Name: Snelle verwijdering Productie in Fungi via Agrobacterium Gemedieerde Transformatie van OSCAR Deletion Constructs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Leer de OSCAR-methode voor snelle verwijdering van genen in schimmels via Agrobacterium-gemedieerde transformatie. Deze techniek versnelt functioneel genetisch onderzoek naar ziekteverwekkende mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken de volgende leerlingen van de lagere en middelbare school voor hun werk om OSCAR mutanten te genereren in Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Ashley Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O&#39;Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre&#39;Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le en Angel Pham.

1. Primerontwerp voor PCR-versterking van genflanken <ol><li> Download naar een tekstverwerkingsbestand de genomische regio van het gen van belang (GOI) inclusief het open leesframe (ORF) en tenminste 2 kb flankeren het gen aan elke kant van FungiDB of andere genomische gegevensbron. </li><li> Markeer de ORF die is bedoeld voor het verwijderen en etiketten starten en stoppen met codons. </li><li> Identificeer en markeer aangrenzende ORF&#39;s binnen de gedownloade volgorde. </li><li> Gebruik het 2 kb 5&#39;-uiteinde van de GOI ORF en het primer-ontwerpgereedschap (zie Materialenlijst) om PCR-primerpaar O1 en O2 te ontwerpen om een ​​minimumformaat van 1 kb te genereren. Zorg ervoor dat u geen naburige ORF&#39;s hebt. <ol><li> Plak de 2 kb 5 &#39;flank in het venster&#39; Sequence Entry &#39;. Klik op het vak &#39;Aangepaste parameters weergeven&#39;. Voer de volgende aangepaste ontwerpparameters in: Primer TM 58 (min), 60 (opt) en 62 (max); Primer GC 40 (min), 50 (opt) en 60 (max); Primer Maat 22 (min), 24 (opt) en 26(Max); Amplicon Grootte 1250 (min), 1500 (opt) en 2000 (max). </li><li> Kies het resultaat dat de omgekeerde primer (O2) dichtst bij de ORF plaatst. Vang een schermafbeelding van de analyses en kopieer en plak de primersequenties in het tekstverwerkingsdocument. </li><li> Herhaal het proces voor 3&#39;-flank om primers O3 en O4 te genereren, kies dit keer het resultaat waarbij de voorwaartse primer (O3) dichtst bij het doel ORF staat. </li></ol></li><li> Voeg passende plaatsen toe aan 5&#39;-einden van primers 1 tot en met 4 (zie tabel 1 ). </li><li> Ook ontwerpen en bestellen ORF-specifieke primers die gebruikt worden voor verwijderingsbevestiging in sectie 4 hieronder. Parameters moeten hetzelfde zijn als in stap 1.4.1, behalve als u Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) en 1000 (max) gebruikt voor aanpassing van de lengte ORF. Ten slotte, voor het bevestigen van homologe recombinanten, genereren 5 &#39;out en 3&#39; out primers die net buiten de flanken binnen het chromosoom zijn gevonden. Deze &quot;out&quot; primers worden gebruikt bijHygR (210) en hygF (850) respectievelijk ( fig. 2 ). </li><li> Bestel primers. </li></ol> 2. Productie van OSCAR Constructs <ol><li> Met behulp van een HiQ- Taq, voer twee reacties uit, één voor de 5&#39;- en 3&#39;-flanken, met behulp van primers (100 μM) O1 en O2 in één reactie en primers O3 en O4 in de tweede. Reactiemengsel bevat het volgende: 29,5 μL steriel gedistilleerd water (SDW), 5 μl 10x LA PCR buffer, 8 μl 2,5 mM dNTP-mix, 5 μl 25 mM MgCl2, 1 μl template (50 ng / μl), 0,5 μl hi- Fidelity Taq , 0,5 μL Primer O1 en 0,5 μL Primer O2 voor 5&#39;-flank (of 0,5 μL Primer O3 en 0,5 μL Primer O4 voor 3&#39;-flank) De reactieomstandigheden zijn als volgt: 94 ° C gedurende 1 minuut, dan 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 s, 60 ° C gedurende 30 minuten, 72 ° C gedurende 2 minuten, dan de laatste stappen van 72 ° C gedurende 5 minuten en dan onbepaald bij 10 ° C vasthouden. </li><li> Looppas 0,8%Agarose 1x TAE (40 mM Tris acetaat pH 8,3, 1 mM EDTA) gelelektroforese voor ongeveer 125 Vh in een standaard minigel apparaat om productgrootte en relatieve concentratie te bepalen. Plaats de gel op met non-ethidium vlek volgens de instructies van de fabrikant. Visualiseer op een UV-verlichting. </li><li> Als 5&#39;- en 3&#39;-flankproducten ongeveer gelijk zijn aan concentratie, combineer ze ze en gebruik een affiniteitskolom kit (of PEG neerslag 90 μL gecombineerde PCR producten, 240 μl TE buffer pH 7,5, 160 μl 30% polyethyleenglycol PEG8000 30 mM MgCl 2 ) de PCR-producten co-zuiveren volgens het protocol van de fabrikant. Als ze niet van gelijke concentratie zijn, combineer alle lage concentratieproducten met een geschatte gelijke hoeveelheid product uit de hogere opbrengstreactie. </li><li> Gebruik een spectrofotometer om de gezuiverde DNA-concentratie te meten. </li><li> BP-reactie uitvoeren door het volgende te mengen: 1 μL 60 ng / μl pOSCAR, 2 μL 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL