauw aansluiten wanneer deze correct is aangepast. Aspireer ijskoud steriel PBS en bewaar de spuit op ijs tot aan gebruik.Euthanaseer volwassen knaagdieren met gas zoals CO2 of isofluraan, gevolgd door decapitatie. Voer geen cervicale dislocatie uit, aangezien dit de wervels van de ruggengraat beschadigt en extractie van het ruggenmerg onmogelijk maakt. Welpjes kunnen worden geëuthanaseerd door directe decapitatie.Sproei water op de vacht om de haren te beheersen. Snijd vervolgens de vacht in distale richting open langs de wervelkolom. Isoleer de wervelkolom door aan beide zijden langs de wervelkolom tot voorbij het bekkenbeen te snijden en snijd de wervelkolom proximaal ten opzichte van het bekken door.Trim de wervelkolom om de meest proximale en meest distale gebieden te vermijden, aangezien deze de wervelkolom te S-vormig kunnen maken voor een succesvolle extractie van het ruggenmerg. Zorg ervoor dat het ruggenmerg aan beide uiteinden zichtbaar is. Als het ruggenmerg niet zichtbaar is, trim de wervelkolom dan totdat het ruggenmerg zichtbaar wordt.Plaats een Petrischaal met PBS op ijs. Strek de wervelkolom door de wijsvinger op het gebogen gedeelte aan het proximale uiteinde van de wervelkolom te plaatsen. Voer de pipetpunt in het distale uiteinde van het ruggenmerg.Oefen een gelijkmatige druk uit en pers het ruggenmerg in de Petrischaal. Snijd de wervelkolom open. Snijd een paar wervels aan de ventrale zijde van de kolom door en snijd vervolgens een paar wervels aan de dorsale zijde door.Zet dit proces voort door afwisselend aan beide zijden langs de gehele wervelkolom te werken. Plaats het geopende ruggenmerg onder een microscoop. Identificeer het T13-wervelsegment door de aanhechtingsplaats van de meest distale costa in de wervelkolom te lokaliseren.Pas op dat u de meest distale costa niet verwart met de nabijgelegen intercostale zenuwen. De meest distale costa zijn verbonden met het proximale deel van het T13-wervelsegment en de T13 DRG's bevinden zich distaal ten opzichte van wervel T13 en proximaal ten opzichte van wervel L1. Identificeer de bijbehorende DRG's in distale richting. Bereid genummerde Petrischalen voor met ijskoud steriel PBS op ijs.Om beschadiging van het DRG tijdens het verwijderen te voorkomen, pakt u de dorsale en ventrale wortels vast met een pincet in plaats van het DRG zelf. Gebruik een microschaar om eerst de perifere zenuw door te knippen, gevolgd door de dorsale en ventrale wortels. Bij pups zijn deze zenuwen minder duidelijk zichtbaar dan bij volwassen knaagdieren.Om de zenuwen zo dicht mogelijk bij de DRG door te snijden, laat u de punt van de schaar voorzichtig langs de DRG glijden om de punt te positioneren voordat u de snede maakt. Schep de DRG's voorzichtig uit met de punt van gesloten pincetten en breng ze over naar de overeenkomstige petrischaal. Bij volwassen ratten en volwassen muizen zijn de DRG's wit met duidelijk zichtbare dorsale en ventrale wortels, terwijl de DRG's bij pups verschijnen als heldere sferen.Voor western blotting wordt het gewenste weefsel geïsoleerd en in lysisbuffer geplaatst. Homogeniseer vervolgens het weefsel, centrifugeer dit, verzamel het supernatant en voer de western blotting uit volgens standaardprotocollen. Voor RNA-analyse wordt het gewenste weefsel geïsoleerd en onmiddellijk in een RNA-stabilisatieoplossing geplaatst.Voer vervolgens qPCR uit volgens standaardprotocollen. Bereid voor immunohistochemie op snelbevroren weefsel droogijs-poeder voor op een stuk zilverfolie. Plaats het weefsel op het droogijs-poeder om het snel te laten bevriezen.Breng het weefsel vervolgens over naar een cryostaat en bed het weefsel in voor het snijden. Fixeer het weefsel na afloop in 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en voer immunohistochemische kleuring uit volgens standaardprotocollen. Voor immunohistochemie op cryosecties wordt het weefsel gefixeerd in 4% PFA bij vier graden, waarna het weefsel gedurende de nacht bij vier graden wordt overgebracht naar 25% gewicht-per-volume sucrose.Plaats het weefsel in inbeddingsmateriaal en vries het weefsel in met gekoeld 2-methylbutaan. Snijd het weefsel in een cryostaat en voer immunohistochemische kleuring uit volgens standaardprotocollen. Voor immunohistochemie op paraffine coupes wordt het weefsel gefixeerd in 4% PFA bij vier graden en vervolgens gedurende de nacht bij vier graden overgebracht naar 25% w/v sucrose.Stel het weefsel in paraffinem, snijd het weefsel met een microtoom en voer immunohistochemische kleuringen uit volgens standaardprotocollen. Afhankelijk van de gebruikte antilichamen voor de immunohistochemische kleuring kan een van de geïllustreerde weefselbehandelingsmethoden van toepassing zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u het ruggenmerg kunt isoleren via hydraulische extrusie en hoe u de dorsale wortelganglia op een consistente manier kunt identificeren en isoleren.De hier getoonde methoden zijn toepasbaar op muizen en ratten van alle leeftijden, en het geïsoleerde weefsel kan worden gebruikt voor een breed scala aan analyses, waaronder methoden die een snelle isolatie van niet-gefixeerd weefsel vereisen.

