Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen
26 januari 2017
We beschrijven hier een nieuwe, robuuste en efficiënte tandem affinity-zuivering (TAP) methode voor de expressie, isolatie en karakterisering van eiwitcomplexen uit eukaryote cellen. Dit protocol kan worden gebruikt voor de biochemische karakterisering van discrete complexen, evenals voor de identificatie van nieuwe interactoren en post-translationele modificaties die hun functie reguleren.
Het algemene doel van deze tandem affiniteitszuiveringsmethode is het isoleren van eiwitcomplexen die worden aangemaakt in eukaryote cellen voor biochemische karakterisering en moleculaire assemblages en identificatie van nieuwe interactoren en post-translationele modificaties die hun functie reguleren. Deze methode maakt de zuivering van intacte eiwitcomplexen uit eukaryote cellen mogelijk, om nieuwe interactoren en regulerende post-translationele modificaties te identificeren die hun functie fijnafstemmen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een hoge zuiverheid en opbrengst van eiwitcomplexen mogelijk maakt voor downstream in vitro toepassingen om hun functie en activiteit te bestuderen.
Cellen worden verzameld uit STREP affiniteitszuivering 48 uur na transfectie. Verwijder het medium en voeg acht milliliter koude PBS toe. Pipetteer omhoog en omlaag om de cellen van de plaat te verwijderen.
Verzamel en breng de celsuspensie over in een 15 milliliter buis en centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 800 keer g op vier graden Celsius. Verwijder de PBS-supernatant. Centrifugeer gedurende één minuut bij 800 keer g op vier graden Celsius om eventuele resterende PBS te elimineren.
Om deze procedure te beginnen, resuspendeer elk celpellet in vijf keer het volume van het passieve lysebuffer, of PLB, pellet. Breng de celsuspensie over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Vortex de suspensie kort en nutateer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.
Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 10.000 keer g op vier graden Celsius. Breng het oplosbare lysate over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis en gooi het celpellet weg. Bewaar 10%van het eindvolume van het oplosbare lysate als STREP-AP input en bewaar het bij vier graden Celsius.
Het is belangrijk om STREP kralen te gebruiken voor de eerste affiniteitszuiveringsstap omdat complexen die met STREP kralen zijn gehaald significant meer eiwit herstellen dan die met de FLAG kralen zijn gehaald. Gebruik een breedmondige pipettip om de juiste hoeveelheid 50% STREP kralenslurry voor de affiniteitszuivering te verwijderen. Centrifugeer gedurende twee minuten bij 1.500 keer g op vier graden Celsius.
Verwijder de supernatant en voeg 500 microliter PLB toe aan de kralen. Nutateer de kralensuspensie gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer opnieuw.
Na de derde wasstap verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de kralen in PLB tot een eindvolume van n keer 40 microliter, waarbij n het aantal monsters is. Voeg 40 microliter 50% STREP kralenslurry toe aan elk cellysaatmonster en nutateer gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Tijdens deze eiwitproductie en herstel kunnen meerdere platen cellen worden gebruikt en kunnen dezelfde eiwitmonsters die uit verschillende platen zijn gelyseerd worden gecombineerd met één portie kralen tijdens de STREP affiniteitszuivering.
Nadat het cellysaat en de STREP kralenslurry gedurende twee uur zijn geïncubeerd, centrifugeert u ze gedurende twee minuten bij 1.500 keer g op vier graden Celsius. Bewaar de supernatant als STREP AP doorvloeiing en bewaar het bij vier graden Celsius. Voeg 500 microliter STREP AP wasbuffer een aan de kralen toe.
Nutateer de kralen in buffermengsel gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en centrifugeer gedurende twee minuten bij 1.500 keer g op vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en was opnieuw met 500 microliter STREP AP wasbuffer een. Na de derde wasstap brengt u de kralensuspensie over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis om de eiwitachtergrond te verminderen.
Was een vierde keer met STREP AP wasbuffer een. Na het centrifugeren verwijdert u het supernatant en voegt u 500 microliter wasboter twee toe. Equilibreert u de kralen door de buizen te keren en centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten bij 1.500 keer g op vier graden Celsius.
Gooi de supernatant weg. Elueer het eiwit van belang met 50 microliter STREP elutiebuffer. Vortex gedurende 15 minuten bij 800 rpm bij vier graden Celsius.
Centrifugeer de kralen gedurende één minuut bij 1.500 keer g op vier graden Celsius. Verzamel de supernatant. Deze fractie komt overeen met het STREP AP elutiemonster.
Bewaar de kralenfractie bij vier graden Celsius voor een tweede elutie. Bewaar 10%van de STREP AP elutie voor zilverkleuring en/of Western blotting. Om de hoeveelheid startmateriaal voor de daaropvolgende FLAG immunoprecipitatie te verhogen, kunnen de eerste en tweede STREP eluties worden samengevoegd voor een efficiëntere herstel van de FLAG elutie.
Begin deze procedure door een breedmondige pipettip te gebruiken om de juiste hoeveelheid FLAG kralensuspensie over te brengen naar een microcentrifugebuis. Centrifugeer gedurende twee minuten bij 1.500 keer g op vier graden Celsius. Verwijder de supernatant en voeg 500 microliter FLAG wasbuffer toe aan de kralen.
Centrifugeer gedurende twee minuten bij 1.500 keer g op vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en was opnieuw met FLAG wasbuffer. Na de derde wasstap verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de kralen in FLAG wasbuffer tot een eindvolume van n keer 16 microliter, waarbij n het aantal monsters is.