van 60 ng / μL gecombineerde flanken, 1 μl clonase. Incubeer gedurende 16 uur bij 25 ° C. Beëindig de reactie door 0,5 μl eiwitase K toe te voegen en gedurende 10 minuten bij 37 ° C te incuberen. </li><li> Transformeer hoge competentie E. Coli cellen. Zowel commercieel beschikbare bevoegde cellen als huishoudelijke DH5a CaCl2 bevoegde cellen werden succesvol gebruikt als ontvangers zoals beschreven door de instructies van de fabrikant. Plaat op laag natrium (0,5 g / L NaCl) LB bevattende 100 μg / ml spectinomycine (Spec). </li><li> Identificeer het juiste construct door DNA miniprepen 10 van de hierboven gevormde kolonies uit te voeren. Doe dubbele spijsvertering met Hin dIII en Kpn I als volgt: pipet 5 μL DNA, 2 U van elk enzym, 2 μL geschikte 10x buffer met SDW tot een 20 μL totaal volume. Hierdoor wordt de insert (ongeveer 4,5 kb met 1,5 kb genflanken) van de vector vrijgegeven ( ongeveer 7 kb) en snijdt alle sites inFlanken die voorspelbare bandgroottes kunnen geven. </li><li> Sequence 11 selecteert klonen die een passend bandpatroon tonen. </li></ol> 3. Agrobacterium tumefaciens Gemedieerde Transformatie (ATMT) van Fungi <ol><li> Transformeer Agrobacterium tumefaciens stam AGL1 met OSCAR deletie construct 12 . </li><li> Transformeerzwam met AGL1 die het GOI OSCAR deletieplasmide bevat. Doe hiervoor de volgende stappen: <ol><li> Bereid een schimmelsporeuspensie met steriel water bij 2 x 10 6 sporen / ml op. Sporen op een hemocytometer of geautomatiseerde celteller kwantificeren. Plaats 500 μL hiervan in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Deze set-up is voor 4 transformatieplaten. </li><li> Gebruik een blauwe steriele wegwerplus om een ​​gemakkelijk zichtbare gobbe te maken (dient ongeveer 20% van de lusdiameter te bedekken) van het verwijderingsplasmide dat AGL1 bevat van 2-3 dagen oud LB-Spec 100 medium (zie MAterials Lijst voor samenstelling) met platen en mengen in de spore suspensie. Vortex tot bacteriële cellen zijn goed gedispergeerd ( ongeveer 5 minuten gemiddelde snelheid). </li><li> Pipette 100 μL van de conidia-Agro suspensie op het midden van een cellulosemembraanfilter geplaatst op elk van vier 6 cm Petrischalen die co-cultivatiemedium bevatten 12 . </li><li> Spread de suspensie met steriele glaskralen (ongeveer 4) om het hele oppervlak van het membraanfilter te bedekken. Alternatief verdeel de vering met behulp van een traditioneel verdeelgereedschap. Laat het membraanfilter gedurende ongeveer 10 minuten in een kap drogen, wikkel met paraffinefilm. Herhaal stappen 3.2.2 en 3.2.3 om meerdere transformaties op te zetten. </li><li> Incubeer de plaat gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur, omgekeerd. </li><li> Breng het membraanfilter over op 6 cm Aspergillus selectiemedium 12 platen die hygromycine B (Hyg) bevatten 150 μg / ml, 200 mM cefotaxime en 100 μg / mlmoxalactam. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5-7 dagen voor het isoleren van Hyg-resistente kolonies. </li><li> Met steriele tandstokjes, zet vermeende transformanten over op 6 cm Aardappel Dextrose Agar (PDA) platen die 150 μg / mL Hyg, 100 μg / ml kanamycine bevatten. </li></ol></li></ol> 4. Verwijderen mutantidentificatie door PCR <ol><li> Extract DNA voor PCR uit transformanten door thermolyse 13 . <ol><li> Zodra transformanten colonies op de PDA uit stap 3.2.7 vormen, gebruik dan een steriele tandstok om een ​​kleine hoeveelheid (2 mm x 2 mm) mycelium of gistcellen van de kolonie in 100 μl lysisoplossing (50 mM natriumfosfaat, pH 7,4, 1 mM EDTA, 5% glycerol) in een microcentrifugebuis. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 20-30 minuten bij 85-90 ° C. Bewaar het ruwe extract dat genomisch DNA bevat bij -20 ° C tot gebruik in stap 4.2. </li></ol></li><li> Voer 4 PCR reacties per transformant uit, één elk tot dHomologe recombinatie van respectievelijk de 5 &#39;en 3&#39; flanken eteren voor de selecteerbare marker (hygromycine fosfotransferase in dit geval) en een voor de GOI ORF. OPMERKING: We gebruiken doorgaans goedkope low-accuracy Taq voor deze reacties. Reactie condities zijn zoals beschreven in stap 2.1 hierboven en bevatten SDW 20 μl, 10x Taq buffer 2,5 μL, dNTPS (10 mM) 0,5 μl, zelfgemaakte Taq 14 , 0,5 μl, Primer A (100 μM) 0,5 μl, Primer B (100 μM ) 0,5 μl, sjabloon 0,5 μl. Lagere concentratie primer voorraden (10 μM) kunnen even goed gebruikt worden. </li><li> Doe een agarosegel ( bv. 0,8%) van de PCR-producten. Deletiemutanten produceren de Hyg-band maar niet een ORF-product. Ektopische integanten zullen beide bands tonen. Wildtype zal alleen de ORF-band produceren. </li><li> Bewaar deletiemutanten permanent (en een ectopische transformant of twee voor controles) voor toekomstig gebruik. OPMERKING: 15% glycerol wordt gebruikt om sOnze stammen op lange termijn bij -80 ° C gescheurd. </li></ol>

