Name: Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Leer tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen uit eukaryote cellen met hoge zuiverheid en opbrengst. Deze methode identificeert nieuwe interactiepartners en post-translatiemodificaties voor biochemische karakterisering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) van de NIH onder beursnummer R01AI114362 en Welch Foundation-subsidie I-1782 aan Iván D'Orso.

1. Plating Cellen <ol><li> Eén dag voor transfectie, plaat 3,5 x 10 6 HEK293T-cellen in 10 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1% (v / v) penicilline / streptomycine (10.000 U / ml voorraad) per 100 mm schaal. Plate 3-5 schalen van 100 mm per experiment / voorwaarde om voldoende eiwit herstel te bewerkstelligen. Opmerking: Het aantal platen moet worden bepaald voor elk experiment / conditie, die zal afhangen van de expressieniveaus en de oplosbaarheid van het eiwitcomplex plaats. Als alternatief, als grootschalige zuivering nodig, cellijnen kunnen worden aangepast aan groei in suspensie in spinner flessen 2, maar deze methode werkt niet voor transiënte transfecties. </li></ol> 2. cellen te transfecteren of induceren stabiele cellijnen <ol><li> Op de volgende dag, controleer dan de cellen onder de microscoop. 80% confluent voordat proce - cellen moeten 70 zijnEding. </li><li> Transfecteren van de cellen met een totaal mengsel van 7 ug plasmide DNA en 21 pl transfectiereagens per 100 mm schaal. Transfecteren van cellen met een vector die GFP (Tabel 1) als controle voor transfectie-efficiëntie. OPMERKING: Bij gebruik van een HEK293-T-Rex en dergelijke stabiele cellijn die de expressie van twee of meer complexe subeenheden in reactie op doxycycline 14, 15 induceert, zal de inductor moeten de cellen worden toegevoegd en gedurende 48 uur. Evenzo zou een stabiele cellijn die de expressie van GFP na toevoeging van de inductor induceert eveneens vereist voor validatiedoeleinden. Ga verder met stap 2.7. </li><li> Bereid de transfectie mengsel per 100 mm schaal. In een 1,5 ml microcentrifugebuis, meng 500 pi DMEM niet aangevulde met 7 ug totaal plasmide DNA (corresponderend met twee of meer plasmiden). In een aparte microcentrifugebuis, meng 500 pi unsupplemented DMEM wie 21 ui van het transfectiereagens. Herhaal dit voor elke transfectie reactie. </li><li> Pipetteer de transfectiereagens oplossing in de plasmide-DNA-oplossing (niet oplossingen in omgekeerde volgorde door elkaar). Meng door pipetteren minstens 4 keer. </li><li> Incubeer dit mengsel bij kamertemperatuur gedurende 10 - 15 minuten, maar niet langer dan 15 min. </li><li> Kantel de plaat naar een media-reservoir te creëren en voorzichtig pipet de transfectie mengsel druppelsgewijs op de binnenkant van de plaat zonder verstoring van de cellen. Zet de schotel naar zijn oorspronkelijke vlakke stand en schud zachtjes aan het mengsel te verdelen. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde celkweek incubator met 5% CO 2 (deze toestand wordt hierna &quot;weefselkweek incubator&quot;). Vervang de media 5 uur na transfectie (optioneel). </li></ol> 3. Controle Transfectie of Inductie Efficiency <ol><li> Op 24 uur na transfectie werden de cellen te visualiseren onder een grieporescent microscoop om te controleren op transfectie-efficiëntie (of inductie van controle HEK293T-Rex stabiele cellijn die GFP). Incubeer nog eens 24 uur. </li></ol> 4. STREP Affinity Purification (STREP AP) <ol><li> Verzamelen van de cellen <ol><li> Op 48 uur na transfectie, verwijder de kaart en voeg 8 ml koude 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Pipet op en neer om cellen los te maken van de plaat. </li><li> Verzamelen en breng de celsuspensie in een 15 ml buis en spin de cellen neer op 800 xg gedurende 4 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant PBS. Herhaal de spin neer (800 xg gedurende 1 min bij 4 ° C) PBS om resten te elimineren. Bewaar de cel pellet bij -80 ° C voor toekomstig gebruik of volg de onderstaande procedure om eiwitzuivering blijven. </li></ol></li><li> Lyseren van de cellen <ol><li> Resuspendeer de cel pellets met behulp van 5 x het volume celpellet (~ 250 ul per plaat) van Passive Lysis Buffer(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, proteaseremmer cocktail tablet, 5% v / v glycerol en 1,0% NP-40) en breng de celsuspensie een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Kort vortex de suspensie en nutate gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Spin down de celsuspensie bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Breng de oplosbare lysaten in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en gooi de celpellets. 