Name: Kwantificering van Drosophila Grooming Gedrag (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer een schaalbare grooming-assay in Drosophila met kleurstofaccumulatie voor neurobiologie en gedragsgenetica. Deze methode levert snelle, robuuste kwantitatieve gegevens over verzorgingsgedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon en Rose Hedreen voor vroegtijdig werk in het testen en opzetten van deze methodologie en kamerontwerpen. We bedanken Kelly Tellez en Graham Buchan voor het lezen en bewerken van het manuscript. We danken Andrew Seeds en Julie Simpson voor hun pionierswerk en hun advies en ondersteuning bij het suggereren van het gebruik van Brilliant Yellow Dye (Sigma). Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de Mary E. Groff Chirurgische en Medische Research and Education Charitable Trust, het Bronfman Science Center en het Hellman Fellows Programma.

1. Bereiding <ol><li> Bereid een aspirator voor het verplaatsen van levende Drosophila van een kweek fles naar de verzorgingskamer. Aspiratoren laten overdracht van bewuste dieren toe aan de gedragskamers om ervoor te zorgen dat de narkose geen nadelige gedragswaarneming beïnvloedt. <ol><li> Gebruik een schaar, snijd 1,5 meter tygon tubing ID ⅛ &quot;, OD ¼&quot;. Schakel tenminste 1 inch van de punt van een 1 ml wegwerp micropipet tip. Houd een 1 cm vierkante maaswijdte (opening 0.196 inch) over de snijpunt. OPMERKING: De meeste 1mL tips hebben een gradatie lijn waar de tip zit in de verpakking, typisch gesneden aan die regel. </li><li> Plaats een frisse 1 ml micropipetpunt over de maas / snijpunt. Let op de maasvorm een ​​strakke barrière tussen de twee tips. De binnenkant van de nieuwe tip creëert een houderkamer voor vliegen. </li><li> Knip de extreem punt van de nieuwe micropipettip om de opening voldoende te verbreden om een ​​enkele vlieg te laten passeren. De holE komt ongeveer overeen met de opening van de verzorgingskamer (ongeveer 1,5-2 mm in diameter). </li><li> Zet de geneste tips goed aan het uiteinde van de Tygon-buis. Duw de tips in de buis om een ​​strakke pasvorm te waarborgen om druk op de vacuüm mogelijk te maken. </li><li> Aan het andere uiteinde van de buis snijdt u de punt van een 200 μL micropipetpunt en past het smalle snedeinde in de buis. Dit is de &quot;mond&quot; kant van de aspirator. </li></ol></li><li> Bereid stof aliquot buizen. Weeg ongeveer 5 mg Brilliant Yellow kleurstof op geterd weegpapier. Giet het stof in een 0,6 ml microcentrifuge-buis en sluit de kap strak dicht. OPMERKING: Wij adviseren het gebruik van nitrilhandschoenen tijdens de bereiding van de alikvoten, aangezien sommige latexhandschoenen doordringbaar zijn voor de kleurstof. </li><li> Herhaal stap 1.2) voor alle monsters in het experiment (één voor elke vlieg in elke kamer). </li><li> Bereid ethanol (EtOH) buizen: Pipet 1 ml 100% EtOH in 1,5 ml microcentrifuge buizen. Labelbuizen voor genotypes of condities. &lt;/ Li&gt; <li> Herhaal stap 1.4) voor alle monsters in het experiment (één voor elke vlieg in elke kamer). Cap en sla de EtOH-buizen op voor het voltooien van de verzorgingstest. Bevat ook tenminste één &quot;Leeg&quot; monster dat alleen 1 ml EtOH zal zijn zonder een vlieg voor negatieve controles. </li><li> Monteer elke verzorgingskamer door de glijdende bovenplaat (met de kleinere gaten) te schroeven, maar laat de bodemplaat (met de grotere gaten) verwijderd worden om stof toe te voegen. </li><li> Plaats elke benodigde verzorgingskamer plat op een tafel met de bovenkant naar beneden. De vlieginvoerzijde is naar beneden gericht. </li><li> Laad 5 mg Brilliant Yellow color-aliquot in elke kamer door de buis tegen het oppervlak van de kamer boven de gewenste put te tikken. Tik de kamer tegen de tafel om ervoor te zorgen dat alle stof door het gaas naar de bovenplaat vallen. </li><li> Schroef de bodemplaat op elke kamer zodanig, dat de bredere uiteinden van de conische openingen naar buiten gericht zijn en de gaten niet over de putjes rusten. Bevestig de botTom plaat stevig zodat het niet glijdt en loslaat. </li><li> Vouw de kamer over en klop het een paar keer plat tegen een tafel zodat het stof door het gaas valt om op de bodemplaat te rusten. </li><li> Schuif de bovenplaat van de kamer in de &quot;open positie&quot; zodat de kleine gaten in lijn zijn met de vijftien putjes, zodat de vliegen in individuele putjes kunnen worden ingevoerd. </li></ol> 2. Vliegvuil en verzorging <ol><li> Laad een vlieg in de mondaspecteur door zachtjes door het ene uiteinde van