Name: Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Leer systemische en gelokaliseerde zebravisinfectiemodellen voor het bestuderen van humaan influenzavirus A. Deze methoden helpen onderzoekers antivirale middelen te screenen en immuunresponsen te karakteriseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Mark Nilan bedanken voor de verzorging en het onderhoud van de zebravis en Meghan Breitbach en Deborah Bouchard voor het vermeerderen van NS1-GFP en het bepalen van IAV-titers. Dit onderzoek werd ondersteund door NIGMS-subsidie NIH P20GM103534 en de Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publicatienummer 3493).

Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd met behulp bioveiligheidsniveau 2 (of BSL2) standaarden beschreven door de Amerikaanse Centers for Disease Control (CDC) en in overeenstemming met de door Institutional Animal Care en gebruik Commissies (IACUC) richtlijnen. Gelieve te overleggen met de juiste ambtenaren om de veiligheid en de naleving te waarborgen. 1. zebravis Onderhoud <ol><li> Paaien zebravis en verzamel het vereiste aantal embryo&#39;s voor de experimenten. Indien nodig, massa kweekbakken, zoals die beschreven door Adatto et al. 32, kan worden gebruikt om grote aantallen ontwikkelingsgebied-gefaseerde embryo&#39;s te verzamelen. </li><li> Laat embryo&#39;s te ontwikkelen tot de gewenste ontwikkelingsstadium (48 uur na de bevruchting voor een systematische IAV infectie [deel 3] of 5 dagen na de bevruchting voor een gelokaliseerde, blaasontsteking zwemmen [deel 4]) in diepe petrischaaltjes bij lage dichtheid (&lt; 100 embryo&#39;s / gerecht) bij 28 ° C in steriel ei water met 60 ug / ml zeezout (bijvoorbeeld Instant Oceaan) in gedestilleerd water. <ol><li> Het verwijderen van dode embryo&#39;s met plastic overdracht pipetten en verander ei water per dag om een ​​optimale gezondheid en ontwikkeling te waarborgen. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding van de materialen en reagentia <ol><li> Bereid een 4 mg / ml voorraad oplossing van tricaïne-S (de pH instellen op 7,0-7,4) in gedestilleerd water en autoclaaf. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Trek borosilicaatglas capillairen met filamenten met behulp van een micropipet trekker (bijv Micropipet Puller met de volgende instellingen: drukinstelling = 100, warmte = 550, trekt = [geen waarde], snelheid = 130, time = 110). OPMERKING: Vóór knippen van de naald, de lengte waar de naald begint taps naar de punt van de naald zou ongeveer 12-15 mm. Dit kan echter variëren op basis van voorkeur en toepassing. Een langere, meer geleidelijke tapsheid kan meer de voorkeur vanwege de toegenomen vermogen om de embryo doorboren en de verlaagde risk van de naald buigen of breken. </li><li> Smelt 2 g agarose in 100 ml ei water met behulp van een magnetron. Maak platen waarop line-up en injecteer de embryo&#39;s door het gieten van gesmolten agarose in diepe petrischalen en te laten stollen. </li><li> Maak een 10 mg / ml voorraad van zanamivir in nuclease-vrij water. Aliquot en bevriezen bij -20 ° C. </li><li> Smelt 0,5 g agarose in 50 ml ei water met behulp van een magnetron te maken embryo montage agarose. Handhaven waterbad van 50 ° C tot gebruik bij beeldvorming. </li></ol> 3. Systemische IAV Infection (48 uur na de bevruchting) LET OP: Alle onderzoek personeel moeten overleggen met hun begeleiders en artsen met betrekking tot de vaccinatie vóór de aanvang van de werkzaamheden met de IAV. <ol><li> Handmatig dechorionate embryo op de dag van het experiment met behulp van # 5 tang. Zorg verwijderen en inslapen embryo&#39;s die zijn geblesseerd tijdens het proces 200 ug / ml tricaïne oplossing. </li><li> voorbereiding of IAV voor Micro-injectie OPMERKING: Stammen die is aangetoond dat zebravis embryo infectieziekten influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), influenza A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31) en de fluorescente reporter influenza stam NS1-GFP 33. Details over APR8 en X-31, en andere stammen, kan gevonden worden op de Influenza Onderzoek Databank <ol><li> Propageren NS1-GFP-stam van IAS op geëmbryoneerde kippeneieren zoals eerder beschreven 34, 35. Verzamelen aliquot en het titreren allantoïsvocht dat iav en bewaar bij -80 ° C. Pre-getitreerd APR8 en X-31 virussen kunnen commercieel worden aangeschaft. <ol><li> Net voor infectie, snel ontdooien een IAV hoeveelheid in gehandschoende handen en vervolgens snel te plaatsen op ijs om het verlies van titer te verminderen. </li></ol></li><li> viral verdunning <ol><li> Als u de APR8 of X-31 virussen, te verdunnen tot 3,3 x 10 6 ei infectieuze dosis 50% (EID50) / ml in steriele, ijskoude PBS supplemteerde met 0,25% fenol rood (om te helpen bij de visualisatie) in een laminaire stroming kap. Tegelijkertijd het opzetten van een controle met steriele PBS met 0,25% fenol rood. </li><li> Bij gebruik NS1-GFP-stam 33 verdund tot ~ 1,5 x 10 2 plaquevormende eenheden (PFU) per nl in steriele, ijskoude PBS met 0,25% fenolrood (om te helpen bij visualisatie) in een laminaire stroming kap. Tegelijkertijd het opzetten van een controlegroep met allantoïsvocht van geïnfecteerde kippeneieren verdund als het virus in steriele PBS met 0,25% fenol rood. </li><li> Handhaaf IAV op ijs pas klaar voor gebruik. </li></ol></li><li> Pipet virusoplossing in micro-injectie naalden gebruikt microloader tips vlak voor gebruik. Steek micro-injectie naald in de juiste houder van de injectie-inrichting (bijv MPPI-3 druk injectiesysteem). </li><li> Tijdens het bekijken van onder de stereo microscoop, voorzichtig clip de micro-injectie naald met scherpe, gesteriliseerde # 5 tang. NB: Het is recommenDED dat de micro-injectie tip geleidelijk worden afgekapt. </li><li> Druk het voetpedaal van de druk inspuitsysteem en injecteer in een daling van de microscoop immersie olie op een kalibratie micrometer. Meet de diameter van de druppel. Bereken het volume van de druppel met de formule V = 4 / 3πr 3, waarbij V het volume nl en r de straal in urn. OPMERKING: Als de daling diameter te klein is, kunnen extra glas worden geknipt of de druk en de timing instellingen kunnen worden aangepast. Als de druppel diameter te groot is, kan de druk en timing instellingen worden aangepast. </li><li> Bandenspanning en timinginstellingen van de druk injector en / of reclip de naaldpunt tot het gewenste injectievolume is bereikt (gewoonlijk 1-3 nl). Drukinstellingen tussen 20 en 30 psi en pulsduur omgeving tussen 40 en 80 msec zijn typisch. Stel tegendruk zodat het tellers capillaire druk, maar niet lek IAV (netto nul druk). </li></ol></li><li> Lijn Embryo&#39;s voor injectie <ol><li> Verdoven dechorionated embryo&#39;s in 200 ug / ml tricaïne. </li><li> Zodra de beweging ophoudt, transfer 10-20 embryo&#39;s tot een 2% agarose plaat (opgesteld in paragraaf 2.3) met een plastic pipet. Gebruik plastic pipet om overtollige vloeistof te verwijderen. </li><li> Voorzichtig uitlijnen embryo&#39;s voor micro-injectie met een brand-gepolijst en verzegeld borosilicaatglas capillair. Met behulp van een stereo-microscoop, voorzichtig oriënteren embryo&#39;s, zodat het kanaal van Cuvier of de ader achterste kardinaal is in lijn met de micro-injectie naald (Figuur 1A). </li></ol></li><li> IAV Micro-injectie <ol><li> Steek de micro-injectie naald in het kanaal van Cuvier of de ader achterste kardinaal. Druk voetpedaal om de gewenste hoeveelheid IAV injecteren in de bloedsomloop van het embryo (Figuur 1A). Embryo&#39;s kunnen meerdere keren worden geïnjecteerd indien nodig. LET OP: De injectie bolus moet worden geveegd in de circulatie en distribbijge- hele lichaam. Als injectievolume verzamelt op de plaats van injectie, verwijder embryo van experiment en euthanaseren. </li><li> Herhaal injecties op verschillende embryo controleoplossing specifiek voor de stam van het virus gekozen. Voor APR8 en X-31, gebruik maken van de in paragraaf 3.2.2.1 beschreven controle; voor de NS1-GFP, gebruik maken van de in paragraaf 3.2.2.2 beschreven controle. </li></ol></li><li> Transfer embryo&#39;s gelabelde platen met steriel ei water en plaats in incubators bij 33 ° C. OPMERKING: Geïnfecteerde embryo&#39;s worden gekweekt bij 33 ° C om verbeterde virale replicatie ondersteunen. Bovendien, incubatie bij 33 ° C beter bootst de temperatuur van het menselijke bovenste luchtwegen, die in nauw contact met lagere temperaturen in de externe omgeving en is waar iav besmettingen. Embryo&#39;s kunnen wennen aan een breed temperatuurbereik 34. </li></ol> 4. Gelokaliseerde, Swim Blaas IAV Infectie in Tg (MPX: mCherry) </em&gt; transgene zebravis (5 dagen na de bevruchting) <ol><li> Bereiding van IAV voor Microinjection <ol><li> Verdun de NS1-GFP-stam en controle oplossing voor injectie zoals beschreven in paragraaf 3.2. </li><li> Bereid naalden zoals beschreven in paragraaf 2.2. </li><li> Lijn Tg (MPX: mCherry) 35 larven die opgeblazen zwemblazen zoals beschreven in paragraaf 3.3 met de volgende uitzondering. Lijn larven zodanig dat de naald de zwemblaas kunnen doorboren en het virus kan worden gestort op de achterkant van de zwemblaas, zoals eerder beschreven 36 (Figuur 2A). </li></ol></li><li> IAV Micro-injectie <ol><li> Steek de micro-injectie naald in de zwemblaas en injecteer het gewenste volume (bv 5 nl) naar de achterkant van de structuur (Figuur 2A). OPMERKING: De injectie bolus te verzamelen in de richting van het achterste en de zwemblaas van de luchtbel moet be verplaatst naar voren. GFP expressie moet beginnen worden waargenomen op 3 uur na injectie. </li><li> Herhaalde injecties controleoplossing specifiek voor de virusstam gekozen, zoals beschreven in paragraaf 3.4.2. </li></ol></li><li> Transfer larven platen met steriel ei water en plaats in incubators bij 33 ° C. </li></ol> 5. Antivirale Drug Treatment NB: De onderstaande protocol beschrijft de Zanamivir behandeling eerder aangetoond in Gabor et al. 19. Dit protocol kan worden aangepast om andere antivirale middelen screenen en het potentieel worden aangepast