10% van het eindvolume van het oplosbare lysaat als &quot;STREP AP Input&quot;. Bewaren bij 4 ° C. </li></ol></li><li> In evenwicht brengen van de STREP kralen LET OP: Gebruik STREP parels voor de eerste AP stap! Complexen naar beneden getrokken met STREP kralen te herstellen aanzienlijk meer eiwitten dan die naar beneden getrokken met FLAG kralen. <ol><li> Zetten (n × 40 pl) + n gl van 50% STREP kraal slurry (n = aantal monsters) en spin neer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. OPMERKING: Gebruik wide-mouthed tips om pipet kralen. </li><li> Verwijder de supernatant en voeg 500 ul van PLB aan de korrels. Nutate de korrels mengsel gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Spin down bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. <ol><li> Herhaal dit voor een totaal van 3 wassingen. Resuspendeer de kralen in PLB tot een eindvolume van 40 pi n x. </li></ol></li><li> Voeg 40 ul van 50% STREP kraal suspensie aan elk cellysaat monster en nutate gedurende 2 uur bij 4 ° C. </li></ol></li><li> STREP AP <ol><li> Spin down oplossing bij 1500 g gedurende 2 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de supernatant en opslaan als &quot;STREP AP doorstroming (FT)&quot; bij 4 ° C. </li><li> Voeg 500 gl STREP AP wasbuffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glycerol en 0,2% NP-40) aan de korrels. Nutate de korrels mengsel gedurende 5 minuten bij 4 ° C en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. <ol><li> Herhaal dit voor een totaal van 4 wasbeurten. <br/&gt; NB: Voor de vierde spoeling, breng de kralenoplossing een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis aan het eiwit achtergrond te verminderen. Deze stap is essentieel. </li></ol></li><li> Voeg 500 ul wasbuffer II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl en 1 mM EDTA) en equilibreren de kralen door het omkeren van de buizen. Spin down op 1500 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C en gooi de supernatant. </li><li> Elueer het eiwit van interesse met 50 ui STREP elutiebuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA en 2,5 mM desthiobiotine). Vortex bij 800 rpm gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Spin down de kralen aan 1500 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof. Dit gedeelte komt overeen met de &quot;AP STREP elutie&quot; sample. </li><li> Sparen de fractie kralen bij 4 ° C voor een tweede elutie, die zou kunnen opleveren om de helft van de hoeveelheid eiwit verkregen met de eerste elutie. Aliquot 10% van de STREP AP Elution voor zilverkleuring en / of Western blotting16. </li></ol></li><li> In evenwicht brengen van de FLAG kralen <ol><li> Neem (nx 16 ul) + n ul van FLAG kralen oplossing (n = aantal monsters) en spin neer op 1500 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C. OPMERKING: Gebruik brede mond tips om pipet kralen. </li><li> Verwijder de supernatant en voeg 500 ul van FLAG wasbuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0,1% NP-40) aan de korrels. Spin down bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Herhaal dit voor een totaal van 3 wassingen. </li><li> Resuspendeer de kralen in FLAG wasbuffer tot een eindvolume van 16 pl nx. </li><li> Voeg 16 ul van de FLAG kraal slurry de resterende STREP AP elutie nutate en overnacht bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5. FLAG IP <ol><li> Spin down de FLAG parels suspensie bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Bewaar het supernatant en opslaan als &quot;FLAG IP flow-through&quot; (FT) bij 4 ° C. </li><li> Voeg 50081, l van FLAG wasbuffer aan de oplossing. Nutate gedurende 5 minuten bij 4 ° C en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Herhaal dit voor een totaal van 4 wast en verwijder het supernatant na elke wasbeurt. Opmerking: Voor de vierde spoeling, overdracht van de proteïne-kralenoplossing een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis om de achtergrond te verminderen. Deze stap is essentieel. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof uit de laatste spin en voeg 30 ul van FLAG wasbuffer die 200 ng / ul van FLAG-peptide in de kralen. Vortex bij 800 rpm gedurende 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Spin down de suspensie bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Oogst de supernatant en bewaar bij 4 ° C als de &quot;FLAG IP Elution.&quot; OPMERKING: De elutie monsters kunnen worden bevestigd door zilverkleuring en / of Western blot met behulp van standaard protocollen 16 en zijn klaar voor verdere eiwitassays. Bij het opzetten van een western blot, draaien alle van de volgende monsters: (1) STREP AP Input, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutiop, (4) FLAG IP FT, en (5) FLAG IP Elutie. Volumes geladen moeten worden bepaald voor elk experiment. Alle verzamelde monsters en korrels kunnen voor kortstondige opslag en bij -80 ° C voor langdurige opslag worden bewaard bij 4 ° C. TAP monsters kunnen worden geanalyseerd met massaspectrometrie om de identiteit van de onderdelen controleren op nieuwe post-translationele modificaties (PTM) identificeren en / of voor een nieuw eiwit interactie met het gezuiverde complex 2, 17 ontdekken. Daartoe na het uitvoeren van een Coomassie gel of zilverkleuring, banden kan worden uitgesneden uit de gel met een schone scalpel. Diverse uitstekende recensies die massaspectrometrie methoden te bespreken werden eerder gepubliceerd 18, 19. </li></ol>