<ol><li>Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+construction+of+Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids+%28OSCAR%29%2C+an+efficient+and+robust+tool+for+ATMT+based+gene+deletion+construction+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi.</a> Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Klosterman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+yields+insights+into+niche+adaptation+of+plant+vascular+wilt+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens.</a> PLoS Pathog. 7 (7), (2011).</li>
<li>Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+knockout+in+the+maize+pathogen+Setosphaeria+turcica+using+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation.</a> Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+disruption+methodology+for+the+entomopathogenic+fungus+Metarhizium+robertsii%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii.</a> PloS One. 9 (9), (2014).</li>
<li>Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUBT%2C+a+putative+MFS+transporter%2C+promotes+secretion+of+fusaric+acid+in+the+cotton+pathogen+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+vasinfectum%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum.</a> Microbiology. 161, 875-883 (2015).</li>
<li>Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s13213-015-1055-8">High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora.</a> Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).</li>
<li>Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetic+Screen+for+Pathogenicity+Genes+in+the+Hemibiotrophic+Fungus+Colletotrichum+higginsianum+Identifies+the+Plasma+Membrane+Proton+Pump+Pma2+Required+for+Host+Penetration%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration.</a> PloS One. 10 (5), e0125960(2015).</li>
<li>Chettri, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Regulation+of+dothistromin+toxin+biosyn+by+the+pine+needle+pathogen+Dothistroma+septosporum%3A+a++presented+in+the+partial+fulfilment+of+the+requirements+for+the+degree+of+Doctor+of+Philosophy+%28%29+in+Genetics+at+Massey+University%2C+Manawatu%2C+New+Zealand%22">Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand </a>. , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).</li>
<li>Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-prep+in+ten+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mini-prep in ten minutes.</a> Biotechniques. 8 (2), 172(1990).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+SciUSA%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhang%2C+CH+%22Agrobacterium+Protocols%22">Agrobacterium Protocols</a>. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).</li>
<li>Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+genomic+DNA+extraction+suitable+for+analysis+of+bulk+fungal+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains.</a> Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).</li>
<li>Pluthero, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+high-activity+Taq+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).</li>
<li>McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCluskey%2C+K+%22Gene+Expression+Systems+in+Fungi%3A+Advancements+and+Applications%22">Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications</a>. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een stapconstructie van Agrobacterium -Recombinatie-ready-plasmiden (OSCAR) is met succes toegepast bij een steeds groter aantal Ascomycota-schimmels. De methode zou ook gemakkelijk van toepassing kunnen zijn op de Basidiomycota en soorten van andere schimmelfyla (met geschikte promotoren die selecteerbare merkergenen aandrijven), waarbij Agrobacterium gemedieerde transformatie en homologe recombinatie mogelijk zijn. Er zijn extra markeringsvectoren gegenereerd om keuzes van anti-schimmelverbindingen t...