om meerdere verbindingen in een 96 wells plaat, high-throughput screening format. <ol><li> Op 3 uur na infectie, vervang ei water van NS1-GFP-and-control besmette vis met steriel ei water met 0, 16,7 of 33,3 ng / ml Zanamivir. Opmerking: Deze concentraties werden gekozen om te trachten de fysiologische niveaus bereikt fo replicerenllowing toediening van zanamivir bij menselijke patiënten (100, 200, of 600 mg, iv, tweemaal daags of 10 mg geïnhaleerd, tweemaal daags). De serumconcentraties bij menselijke patiënten varieerde 9,83-45,3 ng / ml 36. </li><li> In de loop van 5 dagen, veranderen ei water elke 12 uur en te vervangen door steriele ei water met daarin de juiste hoeveelheid zanamivir. </li><li> Track Course van infectie. <ol><li> Verdoven zebravis in 200 ug / ml tricaïne. Monitor GFP expressie door stereo fluorescentiemicroscopie verschillen in infectie patronen tussen IAV-geïnfecteerde en controle vis en tussen de vis ondergedompeld in de verschillende concentraties van geneesmiddelen visueel observeren. </li><li> Volg morbiditeit en mortaliteit in de loop van 5 dagen. <ol><li> Record observaties over infectie dynamiek gerelateerd aan de ziekte pathologie, waaronder tekenen van lethargie en het bewijs van oedeem, verschillen in pigmentatie, oculaire en craniofaciale misvormingen, en lordose. pathologietypisch blijkt controle geïnfecteerde vissen bij 24-48 uur na injectie, afhankelijk van de hoeveelheid virus ingespoten. Verzamel beelden 24 uur na injectie. </li><li> Om de 24 uur gedurende 5 dagen na infectie, noteert u het aantal doden, ziekelijk, en gezonde larven. De dood wordt bepaald door de afwezigheid van een merkbare hartslag. Plot gegevens zoals gewenst. Bijvoorbeeld plotgegevens als gestapelde staafdiagram met percentages van gezonde, ziekelijk of dode vissen uitgezet op de y-as en de behandelde groep op de x-as. 19 LET OP: De sterfte kan worden gescoord door Kaplan-Meier survival schattingen. Afhankelijk van de toepassing, kan het zinvol zijn om alternatieve benaderingen voor het scoren vis morbiditeit, met inbegrip van een scoring matrix die de mate van morbiditeit op basis van de eerder genoemde pathologische kenmerken waargenomen kunnen kwantificeren ontwikkelen. </li><li> Neem contact op met een statisticus te zijn om de juiste statistische analyses toe te passen. </li></ol></li></ol></li></ol> 6. neutrofielen migratie LET OP: De onderstaande protocol beschrijft een methode voor het bijhouden van neutrofielen migratie naar de zwemblaas na een gelokaliseerde, epitheliale IAV infectie. De beschreven werkwijzen kunnen worden gewijzigd om de effecten van genetische en chemische manipulaties testen. Met deze techniek is het mogelijk om de onderliggende mechanismen neutrofiel karakteriseren, bij een IAV infectie. <ol><li> Montage zebravis for Imaging <ol><li> Verdoven larven te beelden in 200 ug / ml tricaïne. </li><li> Transfer een individuele Tg (MPX: mCherry) larve die is geïnfecteerd met NS1-GFP een putje van een 24 goed, glazen bodemplaat in een kleine druppel ei water (~ 50-100 pi). Herhaal dit met andere IAV-geïnfecteerde en controle vis. </li><li> Voeg langzaam 1% agarose embryo montage media aan elk putje (paragraaf 2.5), het verzorgen grote luchtbellen te introduceren. <ol><li> Voorzichtig de positie van de larve passen zodat het op zijn kant is geplaatst.Goody en Henry 37 beschrijven hoe probes die goed functioneren in deze applicatie gebruik van insect pinnen die in borosilicaatglas capillairen met filamenten zijn gemonteerd en superglued in de plaats te maken. </li></ol></li><li> Zodra de agarose verhardt, voorzichtig de afzonderlijke putjes te vullen met ei water die 200 ug / ml tricaïne. </li><li> Met een confocale microscoop, capture az stack reeks helderveld en fluorescentie beelden met behulp van een 20x doelstelling gericht op de zwemblaas. <ol><li> Stel de boven- en ondergrens zodat ze allemaal zichtbaar waarneembare groene en rode fluorescentie vangen. </li><li> Maak foto&#39;s op 2,0 psec / pixel met de stappen die zijn ≤ 4 micrometer. Het verhogen van de tijd per pixel en het verminderen van de afstand tussen de stappen (bv 0,5-1,0 pm) verhoogt de beeldresolutie en kwaliteit. </li><li> Genereer een twee-dimensionaal beeld door het samenvoegen van lagen. </li><li> Vergelijk het aantal MPX-mCherry-positieve neutrofielen aanwezig in de zwemblazen van IAV-geïnfecteerde and-control geïnjecteerd zebravis. </li></ol></li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om de voordelen verkregen uit een klein proefdiermodel voor menselijke gastheer-pathogeen interacties modelleren maximaliseren, is het belangrijk om vraagstellingen en testen hypothesen die kapitaliseren op de inherente voordelen van het modelsysteem omlijsten. Als model voor de menselijke IAV infectie, de zebravis heeft een aantal sterke punten, met inbegrip van hoge vruchtbaarheid, optische helderheid, ontvankelijkheid voor drug discovery, en de beschikbaarheid van transgene lijnen die immuuncellen zoals neutrofielen ...