<ol><li>Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+prediction+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Network-based prediction of protein function.</a> Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of HIV-human protein complexes.</a> Nature. 481, 365-370 (2012).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+two-hybrid+system%3A+a+complementary+approach+to+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system.</a> Biotechniques. 22, 350-352 (1997).</li>
<li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coimmunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Coimmunoprecipitation assay.</a> Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of HIV-human protein complexes.</a> Methods. 53, 13-19 (2011).</li>
<li>Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-TEFb%2C+a+cyclin-dependent+kinase+controlling+elongation+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II.</a> Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).</li>
<li>Peterlin, B. M., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+elongation+phase+of+transcription+with+P-TEFb%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb.</a> Mol Cell. 23, 297-305 (2006).</li>
<li>McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+mediate+the+enzymatic+disassembly+of+promoter-bound+7SK+snRNP+to+locally+recruit+P-TEFb+for+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation.</a> Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((7SKiing+on+chromatin%3A+move+globally%2C+act+locally%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">7SKiing on chromatin: move globally, act locally.</a> RNA Biol. 13, 545-553 (2016).</li>
<li>McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Elongation+Control+by+the+7SK+snRNP+Complex%3A+Releasing+the+Pause%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause.</a> Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).</li>
<li>Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline+repressor%2C+tetR%2C+rather+than+the+tetR-mammalian+cell+transcription+factor+fusion+derivatives%2C+regulates+inducible+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells.</a> Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).</li>
<li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+Recruitment+of+the+7SK+snRNP+Complex+to+Promoters+Enables+Transcription+Elongation+by+RNA+Polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II.</a> Mol Cell. 61, 39-53 (2016).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).</li>
<li>Trudgian, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+label-free+SINQ+normalized+spectral+index+quantitation+in+the+central+proteomics+facilities+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline.</a> Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).</li>
<li>Choudhary, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+signalling+networks+by+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).</li>
<li>Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+and+network+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics and network biology.</a> Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).</li>
<li>Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequences+common+to+rapidly+degraded+proteins%3A+the+PEST+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis.</a> Science. 234, 364-368 (1986).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven voor de expressie en isolatie van eiwitcomplexen van eukaryote cellen protocol is niet beperkt tot de biochemische eigenschappen van deze moleculaire samenstellingen, maar kan ook worden gebruikt voor de identificatie van nieuwe interactorenen post-translationele modificaties die de functie kan regelen. Het gebruik van affiniteitsmerkers is niet beperkt tot hetgeen vermeld in dit protocol; maar onze ervaring leert dat het gebruik STREP als eerste AP stap verbetert aanzienlijk de opbrengst van het uite...