Genetische dissectie is een krachtige methodologie voor het bepalen van het functionele belang van individu of combinaties van genen. Een standaardbenadering om de rol van specifieke genen te begrijpen is de productie van enkele genmutanten ongewijzigd in elk ander gen. De meest krachtige en minst potentiële confounding benadering is compleet en precies deletie van het open lezingsgedeelte van een gen van interesse (GOI ORF) zonder schade aan een andere genfunctie. Omdat standaardligatiebenaderingen voor het verwijderen van plasmide-generatie meerdere stappen vereisen, zou de rationele voor OSCAR 1 een snellere in vitro- aanpak produceren. Figuur 1 toont het assemblageproces in de OSCAR-aanpak. De hier beschreven werkwijze heeft het voordeel van het combineren van snelle constructie van individuele gendeletievectoren in een enkele multipartreactie in combinatie met daaropvolgende Agrobacterium tumefaciens gemedieerde transfoRmation (ATMT). OSCAR is zeer snel en vergelijkt goed met andere strategieën, zoals het gebruik van Gibson assemblage in gist 2 . De OSCAR-methode is succesvol gebruikt bij verscheidene Ascomycota soorten schimmels. Deze soorten omvatten: Fusarium verticillioides (ongepubliceerd), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 en Dothistroma septosporum 9 en Sarocladium zeae (ongepubliceerd) . Dit protocol geeft stap-voor-stap instructie voor de methode inclusief primerontwerp, flank-PCR-amplificatie, de OSCAR BP-reactie, de bevestiging van de verwijdering van constructstructuur, transformatieIonen van Agrobacterium met het construct gevolgd door ATMT-gebaseerde overdracht van het deletieconstruct in de schimmelcellen en uiteindelijk differentiëren van schimmeldeletiemutanten van die met ectopisch geïntegreerde deletieconstructen.

