Meten van de motorische eindplaat functionaliteit

Het algemene doel van deze procedure is om de functionaliteit van de neuromusculaire overgang te bestuderen middels een ex vivo experimentele benadering. Dit wordt bereikt door de spier-zenuwprioriteit op twee manieren te stimuleren: direct op het spiermembraan en via de zenuw. Aangezien membraanstimulatie de neurotransmissiesignalering omzeilt, kunnen eventuele verschillen tussen de twee contractiereacties worden beschouwd als een indirecte meting van de functionaliteit van de neuromusculaire overgang.

Hier presenteren we deze procedure in een soleus-nervus ischiadicus-preparaat. De spier wordt samen met de zenuw gedissekeerd en in een geperfuseerd weefselbad geplaatst. Deze wordt bevestigd aan een kracht- en lengtecontroller en een paar platina elektroden worden parallel aan de spier geplaatst.

Een glazen zuigelektrode wordt vervolgens dicht bij het doorgesneden uiteinde van de zenuw bewogen. Er wordt daarna een uitgebreid testprotocol toegepast om zowel de neuromusculaire overgang als de spierfunctionaliteit grondig te evalueren. De functionele verbinding tussen spier en zenuw vormt de conclusie voor beide delen en de twee overlevende fracties.

In het eerste gebied van het niveau van elk van de twee weefsels communiceren deze neuromusculaire juncties, die normaal gesproken een drukachtige morfologie vertonen. Desalniettemin is in verschillende pathologische condities de functionele interactie tussen spier en zenuw ernstig aangetast en verliezen neuromusculaire juncties hun complexe morfologische organisatie. Het algemene doel van onze procedure is om de functionaliteit van de neuromusculaire junctie te bestuderen met behulp van een ex vivo experimentele benadering.

Dit wordt bereikt door de spier-zenuwpreparatie op twee manieren te stimuleren. De ene methode is door direct de spiercelmembraan te stimuleren en de andere door de zenuw te stimuleren en de spiereigenschappen te analyseren. Zet het circulerende waterbad aan en stel de temperatuur in op 30 °C.

Vul het bad met de Krebs-Ringer-oplossing. Laat 0,4 bar van het gasmengsel door de oxitube en in het bad stromen. Zet de actuator-transducer en de twee pulsstimulatoren aan.

Stel de stroomwaarden in op 300 miljoen paren voor de membraanstimulatie en op vijf miljoen paren voor de zenuwstimulatie. Verwijder na het offeren van de muis door middel van cervicale luxatie de huid van de poten. Snijd nu de achillespees door en trek, terwijl u de pees stevig vastklemt, de musculus gastrocnemius en de musculus soleus samen omhoog.

Zodra de proximale pees van de soleus is blootgelegd, wordt de gehele kuit erboven doorgesneden en wordt het monster snel in het preparatiebad voor weefsel geplaatst dat zich onder de stereomicroscoop bevindt. Klem de proximale pees van de soleus stevig vast met een pincet en trek deze voorzichtig weg om de nervus ischiadicus-innervatie bloot te leggen. Zodra de innervatie is blootgelegd, worden de omliggende weefsels verwijderd om ongeveer vijf millimeter van de zenuw zichtbaar te maken.

Gebruik vervolgens een fijne schaar om de zenuw voorzichtig door te knippen. Voltooi de excitie van de spier en zenuw door de achillespees door te snijden om de m. soleus van de m. gastrocnemius te scheiden. De spier-zenuwpreparaat is nu klaar om in het testapparaat te worden gemonteerd.

Maak een schuifknoop aan het uiteinde van de nylondraad en trek deze strak rond de achillespees. Klem het proximale deel van de pees vast in de vaste klem en bind de nylondraad rond de hefboomarm van de krachttransducer. Laat de spier equilibreren in de oplossing.

Om de initiële optimale lengte te bepalen, stimuleert u de spier met een reeks enkelvoudige pulsen terwijl u de kruipbelastingwaarde voorzichtig aanpast. De optimale lengte is bereikt wanneer de twitchkracht maximaal is. Plaats de zuigelektroden nabij de spier en trek de zenuw naar binnen.

Stimuleer vervolgens de spier met een reeks enkelvoudige pulsen, terwijl u de waarde van de pulsstroom voorzichtig aanpast. De twitchkracht die door de spier wordt gegenereerd bij stimulatie via de zenuw, moet gelijk zijn aan de waarden die zijn gemeten bij stimulatie op het membraan. Zodra de optimale stroomwaarde is bepaald, duwt u de zenuw uit de elektrode en dient u enkele stroompulsen toe.