Volgens de World Health Organization (WHO), influenza infecteren 5-10% van de volwassenen en 20-30% van de kinderen en veroorzaken jaarlijks 3-5.000.000 ernstig ziek maken en tot 500.000 sterfgevallen wereldwijd 1. Jaarlijkse inentingen tegen griep blijft de beste optie om de ziekte te voorkomen. Inspanningen, zoals de WHO Global Action Plan hebben seizoensgebonden vaccin gebruik, de productie van vaccins capaciteit, en onderzoek en ontwikkeling verhoogd naar meer potente vaccins strategieën om de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met seizoensgebonden influenza-uitbraken 2 te verminderen. Antivirale middelen zoals neuraminidase-remmers (bijv Zanamivir en Oseltamivir) zijn verkrijgbaar in sommige landen en bij het verminderen van de symptomen effectief zijn gebleken, wanneer het wordt toegediend binnen de eerste 48 uur na het optreden 3, 4, 5. Ondanks de wereldwijde inspanningen, inperking van seizoensgriep outbreaks blijft een geweldige uitdaging op dit moment, zoals influenzavirus antigene drift overschrijdt vaak actuele vermogen aan te passen aan de veranderende genoom van het virus 6. Vaccin strategieën gericht op nieuwe stammen van het virus moeten worden ontwikkeld op voorhand en zijn soms minder dan optimaal effectief gemaakt door onvoorziene veranderingen in de aard van de stammen die uiteindelijk de overhand hebben in een influenza-seizoen. Daarom is er duidelijk behoefte aan alternatieve therapeutische strategieën die infecties en vermindering van sterfte ontwikkelen. Door een beter begrip van de host-virus interactie, kan het mogelijk zijn om nieuwe anti-influenza medicijnen en adjuvante therapieën 7, 8 ontwikkelen. De menselijke gastheer-influenza A virus (IAV) interactie complex. Verschillende diermodellen van menselijke besmetting IAV zijn ontwikkeld om inzicht te krijgen in de host-virus interactie, including muizen, cavia&#39;s, katoen ratten, hamsters, fretten, en makaken 9. Terwijl het verstrekken van belangrijke gegevens die het begrip van gastheer-IAV dynamiek hebben verbeterd, elk model organisme bezit belangrijke nadelen die moeten worden overwogen bij een poging om de bevindingen te vertalen naar de humane geneeskunde. Bijvoorbeeld, muizen, die de meest gebruikte model zijn, niet gemakkelijk te ontwikkelen IAV-geïnduceerde infectie symptomen wanneer besmet met humane influenza-isolaten 9. Dit komt omdat muizen niet de natuurlijke tropisme voor humane influenza-isolaten sinds muis epitheelcellen tot expressie α-2,3 siaalzuurkoppelingen plaats van de α-2,6 siaalzuurkoppelingen uitgedrukt op menselijke epitheelcellen 10. De hemagglutinine eiwitten die in humane isolaten IAV gunstig binden en voer gastheer cellen die α-2,6 siaalzuurkoppelingen doorgaande receptor veroorzaakte endocytose 9, 11, </sup&gt; 12, 13. Bijgevolg wordt nu aangenomen dat bij de ontwikkeling muismodellen voor humane influenza, zorg moet worden afgegeven bij een stam van muis paren met de geschikte stam van influenza om ziekte fenotypes die aspecten van de menselijke ziekte recapituleren bereiken. Daarentegen epitheelcellen in de bovenste luchtwegen van fretten bezitten α-2,6 siaalzuurkoppelingen dat menselijke cellen 14 lijken. Geïnfecteerde fretten hebben veel van de pathologische en klinische kenmerken waargenomen in de menselijke ziekten, met inbegrip van de pathogeniteit en overdraagbaarheid van de menselijke en het vogelgriepvirus 14, 15. Ze zijn ook zeer vatbaar zijn voor werkzaamheid van het vaccin studies. Toch is de fret model voor humane influenza heeft een aantal nadelen voornamelijk verband houden met hun omvang en de kosten van de veehouderij die overname te maken van statistisch significant data uitdagend. Bovendien hebben fretten eerder weergegeven verschillen in farmacokinetica drug, biobeschikbaarheid en toxiciteit die bepaling van de doelmatigheid bemoeilijken. Bijvoorbeeld, fretten vertonen toxiciteit voor de M2 ionkanalen inhibitor amantadine 16. Aldus is het duidelijk dat de keuze van een diermodel om vragen over menselijke iav infecties te bestuderen, is het belangrijk de inherente voordelen en beperkingen, en het aspect van de host-virus interactie die wordt onderzocht overwegen. De zebravis, Danio rerio, een diermodel dat unieke mogelijkheden biedt voor het onderzoeken van microbiële infectie, gastheer immuunrespons en potentieel geneesmiddel therapieën 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 24, 25, 26, 27, 28. De aanwezigheid van α-2,6-gekoppelde siaalzuren aan het oppervlak van cellen in de zebravis voorgesteld de gevoeligheid voor IAV, die in infectie studies werd gedragen en afgebeeld in vivo onder toepassing van een fluorescerende reporter stam van IAV 19. In IAV geïnfecteerde zebravis, verhoogde expressie van de antivirale ifnphi1 en MXA transcripten aangegeven dat een aangeboren immuunreactie werd gestimuleerd en de pathologie weergegeven IAV geïnfecteerde zebravis, waaronder oedeem en weefsel, vergelijkbaar met dat voor humaan influenza . Bovendien is de IAV antivirale neuraminidase remmer Zanamivir beperkte mortaliteit en verminderde virale replicatie in de zebravis 19. In dit rapport, een protocol voor het initiëren van het systeemic IAV infecties in de zebravis embryo&#39;s wordt beschreven. Het gebruik van zanamivir bij klinisch relevante doses als een proof-of-principle, is het nut van deze zebravis IAV infectie model voor het screenen van verbindingen voor antivirale activiteit aangetoond. Daarnaast is een protocol voor het genereren van een gelokaliseerde infectie epitheliaal IAV in de zebravis zwemblaas, een orgaan dat wordt beschouwd als anatomisch en functioneel analoog aan het zoogdier longen 21, 29, 30, 31 zijn beschreven. Gebruik van deze gelokaliseerde iav infectiemodel kunnen neutrofiel rekrutering van de plaats van infectie worden gevolgd, zodat onderzoek naar de rol van neutrofielen biologie IAV infecties en ontstekingen. Deze zebravismodellen vult bestaande diermodellen van humane IAV infecties en zijn bijzonder bruikbaar voor het testen van kleine moleculen en immuuncel respons vanwege de mogelijkheid van verhoogde sTATISTISCHE vermogen, vermogen tot matige hoge throughput assays en het vermogen om immuuncellen gedrag en functie volgen met lichtmicroscopie.