<html> Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn cruciaal voor de nauwkeurige regeling van biologische processen 1, en bestudeerd deze IPP kan informeren over de functie 2. Verscheidene benaderingen zijn ontwikkeld voor het karakteriseren van protonpompremmers en voor de de novo identificatie van nieuwe regulerende eiwitcomponenten. In 1989, Stanley Velden en collega&#39;s meldde de gist-twee-hybride (Y2H) test 3. Deze aanpak maakt het mogelijk om onpartijdige en uitgebreide identificatie van interactoren (prooien) voor een bepaald eiwit van belang (aas) in Saccharomyces cerevisiae. Naast de opmerkelijke bruikbaarheid voor het ontdekken PPI kan de Y2H assay worden gebruikt voor het karakteriseren van eiwitten paren in gistcellen, definiëren minimale interactie domeinen en identificeren van mutaties die dergelijke interacties te heffen. Door wijziging van de Y2H assay kan IPP eveneens bestudeerd in zoogdiercellenclass = &quot;xref&quot;&gt; 4. Variaties van de Y2H assay (bijvoorbeeld gist drie-hybride systeem) kan ook worden toegepast om te bestuderen eiwit-RNA en eiwit-kleine organische ligand interacties in cellen. Een andere veel gebruikte hulpmiddel PPI studeren in een homoloog systeem is de co-immunoprecipitatie (co-IP) test 5. Door een antilichaam tegen een eiwit van belang immunoprecipitatie, co-IP assay kunnen onderzoekers PPI in cellen van verschillende omgevingsomstandigheden en experimentele het oog. Het gebruik van epitoop-gemerkte eiwitten (bijvoorbeeld FLAG, Myc, STREP en HA oa) in affiniteitszuivering (AP) methoden is de isolatie van eiwitten uit complexe eiwitmengsels meerdere downstream assays, zoals Western blot vergemakkelijkt zilverkleuring en enzymatische analyses. Geen van deze eerdere benaderingen maken de isolatie van grote hoeveelheden eiwitcomplexen voor verdere karakterisering zoals in vitro eenssays, ontdekking van regulatorische subeenheden door massaspectrometrie en identificatie van post-translationele modificaties. Een verbeterde versie van de AP methode heet Tandem AP (TAP), een zuiveringstechniek voor het bestuderen PPI door een fusie-eiwit met twee epitopen die wordt gezuiverd door middel van twee opeenvolgende APs 6, 7. In dit artikel presenteren we een variant TAP methode voor het zuiveren van eiwit complexen waarin twee subeenheden worden gelabeld met verschillende epitopen en vervolgens door middel van twee opeenvolgende APs (STREP AP gevolgd door FLAG IP). Eerst geven we een minimalistische overzicht van TAP (figuur 1) en vervolgens een gedetailleerde beschrijving van de experimentele stappen (figuur 2), zodat onderzoekers ze kunnen toepassen op hun eiwitcomplex plaats. Om de toepasbaarheid van de TAP methode te tonen, kozen we voor een goed gekarakteriseerd cycline-CDK complex (aangeduid als PTEFB kinase), dat uit de regulerende subeenheid cycline T1 (CycT1) en een kinase (CDK9) en is betrokken bij de regulatie van de transcriptie door RNA polymerase II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforyleert het C-terminale domein van Pol II en de bijbehorende negatieve verlengingsfactoren, die transcriptionele pauzeren verlicht de promotor en vergemakkelijkt daardoor transcriptie elongatie 11, 12, 13. Bij deze bekende interactie in het achterhoofd, STREP-tag CycT1 en-FLAG tag CDK9 waren meer dan uitgedrukt in HEK293T cellen. Een wederzijdse TAP experiment werd uitgevoerd met STREP tag CDK9 en FLAG-tag CycT1 verder bevestigen dat het eiwit interactie is onafhankelijk van het gebruikte epitopen. Cellen werden verzameld en gelyseerd 48 uur na transfectie. Het oplosbare lysaat werd gezuiverd door middel van TAP (STREP AP gevolgd door FLAGIK P). Input en gezuiverde eiwitten werden geanalyseerd met western blot en zilverkleuring (Figuur 3).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>STREP-tag elutie buffer</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm &times; 20 mm stijl celkweekschotel behandeld nonpyrogen polystyreen 20/sleeve</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>48 gats microbuis schuimrek</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Labquake shaker rotisserie&nbsp;</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>415110</td><td></td></tr></tbody></table>

tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

De zuivering van actief eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur-complexen is cruciaal voor de karakterisering van enzymatische activiteiten en de novo identificatie van nieuwe subeenheden en post-translationele modificaties. Bacteriële systemen zorgen voor de expressie en zuivering van diverse interne polypeptiden en eiwitcomplexen. Echter, dit systeem de zuivering van eiwit subeenheden die post-translationele modificaties (bijvoorbeeld fosforylatie en acetylatie) bevatten, en de identificatie van nieuwe regulerende subeenheden die alleen aanwezig zijn / expressie in eukaryote systeem mogelijk. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van een nieuw, robuuste en efficiënte werkwijze tandem affiniteitszuivering (TAP) middels Strep- en FLAG-gemerkte eiwitten die de zuivering van eiwitcomplexen maakt met transiënt of stabiel tot expressie epitoop-gemerkte eiwitten van eukaryote cellen. Dit protocol kan worden toegepast op prot karakteriserenein complexe functionaliteit, post-translationele modificaties op complexe subeenheden ontdekken en op nieuwe regulerende complexe componenten identificeren met massaspectrometrie. Met name kan dit TAP toegelicht voor eiwitcomplexen gevormd door eukaryote of pathogene (viraal en bacterieel) componenten bestuderen, hetgeen aldus een breed scala aan downstream experimentele mogelijkheden. Wij stellen onderzoekers met eiwitcomplexen deze benadering op verschillende manieren kunnen gebruiken.

In dit artikel tonen we de toepassing van de TAP methode om de goed gekarakteriseerde CycT1 CDK9-complex (ook bekend als P-TEFb kinase). Plasmiden die Cycline T1-STREP (CycT1: S) en CDK9-FLAG (CDK9: F) of CDK9-STREP (CDK9: S) en cycline T1-FLAG (CycT1: F) (Tabel 1) werden getransfecteerd in HEK293T-cellen . Negatieve controles opgenomen transfecties met een lege vector en CDK9: F of CycT1: F plasmiden ...

We beschrijven hier een nieuwe, robuuste en efficiënte tandem affinity-zuivering (TAP) methode voor de expressie, isolatie en karakterisering van eiwitcomplexen uit eukaryote cellen. Dit protocol kan worden gebruikt voor de biochemische karakterisering van discrete complexen, evenals voor de identificatie van nieuwe interactoren en post-translationele modificaties die hun functie reguleren.

