Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

Het algemene doel van deze tandem-affiniteitszuiveringsmethode is het isoleren van eiwitcomplexen die tot expressie zijn gebracht in eukaryote cellen voor biochemische karakterisering en moleculaire assemblage, evenals de identificatie van nieuwe interactoren en posttranslationele modificaties die hun functie reguleren. Deze methode maakt de zuivering van intacte eiwitcomplexen uit eukaryote cellen mogelijk, om zo nieuwe interactoren en regulerende posttranslationele modificaties te identificeren die hun functie nauwkeurig afstemmen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze een hoge zuiverheid en opbrengst van eiwitcomplexen mogelijk maakt voor downstream in vitro toepassingen om hun functie en activiteit te bestuderen.

Cellen worden verzameld via STREP-affiniteitzuivering 48 uur na transfectie. Verwijder het medium en voeg acht milliliter koude PBS toe. Pipetteer herhaaldelijk op en neer om de cellen van de plaat los te maken.

Verzamel de celsuspensie en breng deze over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer de cellen bij 800 ×g gedurende vier minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het PBS-supernatans. Centrifugeer opnieuw bij 800 ×g gedurende één minuut bij vier graden Celsius om eventueel resterend PBS te elimineren.

Om deze procedure te starten, resuspendeert u elk celpellet in vijf keer het volume van het celpellet aan passieve lysisbuffer, of PLB. Draag de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Vortex de suspensie kort en laat deze 30 minuten nutateren bij vier graden Celsius.

Centrifugeer de celsuspensie 10 minuten bij 10.000 ×g bij vier graden Celsius. Breng het oplosbare lysaat over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en verwijder de celpellet. Bewaar 10% van het uiteindelijke volume van het oplosbare lysaat als STREP-AP input bij vier graden Celsius.

Het is belangrijk om STREP-beads te gebruiken voor de eerste affiniteitszuiveringsstap, omdat complexen die met STREP-beads zijn neergeslagen aanzienlijk meer eiwit opleveren dan complexen die met FLAG-beads zijn neergeslagen. Verwijder met een pipetpunt met een brede opening de juiste hoeveelheid 50% STREP-bead slurry voor de affiniteitszuivering. Centrifugeer 2 minuten bij 1.500 ×g bij vier graden Celsius.

Verwijder het supernatant en voeg 500 microliters PLB toe aan de beads. Nutate het beadmengsel gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer opnieuw.

Verwijder na de derde wasbeurt het supernatant en resuspendeer de beads in PLB tot een eindvolume van n keer 40 microliters, waarbij n het aantal monsters is. Voeg 40 microliters 50% STREP bead-slurry toe aan elk cellysaatmonster en laat dit twee uur nuteren bij vier graden Celsius. Tijdens deze eiwitproductie en -terugwinning kunnen meerdere platen cellen worden gebruikt, en dezelfde eiwitmonsters uit verschillende platen kunnen worden gecombineerd met één portie beads tijdens de STREP-affiniteitszuivering.

Nadat de mengsels van cellysaat en STREP-bead slurry twee uur hebben geïncubeerd, worden deze gecentrifugeerd bij 1 500 ×g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Bewaar het supernatant als STREP AP flow-through en bewaar dit bij vier graden Celsius. Voeg 500 µL STREP AP wasbuffer één toe aan de beads.

Laat de kralen vijf minuten lang nuteren in het buffermengsel bij 4 °C en centrifugeer 2 minuten bij 1.500 ×g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en was opnieuw met 500 µL STREP AP wasbuffer één. Na de derde wasbeurt wordt de kraaloplossing overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 mL om de eiwitachtergrond te verminderen.

Was een vierde maal met STREP AP wasbuffer één. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en voeg 500 µL wasbuffer twee toe. Equilibreer de beads door de buisjes om te keren en centrifugeer vervolgens 2 minuten bij 1.500 ×g bij 4 °C.

Verwijder het supernatant. Elueer het eiwit van belang met 50 µL STREP-elutiebuffer. Vortex bij 800 rpm gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.

Centrifugeer de korrels 1 minuut bij 1.500 ×g bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant. Deze fractie komt overeen met het STREP AP elutie-monster.

Bewaar de fractie kralen bij vier graden Celsius voor een tweede elutie. Verdeel 10% van de STREP AP-elutie in aliquoten voor zilverkleuring en/of Western blotting. Om de hoeveelheid startmateriaal voor de daaropvolgende FLAG-immunoprecipitatie te verhogen, kunnen de eerste en tweede STREP-eluties worden samengevoegd voor een efficiënter herstel van de FLAG-elutie.