<table><tbody><tr><td>Instant Ocean</td><td>Spectrum Brands</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 25 mm steriele wegwerpbare petrischalen&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Overdrachtpijpjes&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatiet glas capillair met filament&nbsp;</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipet aftrekmachine&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Zanamivir</td><td>AK Scientific</td><td>G939</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pincet&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop immersie olie</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop stageschaalbalk&nbsp;</td><td>AmScope</td><td>MR095</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 drukinjector&nbsp;</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscoop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Terugslagventiel</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet houder kit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Voetschakelaar</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Magneetbasis</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic Base</td><td></td></tr><tr><td>Fenol rood&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P-4758</td><td></td></tr><tr><td>Koud temperatuur incubator</td><td>VWR</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V12</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verlichting</td><td>Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Koude lichtbron</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>CL6000 LED</td><td></td></tr><tr><td>Meerkuiplis met glazen bodem, 24 putjes</td><td>Mattek</td><td>P24G-0-13-F</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal systeem</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism v6</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus&nbsp;</td><td>Charles River&nbsp;</td><td>490710</td><td></td></tr><tr><td>Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)&nbsp;</td><td>Charles River&nbsp;</td><td>490715</td><td></td></tr><tr><td>Influenza NS1-GFP</td><td></td><td></td><td>Vernoemd in Manicassamy et al. 2010</td></tr><tr><td>Tg(mpx:mCherry)</td><td></td><td></td><td>Vernoemd in Lam et al. 2013</td></tr></tbody></table>

