Kwantificering van Drosophila Grooming Gedrag

Het algemene doel van deze methode is om het verzorgingsgedrag van Drosophila te meten door de hoeveelheid overgebleven gekleurde briljantgele kleurstof op het lichaam van de dieren in verzorgde en onverzorgde condities te kwantificeren en te vergelijken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neurobiologie en de gedragsgenetica, zoals de coördinatie van fijne motorische vaardigheden en de bijbehorende moleculaire regulatoren en circuits. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze snel, robuust en eenvoudig uit te voeren is door veel experimentatoren en studenten op verschillende vaardigheidsniveaus.

Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Frankie Barradale, een student in mijn laboratorium. Bereid ter start van het experiment een aspirator voor om levende Drosophila van een kweekbuis naar de verzorgingskamer te verplaatsen. Knip met een schaar 1,5 feet Tygon-slang af.

Snijd minstens 2,5 cm van de punt van een wegwerp micropipetpunt van 1 ml af en houd het vierkante stukje gaas van 1 cm over de opening van de afgesneden punt. Plaats een nieuwe micropipetpunt van 1 ml stevig over het gaas en de afgesneden punt om een houdkamer voor vliegen te creëren. Snijd de uiterste punt van de nieuwe micropipetpunt af om de opening voldoende te verbreden zodat er één enkele vlieg doorheen kan passeren.

Het gat zal ongeveer overeenkomen met de opening van de verzorgingskamer. Plaats de geneste tips stevig op het uiteinde van de Tygon-slangen. Duw de tips in de slang om een nauwe aansluiting te garanderen, zodat vacuümdruk mogelijk is.

Snijd aan het andere uiteinde van de slang het puntje van een 200 milliliter micropipetpunt af en plaats het smalle, afgesneden uiteinde in de slang om de mondzijde van de aspirator te vormen. Om buisjes met stofaliquoten voor te bereiden, weegt u vijf milligram heldergele kleurstof af op weegpapier. Giet het stof in een 8 milliliter microcentrifugebuisje en sluit de dop stevig.

Pipette vervolgens één milliliter 100% ethanol in 15 milliliter microcentrifugebuisjes om de ethanolbuisjes voor te bereiden. Label de buisjes, sluit ze af en bewaar de ethanolbuisjes tot de voltooiing van de groom-assay. Voeg ook ten minste één blanco monster toe met slechts één milliliter ethanol zonder vlieg voor de negatieve controles.

Stel elke groomkamer samen door de schuifplaat met de kleinere gaten vast te schroeven, maar laat de bodemplaat met de grotere gaten verwijderd voor de toevoeging van het stof. Plaats elke benodigde groomkamer plat op een tafel met de bovenzijde naar beneden. Laad vijf milligram van een aliquot briljant gele kleurstof in elke kamer door de buis tegen het oppervlak van de kamer boven de gewenste put te tikken.

Tik de kamer tegen de tafel om ervoor te zorgen dat al het stof door het gaas naar de bovenkant van de plaat valt. Schroef vervolgens de bodemplaat op elke kamer, zodanig dat de bredere uiteinden van de conische openingen naar buiten zijn gericht en de gaten niet boven de wells rusten. Zet de bodemplaat stevig vast, zodat deze niet verschuift en er geen kleurstof vrijkomt.

Keer de kamer om en tik deze een paar keer plat tegen de tafel, zodat het stof door het gaas naar beneden valt en op de bodemplaat rust. Schuif de bovenplaat van de kamer naar de open posities waarbij de kleine gaatjes zijn uitgelijnd met de 15 wells, zodat de vliegen in de individuele wells kunnen worden geïntroduceerd. Laad één vlieg in de mondaspirator door voorzichtig door één uiteinde van de aspirator te zuigen, alsof u een rietje gebruikt.

Plaats de vliegen door voorzichtig te blazen en de opening naar het doel te richten. Schuif na het vullen van een putje de bovenplaat zodanig dat de vlieg in de kamer wordt gevangen en breng plakband aan over de opening van het putje tijdens het vullen van de kamer, om te voorkomen dat de vlieg ontsnapt terwijl de andere putjes worden gevuld. Als er meerdere vliegen in één putje zijn gezogen, laat die opening dan onbedekt tot er nog maar één vlieg overblijft.

Nadat alle benodigde putjes met vliegen zijn gevuld, kantelt u de kamer zodat de bodemplaat naar boven wijst en het poeder de vliegen kan bedekken door door het gaas te vallen. Zet de boven- en onderplaten stevig vast door de schroeven aan te draaien en vortex de kamer vier seconden om de vliegen te bestuiven. Tik de kamer twee keer met de bovenplaat naar beneden tegen de tafel, zodat de kleurstof naar de andere kant valt.

Keer de kamer vervolgens om, met de bovenplaat naar boven, en tik tweemaal tegen de kamer om ervoor te zorgen dat de kleurstof op de bodem van de onderste kamer bezinkt, weg van de vlieg die in de bovenkamer wordt vastgehouden. Ga bij controlevliegen, die niet mogen poetsen, direct over naar de monsterpreparatie. Zet de kamer 30 minuten plat op de tafel of het aanrecht met de bovenplaat naar boven, zodat de vliegen kunnen poetsen.

Plaats de kamer in een ruimte zonder geluidstrillingen om uw omgeving constant te houden voor alle verzorgingsexperimenten. Terwijl de kamer waterpas wordt gehouden met de bovenplaat naar boven, draait u de bodemplaat voorzichtig los en verwijdert u deze uit de kamer, waarbij u er goed op let dat er geen kleurstof verloren gaat. Plaats de kamer op een CO2-pad met een lage luchtstroom totdat de vliegen zijn genarceerd.

Draai de bovenplaat van de kamer los, gebruik voorzichtig een pincet om een poot vast te pakken en verwijder één bestoofde vlieg uit elke kamer en plaats deze in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met ethanol. Zodra elke microcentrifugebuis één vlieg bevat, sluit u de dop en keer u de buizen drie keer om om de oplossing van kleurstof en ethanol te agiteren en te mengen. Incubeer de buizen met ethanol en vliegen gedurende vijf uur bij kamertemperatuur om volledige verwijdering van de kleurstof uit de vlieg in de oplossing te garanderen.

Vortex na vijf uur elke buis kort gedurende twee seconden om ervoor te zorgen dat de kleurstoffen volledig van de vliegen zijn verwijderd. Pipetteer 50 µL uit de experimentele buis van 1,5 mL in een putje van een 96-wellplaat en noteer de locatie van elk monster op de plaat. Voeg 200 µL ethanol toe om het monster vijfmaal te verdunnen, om verzadigingseffecten door zwaar bestuifde vliegen of grote groomdefecten te voorkomen.

Gebruik een platenlezer om elk monster te analyseren bij 397 nanometer. Registreer het monster via de platenlezer en sla het spreadsheet met de monsters op de plaat op. We hebben deze methode gebruikt om DopR te bestuderen door de verzorgingsprestaties van een sterke hypomorf en van DopR-nulmutanten te vergelijken met een wild-type stam.

De DopR-mutanten hielden significant meer kleurstof vast dan hun wild-type of gereduceerde tegenhangers, wat erop wijst dat de DopR-mutanten minder efficiënt waren in hun verzorgingsgedrag. In een parallele experiment met Rutabaga-vliegen vertoonden de mutanten hogere niveaus van kleurstofaccumulatie dan de DopR-mutanten, wat suggereert dat DopR een significante rol speelt in het verzorgingsgedrag. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe vliegen moeten worden gehanteerd voor gedragstesten en hoe het verzorgingsgedrag moet worden gemeten.