de aspirator te zuigen alsof u een stro gebruikt. Plaats de vliegen door licht te blazen en de opening naar het doel te richten. </li><li> Aspireer een vlieg in elke bron die gebruikt wordt voor het experiment. Na het laden van een put schuif de bovenplaat zodanig dat de vlieg in de kamer wordt gevangen en plaats de tape over de opening van die goed tijdens het laden van de hele kamer om te voorkomen dat de vlucht ontsnapt terwijl andere bronnen worden geladen. Als meerdere vliegen in een singl worden geoogstWel, laat die opening onbedekt verlaten tot er maar één vlieg overblijft. </li><li> Nadat alle benodigde putjes gevuld zijn met vliegen, flip de kamer zodanig dat de bodemplaat naar boven is, zodat het stof de poten kan bedekken door de maas te vallen. </li><li> Bevestig de boven- en onderplaten stevig door de schroeven aan te draaien en de kamer te vortexen om de vliegen voor 4 s te stofen. </li><li> Knop de kamer (bovenplaat naar beneden) tegen een tafel tweemaal, zodat de kleurstof doorheen gaat naar de andere kant. Draai vervolgens de kamer omhoog (bovenkant van de bovenkant) en keer de kamer tweemaal om ervoor te zorgen dat kleurstof op de bodem van de onderste kamer komt weg van de vlieg in de bovenkamer. </li><li> Voor controlevliegen die niet mogen worden getroffen, ga onmiddellijk door naar stap 3 van het protocol. Voor vliegen die de test afronden, ga verder naar stap 2.7. </li><li> Rust de kamer plat op een tafel of aanrecht met de bovenplaat omhoog dertig minuten omhoog om de vliegen te laten bruiden. Plaats het kamIs in een geluids- en trillingsvrije ruimte om uw omgeving constant te houden voor alle verzorgingsexperimenten (lichtniveau, vochtigheid en temperatuur). Een tafelblad incubator bij RT of 25 ° C met vochtigheidscontroles is ideaal. </li></ol> 3. Bereiding van monsters en absorptieanalyse <ol><li> Draai de bodemplaat met de bovenplaat naar boven om de bodemplaat los en verwijder deze uit de kamer, zorg ervoor dat u geen kleur verliest. </li><li> Plaats de kamer op een Fly CO 2 pad met een lage luchtstroom totdat de vliegen zijn verdoofd. </li><li> Draai de bovenplaat uit de kamer. Gebruik voorzichtig pincet om een ​​been te grijpen en één stof met een stof uit elke kamer te verplaatsen en in een 1,5 ml microcentrifugebuis met EtOH te plaatsen. De transfertijd voor 15 kamers, die elk een vlieg bevatten, bedraagt ​​ongeveer 3-5 minuten. Experimenten zouden in overdrachtijden moeten factoren als / wanneer verrassende experimenten met meerdere kamers zorgen voor een efficiënte opstelling van experimenten. </li&gt; <li> Zodra elke microcentrifugebuis 1 vlieg bevat, sluit de dop en draai de buis drie keer in om te roeren en meng de oplossing van kleurstof en ethanol. </li><li> Incubeer buizen die ethanol bevatten en vliegen gedurende 5 uur bij kamertemperatuur om te zorgen voor volledige verwijdering van de kleurstof uit de vlieg in oplossing. Na de 5 uur, vortex elke buis (2 s) kort om de kleur van de vliegen te verruimen. </li><li> Aliquot 50 μL van de experimentele 1,5 ml buis in een putje van een 96-putjesplaat indien beschikbaar, en let op de plaats van elk monster op de plaat. Voeg 200 μl EtOH toe om het monster 5x te verdunnen. De verdunning vermijdt plafondseffecten van zwaar gestoffeerde vliegen of grote verzorgingsfouten. </li><li> Gebruik een plaatlezer om elk monster te analyseren bij 397 nm. Als alternatief meet de absorptie voor individuele monsters en blanks op een standaard spectrofotometer in het zichtbare spectrum als een plaatlezer niet beschikbaar is. </li><li> Lees en teken het monster door de plaatlezer en sla de spreadsheet op met de recordeD monsters op de plaat. </li></ol> 4. Kwantificering van de resultaten <ol><li> Stel resultaten samen voor alle monsters en meet de variantie voor elk genotype of conditie. OPMERKING: Dye accumulatie op tijd 0 min en op tijd 30 min worden beschouwd als afzonderlijke condities met behulp van statistische analyse door eenrichtings ANOVA en Bonferroni correctie of andere correcties voor meerdere parallelle vergelijkingen. </li><li> Bereken het percentage verschillend percentage voor elk genotype / conditie aan de hand van de volgende vergelijking: [(gemiddelde accumulatie van de accumulatie van de kleurstof bij tijd 0 &#39;- kleurstofaccumulatie gemiddelde waarde op tijd 30&#39;) / kleurstof accumulatie gemiddelde waarde op tijd 0] x 100. </li><li> Geef het percentage voor elk genotype en de conditie in de percelen uit en vergelijk de genotypes en voorwaarden. </li></ol>