<table><tbody><tr><td>FungiDB</td><td></td><td></td><td>Database/ http://fungidb.org/fungidb/</td></tr><tr><td>IDT PrimerQuest</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td></tr><tr><td>Microsoft Word</td><td></td><td></td><td>Sequence file manipulation</td></tr><tr><td>Low Na LB Spec 100 medium</td><td></td><td></td><td>E. coli transformant selectie, samenstelling: 1% tryptone, 0,05% NaCl, 0,5% gistextract, 1,5% agar voor vast medium</td></tr><tr><td>Co-cultivatiemedium</td><td></td><td></td><td>ATMT transformatie-inductie (Referentie 12)</td></tr><tr><td>Aspergillus minimaal medium met Hygromycine</td><td></td><td></td><td>Selectie van schimmeltransformant</td></tr><tr><td>PDA-medium</td><td>Acumedia</td><td>7149A</td><td>Single spore slantbuisjes</td></tr><tr><td>PDA-Hyg-Kan medium</td><td></td><td></td><td>Isolatie van schimmeltransformant, PDA bevattend 150 μg/mL hygromycine B en 100 μg/mL Kanamycine</td></tr><tr><td>Glazen kralen</td><td>Genlantis</td><td>C400100</td><td>Verspreiding op een plaat</td></tr><tr><td>Nitrocellulosefilters (47 mm)</td><td>Fisher</td><td>09-719-555</td><td>Co-cultiveren voor ATMT</td></tr><tr><td>Verschillende centrifugebuizen</td><td></td><td></td><td>Meerdere preparaten</td></tr><tr><td>Petri-schotel (diverse)</td><td></td><td></td><td>Kweek van bacteriën en schimmels</td></tr><tr><td>pA-Hyg OSCAR</td><td>Addgene</td><td>29640</td><td>Selecteerbare marker vector</td></tr><tr><td>pOSCAR</td><td>Addgene</td><td>29639</td><td>Assembly vector</td></tr><tr><td>DH5α One Shot Competent E. colicellen</td><td>Life Technologies</td><td>12297-016</td><td>BP reactie transformatie</td></tr><tr><td>ccdB overleving E. coli cellen</td><td>Life Technologies</td><td>A10460</td><td>Onderhoud van pOSCAR</td></tr><tr><td>Houtsen transfersticks</td><td></td><td></td><td>Streken van kolonies</td></tr><tr><td>Tandenstokers</td><td></td><td></td><td>Koloniaal plukken</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td>Pelleting van bacteriën, etc.</td></tr><tr><td>Preparatieve centrifuge</td><td></td><td></td><td>Verzameling van schimmelsporen</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td></td><td></td><td>Isolatie van enkele sporen</td></tr><tr><td>Automatische celteller</td><td></td><td></td><td>Berekening van sporessuspensie</td></tr><tr><td>Compoundmicroscoop</td><td></td><td></td><td>Hemocytometer celtelling</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Zuivering van PCR-genflank product</td></tr><tr><td>TaKaRa LA Taq</td><td>Takara Bio USA</td><td>RR002A</td><td>Hi Fidelity taqpolymerase voor OSCAR flank generatie</td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-5</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycine</td><td>Sigma</td><td>22189-32-8</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime</td><td>TCI America</td><td>C2224</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td></td><td>11815032</td><td></td></tr><tr><td>Moxalactam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43963</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>Postkleuring agarose gels</td></tr><tr><td>Qiagen QIAquick PCR-zuiveringskit (Cat. Nr. 28104)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(OneShot_ Mach1TM T1R of One Shot_ OmniMAX&trade; 2 T1R van Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C862003</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzymmix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>Gebruikt voor het assembleren van deletieconstructie in pOSAR</td></tr></tbody></table>

snelle verwijdering productie in fungi via<em&gt; agrobacterium</em&gt; gemedieerde transformatie van oscar deletion constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Een nauwkeurige deletie van genen die van belang zijn, terwijl de rest van het genoom onveranderd wordt, biedt het ideale product om de functie van het bepaalde gen in het levende organisme te bepalen. In dit protocol wordt de OSCAR methode beschreven voor nauwkeurige en snelle deletie plasmide constructie. OSCAR berust op het kloningssysteem waarin een enkele recombinase-reactie wordt uitgevoerd die de gezuiverde PCR-geamplificeerde 5 &#39;en 3&#39; flanken van het gen van belang en twee plasmiden, pA-Hyg OSCAR (de markervector) en pOSCAR bevat vector). Bevestiging van de correct samengestelde deletievector wordt uitgevoerd door middel van restrictie-digestie-mapping, gevolgd door sequencing. Agrobacterium tumefaciens wordt dan gebruikt om de introductie van het deletieconstruct in schimmelsporen te bemiddelen (aangeduid als ATMT). Tenslotte wordt een PCR-analyse beschreven om te bepalen of het deletieconstruct geïntegreerd is door homologe of niet-homologe recombinatie, welke gendeletie ofEctopische integratie, respectievelijk. Deze aanpak is succesvol gebruikt voor de verwijdering van talrijke genen in Verticillium dahliae en in Fusarium verticillioides onder andere soorten.

De OSCAR methode, in een enkele reactie, genereert een plasmide dat de flanken van het doelgen bevat dat verwijderd wordt rond de selecteerbare markeringskassette. De productie van verwijderingsconstructies met behulp van OSCAR is zeer efficiënt. Het systeem kan echter gedeeltelijke constructen produceren die sommige maar niet alle drie fragmenten bevatten (de twee genflanken en de selecteerbare marker). Over het algemeen bevatten de meeste E. coli transformanten het juiste OSCA...

Gen deletie mutanten gegenereerd door homologe recombinatie zijn de gouden standaard voor genfunctie studies. De OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) methode voor snelle generatie van deletieconstructen wordt beschreven. Agrobacterium gemedieerde schimmel transformatie volgt. Tenslotte wordt een PCR-gebaseerde bevestigingsmethode van gendeleties in zwamtransformanten gepresenteerd.