Als de hoeveelheid van de eerder geselecteerde stroom te hoog is, veroorzaken de stroompulsen die via de zuigelektrode worden afgeleverd spiercontractie door stroom door het bad te geleiden. Met behulp van zelfontwikkelde software hebben we een geautomatiseerd testprotocol ontworpen voor de studie naar de functionaliteit van de neuromusculaire junctie van de soleusspier. Het protocol duurt ongeveer 65 minuten en bestaat uit vier verschillende delen.

In het eerste deel wordt de spier gestimuleerd met vier enkele pulsen. Twee hiervan worden direct toegediend en twee via de zenuw. De tijd tot de piek, de halve relaxatietijd, de maximale waarde van de krachtafgeleide en de twitchkracht worden vervolgens gemeten op basis van de twitchresponsen.

In het tweede deel wordt de spier gestimuleerd met een reeks pulstreinen variërend van 20 hertz tot 80 hertz, wat de tetanische frequentie is. Dit dient om de kracht-frequentiecurven te berekenen voor zowel zenuwstimulaties als directe stimulaties. In het derde en vierde deel van het protocol wordt de spier onderworpen aan twee vermoeidheidsparadigma's om neurotransmissiegebrek en intratetanische vermoeidheid te meten.

Tijdens deze vermoeidheidsparadigma's wordt de spier continu gestimuleerd met één pulstrein afgeleverd op het membraan, gevolgd door 14 pulstreinen afgeleverd via de zenuw. De gehele reeks wordt 20 keer herhaald. Het eerste paradigma wordt uitgevoerd bij een vuurfrequentie van 35 hertz.

De tweede bij de tetanische frequentie van 80 hertz. Men gelooft dat het falen van de neurotransmissie een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling van vermoeidheid, aangezien dit gerelateerd is aan de externe blokkade van de actiepotentiaalvoortplanting, verminderde transmitterafgifte en verminderde excitabiliteit van de postsynaptische plaat bij vermoeidheid van de neuromusculaire overgang. Een ander aspect van vermoeidheid van de neuromusculaire overgang komt duidelijk tot uiting in intratetanische vermoeidheid, wat een schatting is van het vermogen van de spier om kracht te behouden tijdens een enkele tetanische contractie en een weerspiegeling is van hoogfrequente vermoeidheid.

Aan het einde van het protocol worden de netto spierlengte en het gewicht gemeten met een analoge schuifmaat en een precisieweegschaal om de dwarsdoorsnede van de spier te berekenen. Studies naar het SOD1-transgene muismodel van amyotrofische laterale sclerose hebben het potentieel van deze methodologie benadrukt. In feite vertonen de transgene soleusspieren een verminderde contractiële respons voor zowel de krachtafgeleide als de tetanische kracht bij directe stimulatie, en een nog grotere afname bij stimulatie via de zenuw.

Wat betreft de tetanische kracht bijvoorbeeld, hebben deze experimenten aangetoond dat spiercontractiliteit verantwoordelijk is voor 25% van de schade, terwijl een verdere 45% gerelateerd is aan defecten in de neurotransmissie. Een ander interessant punt is de afwezigheid van enig verschil in controle-spieren bij directe of indirecte stimulatie. Deze bevinding bewijst dat de methodologie geen technische artefacten induceert, aangezien de neuromusculaire overgang in controledieren volledig functioneel wordt verwacht te zijn.

Wat betreft intratetanische vermoeidheid hebben de resultaten significant lagere waarden aangetoond in transgene soleusspieren dan in de overeenkomstige controlegroep. Interessant is dat de transgene soleusspier significant wordt beschadigd door repetitieve stimulatie, wat betekent dat de functionaliteit van de neuromusculaire overgang kan worden geëvalueerd voor een maximale stimulatietijd van acht minuten. Na acht minuten keert de transgene spier terug naar een krachtwaarde die bijna nul is bij stimulatie.

Na het bekijken van de video zou u begrijpen hoe de functionaliteit van de neuromusculaire overgang en de soleusspier van een muis gemeten kan worden. Aangezien deze techniek gebaseerd is op een indirecte meting van de functionaliteit van de neuromusculaire overgang, is het niet mogelijk om vast te stellen of de gerapporteerde defecten gerelateerd zijn aan morfologische of biochemische veranderingen. Aan de andere kant vormt deze aanpak een essentiële manier om te beoordelen of deze aantastingen de uiteindelijke functionaliteit van het neurotransmissiesignaal beïnvloeden.

Ten slotte kan het voorgestelde protocol eenvoudig worden aangepast om de functionaliteit van de neuromusculaire overgang van het diafragma te meten, een andere spier die vaak betrokken is bij pathologische aandoeningen.