<ol><li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347269800060">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li>
<li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hygienic+grooming+is+induced+by+contact+chemicals+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Dawkins, R., Dawkins, M. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=GB19770205092">Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies.</a> Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).</li>
<li>Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951(2014).</li>
<li>King, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromin+Loss+of+Function+Drives+Excessive+Grooming+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22G3-Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).</li>
<li>Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Levels+of+the+Vesicular+Monoamine+Transporter+and+a+Novel+Repetitive+Behavior+in+the+Drosophila+Model+of+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome.</a> Plos One. 6 (11), e27100(2011).</li>
<li>Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+bisphenol+A+on+Drosophila+melanogaster+behavior--a+new+model+for+the+studies+on+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders.</a> Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).</li>
<li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+Drosophila+vesicular+monoamine+transporter+increases+motor+activity+and+courtship+but+decreases+the+behavioral+response+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine.</a> Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).</li>
<li>Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+sexually+dimorphic+behavioral+responses+to+biogenic+amines+in+decapitated+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).</li>
<li>Feng, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li>
<li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7953290">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li>
<li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMB%2C+a+novel+dopamine+receptor+expressed+specifically+in+Drosophila+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).</li>
<li>Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primordial+Dopamine+D1-Like+Adenylyl+Cyclase-Linked+Receptor+from+Drosophila-Melanogaster+Displaying+Poor+Affinity+for+Benzazepines%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Letters%22%5BJournal%5D)">A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines.</a> Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).</li>
<li>Pitmon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+D1+family+dopamine+receptor%2C+DopR%2C+potentiates+hind+leg+grooming+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila.</a> Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).</li>
<li>Phillis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li>
<li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758(2015).</li>
<li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De grooming assay is relatief eenvoudig, maar we zouden waarschuwingsexperimenten speciale aandacht besteden aan de volgende problemen. Het vasthouden van een strakke afdichting door de schroeven op de boven- en onderplaten aan te trekken na het invoeren van vliegen en kleurstof is essentieel voor reproduceerbare resultaten. De briljante gele kleurstof is zeer goed en losse gewrichten zullen verliezen van kleurstof uit de randen van de kamer toestaan. De onregelmatigheid in kleurstofgehalte voor elke put kan gemakkelijk...

Grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) is een robuust aangeboren gedrag dat de coördinatie van meerdere onafhankelijke motorprogramma&#39;s omvat 1 . Fruitvliegen reinigen hun lichamen van stof, microben en andere pathogenen die de normale fysiologische functie zoals visie en vlucht kunnen belemmeren, of leiden tot significante immuunuitdagingen. Bij het detecteren en reageren op zowel mechanische 2 als immuunactivering 3 vliegen vliegen herhaaldelijk hun benen samen of op een gericht lichaamsgebied totdat het voldoende schoon is en de verzorging vordert naar een ander deel van het lichaam. Vliegen verrichten verzorgingsbewegingen in verschillende uitingen die grotendeels voorkomen in stereotype patronen 1 , 4 . Een gedragshiërarchie wordt zichtbaar aangezien de verzorgingssignalen voorrang hebben. Circuits en patronen van de activiteit zijn geïdentificeerd in ondersteuning oFa model dat verzorgingsprogramma&#39;s bovenaan de hiërarchie eerst voorkomen en parallelle signalen onderdrukken van gebieden van het lichaam dat later worden verzorgd 5 . Hoogste prioriteit wordt gegeven aan het hoofd, dan de buik, de vleugels en tenslotte de thorax 5 . Het verzorgingsprogramma in D. melanogaster is een ideaal systeem voor het bestuderen van neurale schakelingen, modulerende moleculaire signalen en neurotransmitters. Bijvoorbeeld, compromis van neurofibromine functie 6 , verlies van Drosophila fragiel X mentale retardatieproteïne ( dfmr1 ) 7 en blootstelling aan bisfenol A (BPA) 8 veroorzaken alles overmatige verzorging en ander gedrag dat analoog is aan discrete menselijke symptomen van neurofibromatose, fragiele X Syndroom, en aspecten van autismespektrum stoornissen en respectievelijk Aandacht-Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD). Grooming gedrag kan ook habitua zijnTed differentieel over mutante stammen 2 , lenend dit motorprogramma aan studies van gedragsplasticiteit. De breedte van neurologische verschijnselen die door Drosophila kunnen worden gemodelleerd, vraagt ​​een nieuwe vergelijkende aanpak om de vliegen te kunnen bepalen om zelf te groomeren. De gecombineerde werking van vesiculaire monoamine transporters en de relatieve overvloed aan dopamine en andere biogene aminen in het lichaam is aangetoond dat het vruchtenvliegverzorgingsgedrag 9 , 10 bemiddelt. Octopamine en dopamine stimuleren vergelijkbare hindleg grooming activiteit in decapitated vliegen, terwijl tyramine, de voorloper van octopamine, ook in mindere mate verzorgt 7 . Vier dopamine receptoren zijn geïdentificeerd in D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup&gt;. Door gebruik te maken van de in dit protocol beschreven verzorgingsmethode, hebben we een rol vastgesteld voor de Dopamine Receptor DopR ( DopR, dDA1, dom ) van type I-familie in het achterliggende verzorgingsgedrag 15 . Grooming kan indirect gekwantificeerd worden door te kijken naar de mate van hygiëne waarmee een dier volledig kan versieren nadat het hele lichaam met een markeringsverf of fluorescerende stof 5 , 16 is gedroogd . De rest van het stof dat op het lichaam ligt, kan als relatieve marker voor het algemene gedrag worden gebruikt. Stofvliegen na het krijgen van voldoende tijd om te bruidegom, kan een specifiek tekort in het verzorgingsgedrag manifesteren. Als verzorgingsonderzoeken uitgebreider zijn, hebben protocollen dergelijke praktijken ingebracht als decapitatie om farmacologische behandelingen op de nekbinding zenuwen toe te voegen 10 , tactiele stimulatie van borstels om de verzorgingsrespons 2 op te wekken,En video-opname van gedrag 15 . Directe waarneming van verzorging kan gemakkelijk worden bestudeerd met behulp van visuele observatie en handmatig registreren van de frequentie en de duur van specifieke verzorgingsgebeurtenissen 4 . We hebben een vijftien goed verzorgingskamer ontworpen die met een 3D-printer of lasersnijder kan worden geconstrueerd, en de blauwdrukontwerpen zijn beschikbaar voor reproductie 15 . Het ontwerp maakt gebruik van twee gecombineerde centrale platen met openingen die zijn aangepast en gescheiden door mazen en twee extra schuif- en onderplaten, waarvan respectievelijk vliegen en / of kleurstof zijn geladen. Nadat we de stoffige vliegen tijd hebben om te verzorgen, plaatsen we ze in ethanol om de kleurstof te oplossen en de absorptie van deze oplossing te meten op de golflengte van de kleurstof. Een plaatlezer kan gebruikt worden voor meerdere parallelle monsters of een afzonderlijke-lezen spectrofotometer kan voor individuele monsters worden gebruikt. Deze methode minimaliseert de fout veroorzaakt door handelen en alLaagtepunten voor grooming assays worden uitgevoerd op een kleinere, kostenefficiënte schaal. Deze methode is afgeleid en gemodificeerd uit de methoden die door Julie Simpson en Andrew Seeds worden gepresteerd, die grotere verzorgingskamers gebruiken met verwarmingselementen voor temperatuurgevoelige circuitmanipulaties 5 . Het volgende protocol toont de kwantificering van de verzorging van het hele lichaam en toont alternatieve methoden voor het kwantificeren van kleurstofopbouw op individuele lichaamsdelen. We presenteren ook steekproefvergelijkingsgegevens tussen WT- en DopR- mutanten, evenals methoden voor het berekenen van een eenvoudige prestatie-index voor verzorgingsgedrag.