met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza a-virus infecties op bleken antivirale middelen en karakteriseren host immune cell responses

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Elk jaar hebben seizoensgebonden uitbraken van griep een diepgaande invloed op samenlevingen wereldwijd. Ondanks mondiale inspanningen blijft griep een hardnekkige gezondheidslast. De belangrijkste strategie om infecties te beperken is jaarlijkse vaccinatie. Bij personen die besmet zijn geraakt met griep, kunnen antivirale geneesmiddelen de symptomen verminderen. Er is een duidelijke en onvervulde behoefte om alternatieve strategieën te ontwikkelen om griep te bestrijden. Er zijn verschillende diermodellen gemaakt om de interacties tussen gastheer en griep te modelleren. Hier worden protocollen beschreven voor het genereren van zebravismodellen voor systemische en gelokaliseerde infectie met humaan influenza A-virus (IAV). Met behulp van een systemisch IAV-infectiemodel kunnen kleine moleculen met potentiële antivirale activiteit worden gescreend. Als bewijs van principe wordt een protocol beschreven dat de werkzaamheid van het antivirale middel Zanamivir bij IAV-geïnfecteerde zebravissen aantoont. Het laat zien hoe ziektefenotypen kunnen worden gekwantificeerd om de relatieve werkzaamheid van potentiële antivirale middelen bij IAV-geïnfecteerde zebravissen te scoren. De afgelopen jaren is er een toenemende waardering voor de cruciale rol die neutrofielen spelen in de humane gastheerreactie op griepinfectie. De zebravis heeft zich bewezen als een onmisbaar model voor de studie van de biologie van neutrofielen, met directe gevolgen voor de humane geneeskunde. Er wordt een protocol beschreven om een gelokaliseerde IAV-infectie te genereren in de Tg(mpx:mCherry) zebravislijn om de biologie van neutrofielen in de context van een gelokaliseerde virale infectie te bestuderen. Neutrofiel-rekrutering naar gelokaliseerde infectieplaatsen biedt een aanvullende kwantificeerbare fenotypus voor het beoordelen van experimentele manipulaties die therapeutische toepassingen kunnen hebben. Beide hier beschreven zebravisprotocollen beschrijven getrouw aspecten van humane IAV-infectie. Het zebravismodel bezit talrijke inherente voordelen, waaronder hoge vruchtbaarheid, optische helderheid, geschiktheid voor geneesmiddelenscreening en beschikbaarheid van transgene lijnen, inclusief die waarin immuuncellen zoals neutrofielen zijn gelabeld met fluorescerende eiwitten. De hier beschreven protocollen benutten deze voordelen en hebben het potentieel om kritieke inzichten te onthullen in host-IAV-interacties die uiteindelijk kunnen vertalen naar de klinische praktijk.

Hier elementen waaruit blijkt hoe IAV systemische infectie bij zebravis kan worden gebruikt om de werkzaamheid van geneesmiddelen (Figuur 1A) testen worden voorzien. Embryo&#39;s in 48 uur na de bevruchting zijn geïnjecteerd met APR8 (figuren 1C, 1F), X-31 (figuren 1D, 1G) of NS1-GFP (Figuur 1H-1I) via het kanaal van Cuvier een virale infectie initiëren. Een ander cohort van embryo&#39;s op 48 uur na de bevruchting werde...

Systemische en lokale infectiemodellen met zebravissen voor humaan influenza A-virus worden gedemonstreerd. Met behulp van een systemisch infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om antivirale geneesmiddelen te screenen. Met behulp van een lokaal infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om reacties van gastheer immuuncellen te karakteriseren.