Voeg 16 microliter van de FLAG kralenslurry toe aan de resterende STREP AP elutie en nutateer gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Na een nachtelijke incubatie van de FLAG kralenslurry en STREP AP elutie, gaat u verder met FLAG immunoprecipitatie. Centrifugeer de FLAG kralensuspensie gedurende twee minuten bij 1.500 keer g op vier graden Celsius.
Bewaar de supernatant als de FLAG IP doorvloeiing en bewaar het bij vier graden Celsius. Voeg 500 microliter FLAG wasbuffer toe aan de kralen. Nutateer gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en centrifugeer gedurende twee minuten bij 1.500 keer g op vier graden Celsius.
Gooi de supernatant weg en was opnieuw met 500 microliter FLAG wasbuffer. Na de derde wasstap brengt u de eiwitkralensuspensie over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis om de achtergrond te verminderen. Was een vierde keer met FLAG wasbuffer.
Ver
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe tandem affinity zuiveringsmethode (TAP) die is ontworpen voor de efficiënte isolatie en karakterisering van eiwitcomplexen uit eukaryotische cellen. De methode maakt de identificatie van nieuwe interactoren en post-translationele modificaties mogelijk die de eiwitfunctie beïnvloeden.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Celbiologie
- Eiwitinteracties
Achtergrond
- Tandem affinity zuivering is een techniek die wordt gebruikt om eiwitcomplexen te isoleren.
- Het begrijpen van eiwitinteracties is cruciaal voor het ophelderen van cellulaire functies.
- Post-translationele modificaties spelen een belangrijke rol bij het reguleren van eiwitactiviteit.
- Deze methode verbetert de zuiverheid en opbrengst van eiwitcomplexen voor verdere analyse.
Doel van de studie
- Om een robuuste TAP-methode te ontwikkelen voor eiwitcomplexisolatie.
- Om biochemische karakterisering van eiwitcomplexen te vergemakkelijken.
- Om nieuwe interactoren en regulerende modificaties te identificeren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van eiwitcomplexen uit eukaryotische cellen.
- Gebruik van STREP affinity zuivering 48 uur na transfectie.
- Toepassing van koud PBS voor celdetachment.
- Downstream in vitro toepassingen voor het bestuderen van eiwitfunctie.
Belangrijkste resultaten
- Hoge zuiverheid en opbrengst van geïsoleerde eiwitcomplexen werden bereikt.
- Identificatie van nieuwe interactoren werd vergemakkelijkt.
- Post-translationele modificaties die de eiwitfunctie reguleren, werden gekarakteriseerd.
- De methode bleek effectief voor biochemische karakterisering.
Conclusies
- De TAP-methode is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van eiwitcomplexen.
- Het maakt de identificatie van belangrijke regulerende interacties mogelijk.
- Deze aanpak kan ons begrip van eiwitfunctie en -activiteit verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Tandem affinity purification (TAP) using STREP- and FLAG-tagged proteins enables high-purity isolation of eukaryotic protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method facilitates identification of novel interactors and post-translational modifications, improving predictive confidence in protein function and complex assembly. This approach reduces biological ambiguity in target selection and supports scalable workflows for lead identification and preclinical characterization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating intact protein complexes from eukaryotic cells for functional characterization.
- Operational Value: Supports biological de-risking through high-yield purification of complexes containing transiently expressed regulatory subunits.
- Predictive Value: Enhances target confidence by enabling detection of co-purifying interactors and regulatory modifications via mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated eukaryotic protein complexes for downstream biochemical assays measuring enzymatic activity or binding kinetics.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible isolation of complexes with defined subunit composition and modification status.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple targets by combining lysates from different cell plates during STREP bead incubation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes disease-relevant protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic components, enabling mechanistic insight into host-pathogen interactions.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating complexes suitable for structural and functional studies.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying novel regulatory subunits and post-translational modifications that fine-tune complex function.
Pipeline & Workflow Integration
The TAP method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling biochemical characterization of protein complexes prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating complexes to identify novel interactors and regulatory post-translational modifications.
- Screening: Enables assay readiness by producing purified complexes suitable for in vitro activity and binding assays.
- Analytics: Generates quantitative outputs via mass spectrometry and Western blot analysis to compare complex composition under different conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by characterizing complexes from eukaryotic or pathogenic systems for mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple targets, as the same STREP and FLAG bead workflow can be applied across different epitope-tagged constructs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and identification of novel regulatory mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of protein complex isolation across multiple experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through improved target validation, capital efficiency in early discovery, and reduced late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on validated complex composition and modification status.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, eukaryotic cell culture, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation equipment, microcentrifuge tubes, and STREP and FLAG affinity resins.
- Necessitates cross-team standardization of tag placement, lysis buffer composition, and wash stringency for reproducible results.
- Requires adaptation considerations when applying to different eukaryotic cell lines or pathogenic protein expression systems.
- Practical limitation: Efficiency depends on transfection efficiency and expression levels of epitope-tagged constructs in eukaryotic cells.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Collecting the Cells
1:39
Lysing the Cells
6:01
Equilibrating the FLAG Beads
2:32
Equilibrating the STREP Beads
3:56
STREP Affinity Purification (AP)
7:04
FLAG Immunoprecipitation (IP)
8:39
Results: A Cyclin-CDK Complex is Successfully Purified by Tandem Affinity Purification (TAP)
10:26
Conclusion