Snelle verwijdering Productie in Fungi via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Gemedieerde Transformatie van OSCAR Deletion Constructs

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van nauwkeurige gen-deletiemutanten in schimmels. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de functionele genetica van schimmels, zoals welke rol een specifiek gen van belang speelt in het vermogen van een schimmel om ziekten te veroorzaken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de zeer snelle constructie van plasmiden voor het genereren van nauwkeurige deleties mogelijk maakt.Deze methode kan inzicht bieden in elke schimmel die over een effectief homologe recombinatiesysteem beschikt. Het kan potentieel ook worden toegepast op andere systemen, zoals protisten of wormcellen. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode bij de ontwikkeling van het DelsGate-systeem, dat verwant is aan Oscar, maar wordt gebruikt voor protoplasttransformatie in plaats van via agrobacterium.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien er een aantal geoptimaliseerde of niet-intuïtieve stappen zijn. De procedure wordt gedemonstreerd door Nicole Crenshaw, een technicus van My Laboratory. Deze strategie voor het ontwerpen van primers vereist de genomische regio van het gen van belang, inclusief het open leesraam en ten minste twee kilobase flankerende sequenties aan weerszijden van het gen, in een tekstverwerkingsbestand.Begin met het markeren van het open leesraam dat bedoeld is voor deletie, en label de start- en stopcodons. Identificeer en markeer de aangrenzende open leesramen binnen de gedownloade sequentie. Gebruik vervolgens een tool voor primerontwerp om PCR-primers te ontwerpen voor de 5'-flanken van het open leesraam van het gen van belang.Gebruik de twee kilobasen stroomopwaarts van het open leesraam van het gen van belang om het PCR-primerpaar O1 en O2 te ontwerpen, zodat een product van minimaal één kilobase wordt gegenereerd. Kies het resultaat waarbij de reverse primer O2 het dichtst bij het open leesraam is geplaatst. Zorg ervoor dat het aangrenzende open leesraam niet wordt beïnvloed.Maak een screenshot van de assays en kopieer en plak de primersequenties in het tekstverwerkingsdocument. Nadat dit proces is herhaald voor de drie prime flanks om de primers O3 en O4 te genereren, voegt u geschikte aanhechtingsplaatsen toe aan de vijf primanden van alle vier de primers. Ontwerp tot slot primers die gebruikt kunnen worden voor de bevestiging van de deletie en de bevestiging van homologe recombinatie, volgens de instructies in het tekstprotocol.Begin deze procedure door twee PCR-reacties op te zetten: één voor de 5'-flank en één voor de 3'-flank. Voeg het volgende toe aan beide reactiemengsels: 29,5 µL steriel gedestilleerd water, 5 µL 10x LA PCR-buffer, 8 µL 2,5 mM dNTP-mix, 5 µL 25 mM magnesiumchloride, 1 µL template en 0,5 µL high-fidelity Taq. Voeg aan de reactie voor de 5'-flank 0,5 µL Primer O1 en 0,5 µL Primer O2 toe. Voeg aan de reactie voor de 3'-flank 0,5 µL Primer O3 en 0,5 µL Primer O4 toe. Voer de PCR uit met de volgende reactiecondities: 94 °C gedurende één minuut, gevolgd door 30 cycli van 94 °C gedurende 30 seconden, 60 °C gedurende 30 seconden en 72 °C gedurende twee minuten, met een laatste stap van 72 °C gedurende vijf minuten, waarna het mengsel onbeperkt op 10 °C wordt bewaard.Om de productgrootte en relatieve concentratie te bepalen, wordt er elektroforese uitgevoerd op de PCR-producten op een 0,8% agar gel in 1x TLE gedurende ongeveer 125 voltuur in een standaard mini-gelapparaat. Kleur de gel achteraf met een niet-ethidiumkleurstof volgens de instructies van de fabrikant en visualiseer deze op een UV-illuminator. Als de 5'- en 3'-flanken in ongeveer gelijke concentraties aanwezig zijn, kunnen deze worden gecombineerd.Als ze niet dezelfde concentratie hebben, combineer het product met de lage concentratie dan met een geschatte gelijke hoeveelheid product uit de reactie met de hogere opbrengst. Gebruik een infinity column kit om de PCR-producten gezamenlijk te zuiveren volgens het protocol van de fabrikant. Voer vervolgens de BP-clonase-reactie uit door het volgende te mengen: 1 µL van de assembly vector, 2 µL van de marker vector, 1 µL van de gecombineerde flanks en 1 µL clonase.Incubeer gedurende 16 uur bij 25 °C. Beëindig de reactie door 0,5 µL proteinase-K toe te voegen en 10 minuten te incuberen bij 37 °C. Nadat de E.coli-cellen zijn getransformeerd met de BP-reactie en het DNA is geïsoleerd zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het juiste construct geïdentificeerd door een dubbele digestie uit te voeren met Hindiii 3 en KPN 1.Na identificatie van het OSCAR-deletieconstruct via double-digest sequencing wordt het construct getransformeerd in