<table><tbody><tr><td>High-Flex Tygon PVC Clear Tubing</td><td>McMaster-Carr</td><td>5229K54</td><td>ID 1/8", OD 1/4", gebruikt met micropipettor tips en gaas om mond aspirators te construeren</td></tr><tr><td>Micropipette tips (1 mL en 200 &#956;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-165, 24-150R</td><td></td></tr><tr><td>Nylon gaasscherm, 2 x 2.6"</td><td>McMaster-Carr</td><td>9318T44</td><td>Wordt gebruikt om kamer voor verzorging en mond aspirators te construeren</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5050</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Geel Kleurmiddel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201375-25G</td><td>we raden aan om nitril handschoenen te gebruiken bij het hanteren van dit product</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>instelling 'touch'</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>86-1282</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifugebuisjes</td><td>VWR International</td><td>10025-726</td><td></td></tr><tr><td>0.65 mL microcentrifugebuisjes</td><td>VWR International</td><td>20170-293</td><td>buisjes kunnen worden hergebruikt bij opvolgende tests</td></tr><tr><td>UV 96-well plate</td><td>Corning</td><td>26014017</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HTX Platereader</td><td>BioTek</td><td>catalogus moet worden gedownload om toegang te krijgen tot productnummer</td><td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview</td></tr><tr><td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td></tr><tr><td>Drosophila Incubator</td><td>Tritech</td><td>DT2-CIRC-TK</td><td></td></tr><tr><td>1/4" acryl plastic</td><td>McMaster-Carr</td><td>8473K341</td><td></td></tr><tr><td>8 - 32 moeren</td><td>McMaster-Carr</td><td>90257A009</td><td></td></tr><tr><td>8 - 32 x 1" zeskantkopschroeven</td><td>McMaster-Carr</td><td>92185A199</td><td>de onderste plaat moet worden getapt voor deze schroefmaat</td></tr><tr><td>8 - 32 x 1/2" zeskantkopschroeven</td><td>McMaster-Carr</td><td>92185A194</td><td>de tweede plaat vanaf de bovenkant moet worden getapt</td></tr><tr><td>2 - 56 3/8" platte kop phillips machine schroeven</td><td>McMaster-Carr</td><td>91500A088</td><td>deze houden de twee middelste platen bij elkaar</td></tr><tr><td>0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminium buis</td><td>McMaster-Carr</td><td>92510A044</td><td>Gefabriceerd in eigen beheer; het vermelde product heeft ongeveer dezelfde afmetingen en zou moeten werken voor schroefmaat 8.  Deze fungeren als omhulsels voor de 1" schroeven en plaatsen de zeskantkop iets hoger dan het oppervlak van de bovenste plaat</td></tr></tbody></table>