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Het algemene doel van deze tandem-affiniteitszuiveringsmethode is het isoleren van eiwitcomplexen die tot expressie zijn gebracht in eukaryote cellen voor biochemische karakterisering en moleculaire assemblage, evenals de identificatie van nieuwe interactoren en posttranslationele modificaties die hun functie reguleren. Deze methode maakt de zuivering van intacte eiwitcomplexen uit eukaryote cellen mogelijk, om zo nieuwe interactoren en regulerende posttranslationele modificaties te identificeren die hun functie nauwkeurig afstemmen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze een hoge zuiverheid en opbrengst van eiwitcomplexen mogelijk maakt voor downstream in vitro toepassingen om hun functie en activiteit te bestuderen.Cellen worden verzameld via STREP-affiniteitzuivering 48 uur na transfectie. Verwijder het medium en voeg acht milliliter koude PBS toe. Pipetteer herhaaldelijk op en neer om de cellen van de plaat los te maken.Verzamel de celsuspensie en breng deze over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer de cellen bij 800 ×g gedurende vier minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het PBS-supernatans. Centrifugeer opnieuw bij 800 ×g gedurende één minuut bij vier graden Celsius om eventueel resterend PBS te elimineren.Om deze procedure te starten, resuspendeert u elk celpellet in vijf keer het volume van het celpellet aan passieve lysisbuffer, of PLB. Draag de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Vortex de suspensie kort en laat deze 30 minuten nutateren bij vier graden Celsius.Centrifugeer de celsuspensie 10 minuten bij 10.000 ×g bij vier graden Celsius. Breng het oplosbare lysaat over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en verwijder de celpellet. Bewaar 10% van het uiteindelijke volume van het oplosbare lysaat als STREP-AP input bij vier graden Celsius.Het is belangrijk om STREP-beads te gebruiken voor de eerste affiniteitszuiveringsstap, omdat complexen die met STREP-beads zijn neergeslagen aanzienlijk meer eiwit opleveren dan complexen die met FLAG-beads zijn neergeslagen. Verwijder met een pipetpunt met een brede opening de juiste hoeveelheid 50% STREP-bead slurry voor de affiniteitszuivering. Centrifugeer 2 minuten bij 1.500 ×g bij vier graden Celsius.Verwijder het supernatant en voeg 500 microliters PLB toe aan de beads. Nutate het beadmengsel gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer opnieuw.Verwijder na de derde wasbeurt het supernatant en resuspendeer de beads in PLB tot een eindvolume van n keer 40 microliters, waarbij n het aantal monsters is. Voeg 40 microliters 50% STREP bead-slurry toe aan elk cellysaatmonster en laat dit twee uur nuteren bij vier graden Celsius. Tijdens deze eiwitproductie en -terugwinning kunnen meerdere platen cellen worden gebruikt, en dezelfde eiwitmonsters uit verschillende platen kunnen worden gecombineerd met één portie beads tijdens de STREP-affiniteitszuivering.Nadat de mengsels van cellysaat en STREP-bead slurry twee uur hebben geïncubeerd, worden deze gecentrifugeerd bij 1 500 ×g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Bewaar het supernatant als STREP AP flow-through en bewaar dit bij vier graden Celsius. Voeg 500 µL STREP AP wasbuffer één toe aan de beads.Laat de kralen vijf minuten lang nuteren in het buffermengsel bij 4 °C en centrifugeer 2 minuten bij 1.500 ×g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en was opnieuw met 500 µL STREP AP wasbuffer één. Na de derde wasbeurt wordt de kraaloplossing overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 mL om de eiwitachtergrond te verminderen.Was een vierde maal met STREP AP wasbuffer één. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en voeg 500 µL wasbuffer twee toe. Equilibreer de beads door de buisjes om te keren en centrifugeer vervolgens 2 minuten bij 1.500 ×g bij 4 °C.Verwijder het supernatant. Elueer het eiwit van belang met 50 µL STREP-elutiebuffer. Vortex bij 800 rpm gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Centrifugeer de korrels 1 minuut bij 1.500 ×g bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant. Deze fractie komt overeen met het STREP AP elutie-monster.Bewaar de fractie kralen bij vier graden Celsius voor een tweede elutie. Verdeel 10% van de STREP AP-elutie in aliquoten voor zilverkleuring en/of Western blotting. Om de hoeveelheid startmateriaal voor de daaropvolgende FLAG-immunoprecipitatie te verhogen, kunnen de eerste en tweede STREP-eluties worden samengevoegd voor een efficiënter herstel van de FLAG-elutie.Begin deze procedure door met een pipetpunt met een brede opening de juiste hoeveelheid FLAG-beadoplossing over te brengen naar een microcentrifugebuis. Centrifugeer 2 minuten bij 1.500 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en voeg 500 µL FLAG-wasbuffer toe aan de beads.Centrifuge 2 minuten bij 1.500 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en was opnieuw met FLAG-wasbuffer. Verwijder na de derde wasbeurt het supernatant en resuspendeer de beads in FLAG-wasbuffer tot een eindvolume van n × 16 µL, waarbij n het aantal monsters is.Voeg 16 µL van de FLAG-bead slurry toe aan het resterende STREP AP-eluaat en laat dit een nacht nutateren bij 4 °C. Ga na de overnacht-incubatie van de FLAG-bead slurry en het STREP AP-eluaat verder met de FLAG-immunoprecipitatie. Centrifugeer de FLAG-bead suspensie bij 1.500 ×g gedurende twee minuten bij 4 °C.Bewaar het supernatant als de FLAG IP flow-through en bewaar dit bij vier graden Celsius. Voeg 500 microliters FLAG-wasbuffer toe aan de beads. Nutate gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en centrifugeer 2 minuten bij 1.500 ×g bij vier graden Celsius.Verwijder de supernatant en was opnieuw met 500 µL FLAG-wasbuffer. Na de derde wasbeurt wordt de proteïne-bead-oplossing overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 mL om de achtergrondruis te verminderen. Was een vierde maal met FLAG-wasbuffer.Verwijder het supernatant na de laatste centrifugeerstap en voeg 30 µL FLAG-wasbuffer toe aan de beads, met een concentratie van 200 ng/µL FLAG-peptide. Vortex gedurende twee uur bij 800 rpm bij 4 °C. Centrifugeer de suspensie na twee uur vervolgens 2 minuten bij 1.500 ×g bij 4 °C.Oogst het supernatant en bewaar dit bij vier graden Celsius als de FLAG IP-elutie. In deze video werd de tandem-affiniteitszuivering, of TAP-methode, toegepast op het Cyclin-T1 CDK9-complex. STREP-getagde Cyclin-T1 en FLAG-getagde CKD9 werden overexpressief gemaakt in HEK293 T-cellen.Er werd ook een reciproque experiment uitgevoerd met STREP-getagde CDK9 en FLAG-getagde Cycline-T1. Western blot-analyse laat zien dat FLAG-getagde CKD9 co-elueerde met STREP-getagde Cycline-T1 van de STREP-beads, maar niet in de negatieve controle, AP zonder STREP-getagde Cycline-T1. Beide eiwitten werden gedetecteerd in de FLAG-elutie, wat de vorming van het complex verder bevestigde.De resultaten van de reciproke TAP tonen aan dat FLAG-gelabeld Cyclin-T1 co-elueerde met STREP-gelabeld CDK9, wat verder valideert dat de interactie tussen Cyclin-T1 en CDK9 onafhankelijk is van de gebruikte epitopen. De resultaten van de TAP en de reciproke TAP werden daarnaast geanalyseerd via zilverkleuring. De asterisken geven co-eluerende onzuiverheden aan.FLAG-gelabeld CDK9 co-eluteerde met STREP-gelabeld Cycline-T1 van de STREP-beads, maar niet van de controle AP. In de daaropvolgende FLAG-elutie co-eluteerde STREP-gelabeld Cycline-T1 met FLAG-gelabeld CDK9 van de FLAG-beads. Op dezelfde wijze co-eluteerde FLAG-gelabeld Cycline-T1 met STREP-gelabeld CDK9 van de STREP-beads, maar niet van de controle AP. En het eiwit-eiwitcomplex werd efficiënt teruggewonnen na de tweede FLAG-IP-stap. Zodra de techniek beheerst is, kan deze in twee dagen worden uitgevoerd, beginnend wanneer de cellen klaar zijn om te worden geoogst, mits deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het aantal celplaten per experiment dienovereenkomstig moet worden verhoogd om ervoor te zorgen dat er voldoende eiwit kan worden teruggewonnen en gedetecteerd. Denk hierbij aan het identificeren van nieuwe regulatoire subeenheden en/of het bestuderen van post-translationele modificaties op complex-subeenheden. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers die eiwit-eiwitinteracties bestuderen om nieuwe interactoren en post-translationele modificaties in eukaryote cellen te verkennen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u eiwitten kunt isoleren en karakteriseren met behulp van STREP- en FLAG-tags.