agrobacterium tumefaciens stam AGL1. De volgende stap is het transformeren van schimmels met AGL1 die het OSCAR-deletieconstruct bevat. Begin met het bereiden van een schimmelsporensuspensie met steriel water met een concentratie van 2 × 10⁶ sporen per milliliter.Nadat de sporen zijn verdund, brengt u 500 µL van de schimmelsporen-suspensie over in een microcentrifugebuisje van 1,5 mL. Gebruik een blauwe steriele wegwerplus om een duidelijk zichtbaar klompje van het deletieplasmid dat AGL1 bevat aan de sporen-suspensie toe te voegen. Vortex tot de bacteriële cellen goed zijn verspreid.Plaats een cellulosemembraanfilter in elk van de vier petrischalen van zes centimeter die co-cultivatie medium bevatten en voeg vervolgens ongeveer vier steriele glasperlen per schaal toe. Pipetteer 100 µL van de conidia agra-suspensie op het midden van elk membraanfilter en verspreid de suspensie met de kralen zodat het gehele oppervlak van het membraanfilter bedekt is. Nadat de kralen zijn verwijderd, laat u de membraanfilters ongeveer tien minuten drogen in de zuurkast en wikkel vervolgens de petrischalen in paraffinefolie.Keer de schalen om en incubeer ze gedurende twee dagen bij kamertemperatuur. Na twee dagen wordt elk membraanfilter overgebracht naar een selectieve mediumplaat met asper-gel van zes centimeter die Hygromycin B en kanamycin bevat. Incubeer gedurende vijf tot acht dagen bij kamertemperatuur.Om Hygromycine-resistente kolonies te isoleren, worden steriele tandenstokers gebruikt om vermeende transformanten over te brengen naar aardappel-dextrose-agarplaten van zes centimeter die Hygromycine en kanamycin bevatten. Incubeer de platen bij kamertemperatuur. Zodra de transformanten kolonies vormen op de platen, wordt een steriele tandenstoker gebruikt om een kleine hoeveelheid mycelium of gistcellen van de kolonie over te brengen naar 100 µL lysisoplossing in een microcentrifugebuis.Incubeer het mengsel bij 85 tot 90 °C gedurende 20 tot 30 minuten. Bewaar het ruwe extract met genomisch DNA bij -20 °C tot de PCR wordt uitgevoerd. Om deletiemutanten te identificeren, wordt eerst een PCR uitgevoerd om het open reading frame van het gen van belang en de selecteerbare marker voor elke transformant aan te tonen.Gebruik dezelfde reactiecondities voor de productie van de OSCAR-constructen. Herhaal na isolatie van enkele sporen en thermische lyse de PCR voor het open leesraam en Hygromycine, evenals de PCR voor het detecteren van homologe recombinatie van de 5'- en 3'-flanken. Voer vervolgens een agarosegel-elektroforese uit met de PCR-producten.De OSCAR-methode genereert een plasmide dat het selecteerbare markergen bevat, geflankeerd door de flankerende sequenties van het te verwijderen doelgen, wat in dit voorbeeld een gen van verticillium dahliae is. Na dubbele digestie bevestigt de vrijgave van een insert van 4 247 basenparen in dit geval de correcte plasmide-structuur in alle banen, behalve in baan vijf en 11. Een PCR-benadering wordt gebruikt om de deletie te bevestigen.Dit voorbeeld toont de analyse van vijf transformanten van Fusarium verticillioides. In de bovenste gel zijn banen twee tot zes de amplificaties van de 5'-flank, en banen zeven tot 11 de amplificaties van de open leesramen. In de onderste gel zijn banen twee tot zes de amplificaties van het selecteerbare markergen, en banen zeven tot 11 de amplificaties van de 3'-flank.De aanwezigheid van banden in de amplificaties van de 5'-flank, de 3'-flank en het selecteerbare markergen, samen met de afwezigheid van banden in de amplificatie van het open leesraam, bevestigt dat stammen 1131, 1132 en 1133 deletietransformanten zijn. De aanwezigheid van banden in de amplificaties van het open leesraam en de selecteerbare markergenen, en de afwezigheid van banden in de amplificaties van de 5'-flank en de 3'-flank, wijst erop dat stammen 1134 en 1135 atopische transformanten zijn. Gen-deleties kunnen ook worden bevestigd via Southern blot.Zodra deze techniek onder de knie is, kunnen Oscar-deletieplasmiden die klaar zijn voor schimmeltransformaties in twee dagen worden gegenereerd, exclusief de tijd voor sequencing. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om high-fidelity Taq-preliminaries te gebruiken en er zeker van te zijn dat aangrenzende genen niet worden beïnvloed. Na deze procedure kunnen andere methoden worden toegepast om mutante fenotypen te testen om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of een gen belangrijk is in specifieke processen, zoals geneemgevoeligheid of resistentie.Vergeet niet dat het werken met levende organismen, zoals agrobacteriën en schimmels, gevaarlijk kan zijn, vooral als een persoon immuungecompromitteerd is. Voorzorgsmaatregelen, zoals het wassen van de handen na de behandeling, moeten bij deze procedure altijd worden nageleefd.