hydraulic-extrusion-spinal-cord-isolation-dorsal-root-ganglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

In this video, we demonstrate the extraction of dorsal root ganglion or DRG from a harvested rat spine for downstream applications.

Harvesting DRG from Rat Spine: A Procedure to Extract Dorsal Root Ganglion from the Spine of a Rat Model

In this video, we describe a step-by-step protocol to isolate spinal cord from a mouse model for in vitro studies.

Spinal Cord Extraction: A Protocol to Isolate Murine Spinal Cord for In Vitro Studies

This video demonstrates a procedure for isolating dorsal root ganglion (DRG) neurons from rat embryos and co-culturing them with Schwann cell precursors to generate mature Schwann cells. The isolated DRGs are processed to isolate neurons and glial cells. The isolated cells are cultured to purify the neurons, which are then co-cultured with Schwann cell-like cells (SCLCs) in a co-culture medium. Interaction with the DRG neurons leads to the maturation of SCLCs into Schwann cells.

Isolation of DRG Neurons and Coculture with Schwann Cell Precursors to Generate Schwann Cells

This video presents a method for isolating neural stem/progenitor cells from the periventricular tissue of the spinal cord in adult rats. The technique includes incubating the tissue fragments in a solution containing proteolytic enzymes to disrupt the extracellular matrix and release the cells. Subsequently, the released cells are plated in a medium containing specific growth factors that enhance neural stem/progenitor proliferation and promote aggregation into three-dimensional neurospheres.

Isolation of Neural Stem Progenitor Cells from the Spinal Cord Periventricular Region of an Adult Rat

This video demonstrates a technique for isolating and culturing dorsal root ganglia (DRG) cells from the rat spinal column. DRGs excised from the spinal column are treated with enzymes and mechanically dissociated to obtain a single-cell suspension. The cells are cultured in a medium containing inhibitors and growth factors that limit glial cell proliferation and promote neuronal growth, respectively.

Establishing a Primary Dorsal Root Ganglia Cell Culture from a Rat Spinal Column

Het volwassen zoogdierspinaalmerg bevat neurale stam-/voorlopercellen (NSPC's) die kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in cultuur. Dit protocol beschrijft het oogsten, isoleren, kweken en passeren van NSPC's die zijn gegenereerd uit de periventriculaire regio van het volwassen ruggenmerg van de rat en van menselijke orgaantransplantatiedonoren.

Isolatie van neurale stamcellen / stamcellen uit de periventriculaire regio van de volwassen rat en Human Spinal Cord

Dit protocol beschrijft de isolatie van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen geïsoleerd uit ratten en de kweek van DRG neuronen op een statisch voorgerekt celkweeksysteem om de uitlijning van axonen te verbeteren, met daaropvolgende co-cultuur van Schwann-cellen (SC's) om myelinisatie te bevorderen.

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Dit protocol presenteert het gebruik van een dorsale wortelganglion (DRG) injectie met een virale vector en een gelijktijdige dorsale wortelbeschadiging bij een volwassen rat als een model om sensorische axonregeneratie te bestuderen. Dit model is geschikt voor het onderzoeken van het gebruik van gentherapie om sensorische axonregeneratie te bevorderen.

Ganglion Injection en dorsale Root crush als een model voor Sensory Axon Regeneration

Dit protocol biedt een techniek om geëxplanteerd dorsaal wortelganglion (DRG) van volwassen Sprague Dawley-ratten te oogsten en te kweken in een apparaat met meerdere compartimenten (MC).

Het oogsten, inbedden en cultiveren van dorsale wortelganglia in apparaten met meerdere compartimenten om perifere neuronale kenmerken te bestuderen

Dorsale wortelganglia (DRG) bevatten primaire sensorische neuroncellen en geven perifere sensorische signalen door aan het ruggenmerg. Dit protocol beschrijft een methode voor de dissectie van de DRG bij muizen die gestandaardiseerde isolatie van structureel intacte ganglia, anatomische segmentale identificatie, intuïtieve begeleiding voor beginnende gebruikers en verminderde procedurele weefselbeschadiging ondersteunt.

Dissectie en isolatie van de dorsale wortelganglia van de muis

Leer hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van dorsale wortelganglia in knaagdieren. Deze snelle methode minimaliseert weefselschade en ondersteunt neurobiologisch onderzoek.

Hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van achterwortelganglia in Knaagdieren

Meer video's verkennen