kwantificering van drosophila grooming gedrag

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming gedrag is een complex multi-step lokomotorisch programma dat gecoördineerde beweging van zowel voorbenen als achterpoten vereist. Hier presenteren we een verzorgingsprotocol en een nieuw kamerontwerp dat kostenefficiënt en schaalbaar is voor kleine of grootschalige studies van Drosophila grooming. Vliegen zijn over hun lichaam gestoffeerd met Brilliant Yellow kleurstof en geven de tijd om de kleurstof van hun lichamen in de kamer te verwijderen. Vliegen worden dan in een vast volume ethanol afgezet om de kleurstof te oplossen. De relatieve spectrale absorptie van kleurstof-ethanolmonsters voor verzorgde versus jongroomdieren wordt gemeten en opgenomen. Het protocol levert kwantitatieve gegevens van kleurstofaccumulatie voor individuele vliegen, die gemakkelijk kunnen worden vergeleken en vergeleken over monsters. Dit laat experimenteel ontwerpen toe om makkelijk te kunnen beoordelen van het rijgedrag voor mutante dierstudies of circuitmanipulaties. Deze efficiënte procedure is zowel veelzijdig als schaalbaar. Wij tonen wOrk-flow van het protocol en vergelijkende data tussen WT-dieren en mutante dieren voor de Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR ).

De grooming assay levert kwantitatieve data op om de gedragsprestaties te beoordelen op basis van het relatieve restant van geaccumuleerde kleurstof die op de lichamen van vliegen achterblijft na een ingestelde tijdstip voor grooming (30 minuten). Voorbeeldbeelden van het ontwerp van het glijplezierkamer en de belangrijkste stappen van de analyse worden in Figuur 1 gemarkeerd. Vliegt aggregaat een significante hoeveelheid kleurstof uit onmiddellijke afstoften door vortex...

Dit protocol beschrijft een schaalbare individuele grooming assay techniek in Drosophila die robuuste, kwantitatieve data levert om grooming gedrag te meten. De methode is gebaseerd op het vergelijken van het verschil in ophoping van de kleurstof op de lichamen van niet-verzorgde versus geklede dieren over een bepaalde periode.

Kwantificering van Drosophila Grooming Gedrag

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Het algemene doel van deze methode is om het verzorgingsgedrag van Drosophila te meten door de hoeveelheid overgebleven gekleurde briljantgele kleurstof op het lichaam van de dieren in verzorgde en onverzorgde condities te kwantificeren en te vergelijken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neurobiologie en de gedragsgenetica, zoals de coördinatie van fijne motorische vaardigheden en de bijbehorende moleculaire regulatoren en circuits. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze snel, robuust en eenvoudig uit te voeren is door veel experimentatoren en studenten op verschillende vaardigheidsniveaus.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Frankie Barradale, een student in mijn laboratorium. Bereid ter start van het experiment een aspirator voor om levende Drosophila van een kweekbuis naar de verzorgingskamer te verplaatsen. Knip met een schaar 1,5 feet Tygon-slang af.Snijd minstens 2,5 cm van de punt van een wegwerp micropipetpunt van 1 ml af en houd het vierkante stukje gaas van 1 cm over de opening van de afgesneden punt. Plaats een nieuwe micropipetpunt van 1 ml stevig over het gaas en de afgesneden punt om een houdkame

quantification-of-drosophila-grooming-behavior

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Drosophila melanogaster is een genetisch en gedragsmatig soepel model systeem dat is gebruikt om de moleculaire en cellulaire basis van een groot aantal belangrijke biologische processen meer dan een eeuw een begrip. Drosophila goed is benut om inzicht te krijgen in de genetische basis van vlieg gedrag.