Begin deze procedure door met een pipetpunt met een brede opening de juiste hoeveelheid FLAG-beadoplossing over te brengen naar een microcentrifugebuis. Centrifugeer 2 minuten bij 1.500 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en voeg 500 µL FLAG-wasbuffer toe aan de beads.

Centrifuge 2 minuten bij 1.500 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en was opnieuw met FLAG-wasbuffer. Verwijder na de derde wasbeurt het supernatant en resuspendeer de beads in FLAG-wasbuffer tot een eindvolume van n × 16 µL, waarbij n het aantal monsters is.

Voeg 16 µL van de FLAG-bead slurry toe aan het resterende STREP AP-eluaat en laat dit een nacht nutateren bij 4 °C. Ga na de overnacht-incubatie van de FLAG-bead slurry en het STREP AP-eluaat verder met de FLAG-immunoprecipitatie. Centrifugeer de FLAG-bead suspensie bij 1.500 ×g gedurende twee minuten bij 4 °C.

Bewaar het supernatant als de FLAG IP flow-through en bewaar dit bij vier graden Celsius. Voeg 500 microliters FLAG-wasbuffer toe aan de beads. Nutate gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en centrifugeer 2 minuten bij 1.500 ×g bij vier graden Celsius.

Verwijder de supernatant en was opnieuw met 500 µL FLAG-wasbuffer. Na de derde wasbeurt wordt de proteïne-bead-oplossing overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 mL om de achtergrondruis te verminderen. Was een vierde maal met FLAG-wasbuffer.

Verwijder het supernatant na de laatste centrifugeerstap en voeg 30 µL FLAG-wasbuffer toe aan de beads, met een concentratie van 200 ng/µL FLAG-peptide. Vortex gedurende twee uur bij 800 rpm bij 4 °C. Centrifugeer de suspensie na twee uur vervolgens 2 minuten bij 1.500 ×g bij 4 °C.

Oogst het supernatant en bewaar dit bij vier graden Celsius als de FLAG IP-elutie. In deze video werd de tandem-affiniteitszuivering, of TAP-methode, toegepast op het Cyclin-T1 CDK9-complex. STREP-getagde Cyclin-T1 en FLAG-getagde CKD9 werden overexpressief gemaakt in HEK293 T-cellen.

Er werd ook een reciproque experiment uitgevoerd met STREP-getagde CDK9 en FLAG-getagde Cycline-T1. Western blot-analyse laat zien dat FLAG-getagde CKD9 co-elueerde met STREP-getagde Cycline-T1 van de STREP-beads, maar niet in de negatieve controle, AP zonder STREP-getagde Cycline-T1. Beide eiwitten werden gedetecteerd in de FLAG-elutie, wat de vorming van het complex verder bevestigde.

De resultaten van de reciproke TAP tonen aan dat FLAG-gelabeld Cyclin-T1 co-elueerde met STREP-gelabeld CDK9, wat verder valideert dat de interactie tussen Cyclin-T1 en CDK9 onafhankelijk is van de gebruikte epitopen. De resultaten van de TAP en de reciproke TAP werden daarnaast geanalyseerd via zilverkleuring. De asterisken geven co-eluerende onzuiverheden aan.

FLAG-gelabeld CDK9 co-eluteerde met STREP-gelabeld Cycline-T1 van de STREP-beads, maar niet van de controle AP. In de daaropvolgende FLAG-elutie co-eluteerde STREP-gelabeld Cycline-T1 met FLAG-gelabeld CDK9 van de FLAG-beads. Op dezelfde wijze co-eluteerde FLAG-gelabeld Cycline-T1 met STREP-gelabeld CDK9 van de STREP-beads, maar niet van de controle AP. En het eiwit-eiwitcomplex werd efficiënt teruggewonnen na de tweede FLAG-IP-stap. Zodra de techniek beheerst is, kan deze in twee dagen worden uitgevoerd, beginnend wanneer de cellen klaar zijn om te worden geoogst, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het aantal celplaten per experiment dienovereenkomstig moet worden verhoogd om ervoor te zorgen dat er voldoende eiwit kan worden teruggewonnen en gedetecteerd. Denk hierbij aan het identificeren van nieuwe regulatoire subeenheden en/of het bestuderen van post-translationele modificaties op complex-subeenheden. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers die eiwit-eiwitinteracties bestuderen om nieuwe interactoren en post-translationele modificaties in eukaryote cellen te verkennen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u eiwitten kunt isoleren en karakteriseren met behulp van STREP- en FLAG-tags.