tandem-affinity-purification-protein-complexes-from-eukaryotic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Tandem Affinity Purification is een robuuste aanpak voor de identificatie van eiwitbinding partners. Als proof of concept, werd deze methode toegepast op de goed gekarakteriseerde translatie initiatie factor eIF4E van co-neerslag de gastheercel factoren die betrokken zijn in de vertaling initiatie. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan een cellulair of viraal eiwit.

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

This video demonstrates tandem affinity purification — a technique to purify protein complexes from eukaryotic cells to study protein-protein interaction. The complex contains two proteins labeled with different epitope tags. Upon the purification of the complex using two resins with an affinity for the two different tags in a sequential manner, the presence of both proteins in the elute confirms the interaction between the two.

Tandem Affinity Purification Assay to Study Protein-Protein Interactions

Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Drosophila is beroemd om zijn krachtige genetische manipulatie, maar niet voor de geschiktheid van diepgaande biochemische analyse. Hier presenteren wij een-TAP gebaseerde procedure tot interactie partners van een eiwit van belang te identificeren van de vlieg hersenen. Deze procedure kan mogelijk leiden tot nieuwe wegen van onderzoek.

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP)

De Tandem Affinity Purification (TAP) methode is veel gebruikt om native complexen te isoleren uit cellulaire extracten, voornamelijk eukaryotisch, voor proteomics. Hier presenteren we een TAP-methodeprotocol dat is geoptimaliseerd voor de zuivering van native complexen voor structurele studies.

Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

Hier beschrijven we protocollen bij zoogdiercellen door solid-state frezen verstoren bij een cryogene temperatuur, produceren een cel uittreksel uit de resulterende cel poeder, en te isoleren eiwitcomplexen van rente door affiniteitsinvangmiddel upon-antilichaam gekoppeld micron-schaal paramagnetische kralen.

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Hier presenteren we een bewezen en geteste protocol voor de zuivering van chloroplast importeren eiwitcomplexen (TOC-TIC complex) met behulp van de TAP-tag. Het protocol van de verwantschap-isolatie one-step potentieel kan worden toegepast op elke proteïne en worden gebruikt om nieuwe interactie partners door massaspectrometrie.

Affiniteit zuivering van Chloroplast Translocon eiwitcomplexen met behulp van de Tag van de TAP

Dit artikel biedt een procedure voor de affiniteitszuivering van een humaan recombinant eiwit, flap endonuclease 1 (FEN1), dat is gelabeld met een 6X-histidine-tag. Het protocol omvat het gebruik van twee afzonderlijke geïmmobiliseerde metaalionkolommen voor de zuivering van het gelabelde eiwit.

Affiniteitszuivering van een 6X-His-gelabeld eiwit met behulp van een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem 

Leer tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen uit eukaryote cellen met hoge zuiverheid en opbrengst. Deze methode identificeert nieuwe interactiepartners en post-translatiemodificaties voor biochemische karakterisering.

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

Meer video's verkennen