Methoden om Assay Drosophila Gedrag

Deze video beschrijft één methode om een vliegenaspirator te bouwen, die kan worden gebruikt om insecten zonder anesthesie tussen behuizingen over te brengen. De aspirator in het voorbeeldprotocol was voorbereid op een experiment om individueel verzorgingsgedrag te...

Fly Aspirator Tube: een eenvoudig hulpmiddel om live drosophila over te dragen

De automatische tracking systeem Flywalk wordt gebruikt voor hoge-resolutie kwantificering van geur-begeleide gedrag in Drosophila melanogaster.

Hoge-resolutie Kwantificering van Geur-begeleide Gedrag in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Met behulp van de<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

Om nieuwe mutaties die de mechanosensatie beïnvloeden te identificeren, ontwierpen we een test die de gedragsreactie op tactiele stimulatie van vliegborsten meet in mutante klonen die gegenereerd zijn door de MARCM-methode. De combinatie van technieken maakt het mogelijk om mechanogevoelige mutaties te identificeren die anders dodelijk zouden zijn.

Een Behavioral Assay voor Mechanosensation van MARCM-gebaseerde klonen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit artikel beschrijft een gedrags-test die mannetje mating drive in Drosophila melanogaste r om de motivatie te bestuderen gebruikt. Met deze methode kunnen onderzoekers gebruiken geavanceerde fly neurogenetische technieken om de genetische, moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze motivatie ontdekken.

Het meten en de wijziging van Mating Drive in Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit protocol beschrijft een Drosophila- leer- en geheugenassessie, genaamd courtship conditioning. Deze klassieke test is gebaseerd op een vermindering van mannelijk hofgedrag na seksuele afwijzing door een non-receptive premated female. Deze natuurlijke vorm van gedragsplasticiteit kan worden gebruikt om leer, kortlopend geheugen en langdurig geheugen te testen.

Drosophila Courtship Conditioning als een maat van leren en geheugen

Dit werk beschrijft een eenvoudig gedragsparadigma dat de analyse van aversief associatief leren bij volwassen fruitvliegen mogelijk maakt. De methode is gebaseerd op het onderdrukken van het aangeboren negatieve geotaxisgedrag als gevolg van de associatie gevormd tussen een specifieke omgevingscontext en een elektrische schok.

Drosophila Passief vermijdingsgedrag als een nieuw paradigma om associatief aversief leren te bestuderen

Autisme Spectrum Stoornis (ASS) wordt geassocieerd met verminderd sociaal en communicatief gedrag en het ontstaan van repetitief gedrag. Voor het bestuderen van de onderlinge relatie tussen ASS-genen en gedragsstoornissen in het Drosophila-model , worden in dit artikel vijf gedragsparadigma's beschreven voor het bepalen van sociale afstand, agressie, verkering, verzorging en gewenningsgedrag.

Paradigma's voor gedragsbeoordeling in het Drosophila-model van autismespectrumstoornis

Knaagdiermodellen zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van kerngedrag dat verband houdt met autismespectrumstoornis (ASS). In dit artikel gaan we dieper in op twee gedragstests voor het modelleren van de kernkenmerken van ASS bij muizen: zelfverzorging, die repetitief gedrag beoordeelt, en de driekamertest voor sociale interactie, die sociale beperkingen documenteert.

Strategieën voor het beoordelen van autistisch-achtig gedrag bij muizen

De hier gepresenteerde methode omvat het handmatig annoteren van beeldmateriaal dat is verkregen van Drosophila melanogaster voor specifiek verzorgingsgedrag. Het maakt het mogelijk om zowel het aantal vlooiingsperiodes als de totale tijd die aan vlooiing wordt besteed te kwantificeren om te evalueren op atypische fenotypes van zelfverzorging.

Kwantificering van het verzorgingsgedrag van Drosophila melanogaster voor evaluatie van overmatige verzorgingsfenotypes

Leer een schaalbare grooming-assay in Drosophila met kleurstofaccumulatie voor neurobiologie en gedragsgenetica. Deze methode levert snelle, robuuste kwantitatieve gegevens over verzorgingsgedrag.

Kwantificering van Drosophila Grooming Gedrag

Meer video's verkennen