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

De algemene doelstellingen van deze procedures zijn om zebravissen te gebruiken als influenzamodel om de immuunrespons van de gastheer op een virale infectie te bestuderen en om antivirale verbindingen te screenen. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het influenza-onderzoek, zoals de rol die fagocyten spelen bij immuniteit en ontsteking tijdens een infectie en de werkzaamheid van potentiële antivirale therapieën. Een zebravissenmodel voor influenza maakt het mogelijk om voorheen onbeantwoorde vragen aan te pakken vanwege de optische helderheid van ontwikkelende zebravissen en de capaciteit om assays met een medium tot hoge doorvoersnelheid uit te voeren.Nadat de reagentia zijn voorbereid en de embryo's volgens het tekstprotocol zijn gekweekt tot het gewenste stadium, gebruikt u op de dag van het experiment pincet nummer vijf om de embryo's te dechorioneren. Indien de APR-8- of X31-virussen worden gebruikt, verdunt u de virussen in een laminaire flowkast tot een egg infective dose 50 percent van 3,3 × 10⁶ in steriele, ijskoude PBS aangevuld met 0,25% fenolrood. Indien de NS1-GFP-stam wordt gebruikt, verdunt u het virus tot ongeveer 1,5 × 10² PFU per nanoliter.Stel gelijktijdig een controle op met allantoïsvloeistof van niet-geïnfecteerde kippeneieren, verdund op een vergelijkbare wijze als het virus. Pipetteer vervolgens met microloader-tips de virusoplossing in micro-injectienaalden en plaats de micro-injectienaald in de juiste houder van het injectieapparaat. Na het afknippen van de naald volgens het tekstprotocol, worden de druk- en timinginstellingen op de drukinjector aangepast en/of wordt de naaldpunt opnieuw afgeknipt totdat het gewenste injectievolume is bereikt.Na het anesthetiseren van de embryo's gebruikt u een plastic pipet om 10 tot 20 embryo's over te brengen naar een plaat met twee procent agarose en gebruikt u een pipet om overtollige vloeistof te verwijderen. Gebruik onder de stereomicroscoop een vuurgepolijste en afgedichte borosilicaatglazen capillair om de embryo's voorzichtig uit te lijnen en te oriënteren, zodat de ductus Cuvier of de posterieure cardinale vene in lijn ligt met de microinjectienaald. Om de microinjectie van IAV uit te voeren, brengt u de microinjectienaald voorzichtig in de ductus Cuvier of de posterieure cardinale vene.Druk vervolgens op het voetpedaal om het gewenste volume IAV in het circulatiesysteem van het embryo te injecteren. Om een systemische infectie te bewerkstelligen, is het cruciaal dat de injectiebolus wordt opgenomen in de circulatie en over het hele lichaam wordt verspreid. Als de bolus zich verzamelt op de plaats van infectie, dient het embryo uit het experiment te worden verwijderd en te worden geëuthanaseerd.Bereid vijf dagen na bevruchting de naalden voor zoals eerder in deze video beschreven. Lijn de TG MPX mCherry-larven met opgeblazen zwemblazen uit zoals zojuist gedemonstreerd, maar positioneer de larven zodanig dat de naald de zwemblaas kan doorprikken en het virus in het achterste gedeelte van de zwemblaas kan worden afgezet. Steek de micro-injectienaald voorzichtig in de zwemblaas en injecteer het gewenste volume richting het achterste gedeelte van het orgaan.De injectieoplossing moet zich ophopen richting de posterieure zijde en de luchtbel van de zwemblaas moet naar voren worden verplaatst. Om een infectie van de zwemblaas te bewerkstelligen, is het essentieel dat de injectiebolus zich ophoopt aan de posterieure zijde van de zwemblaas, waardoor de luchtbel naar voren wordt geduwd. GFP-expressie zou al vanaf drie uur na de injectie waarneembaar moeten zijn.Nadat de injecties, inclusief die met controle-oplossingen, zijn voltooid, worden de larven overgebracht naar Petrischalen met steriel eitjeswater en worden de vissen geïncubeerd bij 33 °C. Om de behandeling met antivirale geneesmiddelen uit te voeren, wordt drie uur na infectie het eitjeswater van de NS1-GFP en controle-geïnfecteerde vissen vervangen door steriel water met 0, 16,7 of 33,3 ng/mL Zanamivir. Vanaf 24 tot 48 uur na injectie worden observaties genoteerd over de infectiedynamiek in relatie tot de ziektepathologie, waaronder tekenen van lethargie en bewijs van oedeem, verschillen in pigmentatie, oculaire en craniafacialis-misvormingen en lordose.Registreer gedurende vijf dagen na infectie elke 24 uur het aantal dode, ziekelijke en gezonde larven. Zet de gegevens uit in een gestapelde staafgrafiek met de percentages gezonde, ziekelijke of dode vissen op de Y-as en de behandelingsgroep op de x-as. Om zebravissen te monteren voor beeldvorming, brengt u een individuele transgene MPX mCherry-larve die is geïnfecteerd met NS1-GFP over naar een putje van een 24-wells plaat met glazen bodem en een kleine druppel eitjeswater.Herhaal dit bij andere met IAV geïnfecteerde vissen en controle-vissen. Voeg langzaam één procent agarose embryo-montagemedium toe aan elke put, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen grote luchtbellen ontstaan. Pas de positie van de larve voorzichtig aan, zodat elke larve op zijn zij is gemonteerd.Zodra de agarose is gestold, gebruik dan eiwater met 200 micrograms per liter tricaine om de individuele putjes voorzichtig te vullen. Leg met een confocale microscoop en een 20-voudige objectief, gefocust op de zwemblaas, een z-stapelserie van brightfield- en fluorescentiebeelden vast. Kwantificeer en vergelijk het aantal MPX mCherry-positieve neutrofielen in de zwemblazen van IAV-geïnfecteerde en controle-geïnjecteerde zebravissen.Hier worden gegevens weergegeven die illustreren hoe een systemische IAV-infectie bij zebravissen kan worden gebruikt om de effectiviteit van geneesmiddelen te testen. Embryo's van 48 HPF werden via de ductus Cuvier geïnjecteerd met APR8, X31 of NS1-GFP om een virale infectie op te wekken. Embryo's die dienden als controles voor de virale infectie werden op 48 HPF geïnjecteerd.Tegen 48 uur na infectie vertoonden zebravisjes die waren geïnjecteerd met IAV tekenen van pericardiaal oedeem en circulatiestilstand, waarbij erytrocyten in het gehele pericard aanwezig waren. Geïnfecteerde vissen die niet waren blootgesteld aan Zanamivir vertoonden kenmerken van oedeem in de systemische GFP-expressie. Verminderde macroscopische pathologie in de GFP-fluorescentie werd waargenomen bij NS1-GFP-geïnfecteerde larven die waren blootgesteld aan Zanamivir.In dit experiment van een gelokaliseerd zebravis-model voor infectie van de zwemblaas werd NS1-GFP-virus geïnjecteerd in de zwemblazen van transgene MPX mCherry-larven vijf dagen na bevruchting, waarna de rekrutering van mCherry-gelabelde neutrofielen in de zwemblaas werd gevolgd. Op 20 uur na infectie werd een aanzienlijke migratie van neutrofielen naar de zwemblazen van IAV-geïnfecteerde vissen waargenomen ten opzichte van de met PBS geïnjecteerde controles, wat aangeeft dat IAV neutrofielen naar de zwemblaas kan rekruteren, net zoals het neutrofielen naar de menselijke longen rekruteert. De implicaties van deze technieken strekken zich uit tot antivirale therapieën, omdat ze het potentieel hebben om cruciale inzichten te verschaffen in de interacties tussen de gastheer en het influenzavirus A of IAV, die uiteindelijk kunnen worden vertaald naar de klinische praktijk.Vergeet niet dat het werken met influenza extreem gevaarlijk kan zijn; er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure, waaronder vaccinatie en het dragen van de juiste PBM.