rapid-deletion-production-fungi-via-agrobacterium-mediated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De mogelijkheid om transgenen te produceren...

De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker

De Green Monster methode kan de snelle montage van meerdere deleties gemarkeerd met een reportergen codeert groen fluorescent eiwit. Deze methode is gebaseerd op een giststammen door herhaalde cycli van seksuele assortiment van deleties en fluorescentie gebaseerde verrijking van cellen die meer deleties.

The Green Monster Werkwijze voor de generatie van giststammen dragen Meerdere gendeleties

Een efficiënte genoom-brede enkel gen mutatie methode is vastgesteld aan de...

Genoom-brede gendeleties in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Door High Throughput PCR

Biolistische transformatie een methode om stabiele integratie van DNA genereren in het genoom van de opportunistische pathogeen Cryptococcus neoformans via homologe recombinatie. We zullen biolistische transformatie van een construct, waarin het gen codeert acetaat kinase gefuseerd met de fluorescerende tag mCherry in C. neoformans is aangetoond.

Biolistische Transformatie van een TL Tagged Gene in de Opportunistische schimmelpathogeen<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Wij rapporteren hier methoden over de moleculair-genetische manipulatie van de Yarrowia lipolytica Po1g stam voor verbeterde gendeletie-efficiëntie. De resulterende gemanipuleerde Y. lipolytica stammen hebben potentiële toepassingen in biobrandstof en biochemische productie.

Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor willekeurige mutagenese van een target-gen in kernsplijting gist. Als voorbeeld, wij de doelstelling van rpt4 +, die codeert een subeenheid van de 19S proteasoom, en het scherm voor mutaties die heterochromatin te destabiliseren.

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van reeds bestaande antibiotica resistentie-cassette schrapping constructies als basis voor het maken van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . Dergelijke mutaties schrapping kunnen worden gemobiliseerd en ingevoegd in de corresponderende locus van een geadresseerde stam met behulp van P1 bacteriofaag transductie.

Productie van Gene verwijderingen in Escherichia coli door P1 transductie met accijnsplichtige antibioticaresistentie Cassettes

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Een agrobacterium-based injection (agroinjectie) protocol wordt gepresenteerd voor de inenting van vossenstaart mozaïek virus en suikerriet mozaïek virusclones in maïs zaailingen. Inenting op deze manier leidt tot virale infectie, virus-geïnduceerde gen-uitschakeling van markergenen en virale overexpressie van GFP.

Directe agroinoculatie van maïszaailingen door injectie met recombinant vossenstaartmozaïekvirus en suikerrietmozaïekvirus Infectieuze klonen

Dit werk beschrijft een protocol voor een multicopy suppressor genetische screening in Schizosaccharomyces pombe. Dit scherm maakt gebruik van een genoombrede plasmidebibliotheek om suppressorkloon (en) van een functieverliesfenotype geassocieerd met een querymutantenstam te identificeren. Nieuwe genetische onderdrukkers van de ell1 null-mutant werden geïdentificeerd met behulp van dit scherm.

Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Leer de OSCAR-methode voor snelle verwijdering van genen in schimmels via Agrobacterium-gemedieerde transformatie. Deze techniek versnelt functioneel genetisch onderzoek naar ziekteverwekkende mechanismen.

Snelle verwijdering Productie in Fungi via

Meer video's verkennen