using-zebrafish-models-human-influenza-virus-infections-to-screen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we een nieuwe, hoge-inhoud chemisch geinduceerde ontsteking test met het oog op de identificatie van immuun-modulerende bioactieve. We hebben met succes gecombineerd geautomatiseerde microscopie met op maat ontwikkelde software scripts voor directe kwantificering van de ontstekingsreactie en verdere verwerking van gegevens, analyse, mijnbouw, en opslag.

Faciliteren Drug Discovery: een geautomatiseerde high-content Ontsteking Assay in de zebravis

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

Deze video artikel beschrijft de high throughput pijpleiding die is met succes tot infectie en analyseren van grote aantallen zebravis embryo's die een nieuw krachtig hulpmiddel voor beproeving en drug discovery met geheel gewerveld organisme.

Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; En<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infectie als een model voor Drug Discovery

De zebravis is een uitstekend experimenteel organisme om gewervelde ontwikkelingsprocessen en model menselijke ziekten te bestuderen. Hier, een protocol over hoe je een handmatige high-throughput chemische scherm presteren in de zebravis embryo's met een beschrijven we whole-mount in situ hybridisatie (WISH) uitgelezen.

A Manual Small Molecule Screen Naderend High-throughput Met behulp van zebravis embryo&#39;s

In vivo ruimte-tijdelijke interacties van pathogeen en immuunafweer op het mucosale niveau zijn niet gemakkelijk in beeld te brengen in bestaande gewervelde gastheren. De hier gepresenteerde methode beschrijft een veelzijdig platform om mucosale candidiasis bij levende gewervelden te bestuderen door gebruik te maken van de zwemblaas van de juveniele zebravis als een infectieplaats.

Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection

Optisch transparante zebravis embryo's worden veel gebruikt om in realtime de interacties tussen pathogene micro-organismen en de aangeboren immuuncellen te bestuderen en te visualiseren. Micro-injectie van Mycobacterium abscessus, gecombineerd met fluorescentiebeeldvorming, wordt gebruikt om essentiële pathogene kenmerken zoals koordvorming in zebravis embryo's te onderzoeken.

Ontcijferen en Imaging Pathogenese en Cording van<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In zebravis embryo&#39;s

Influenza A virussen (IAVs) zijn belangrijke menselijke respiratoire pathogenen. Om te begrijpen van de pathogeniteit van IAVs en om de preklinische testen van nieuwe vaccin benaderingen, zijn diermodellen nabootsen menselijke fysiologie vereist. Hier beschrijven we technieken om IAV pathogenese, humorale reacties en vaccin werkzaamheid met behulp van een muismodel van infectie te evalueren.

Influenza-A Virus Studies in een muismodel van infectie

Hier presenteren we een protocol voor model menselijke tuberculose in een volwassen zebrafish met behulp van de natuurlijke ziekteverwekker Mycobacterium marinum. Geëxtraheerde DNA en RNA van de inwendige organen van besmette zebrafish kan worden gebruikt om te onthullen dat het totaal mycobacteriële ladingen in de vis en de immuunrespons van de gastheer met qPCR.

Modelleren van tuberculose in Mycobacterium marinum besmet volwassen zebravis

Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Dit protocol beschrijft een Aspergillus infectiemodel in zebravislarven. Aspergillus sporen worden micro-geïnjecteerd in de hindbrain van larven, en chemische behandeling wordt gebruikt om immunosuppressie induceren. Infectieprogressie wordt gecontroleerd via een dagelijkse beeldvormingsopstelling om schimmelgroei en immuunresponsen te monitoren, evenals inventarisatie van levende sporen per kolonievormende eenheidsplating.

Infectie van zebravislarven met Aspergillus-sporen voor analyse van gastheer-pathogene interacties

Leer systemische en gelokaliseerde zebravisinfectiemodellen voor het bestuderen van humaan influenzavirus A. Deze methoden helpen onderzoekers antivirale middelen te screenen en immuunresponsen te karakteriseren.

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses (Video) | JoVE Journal

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

Meer video's verkennen