Name: Biofysische karakterisering van flagellaire Motor Functies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Ontdek hoe je de rotatie van sondeparels op flagellaire motoren in levende bacteriële cellen meet met behulp van real-time tracking. Deze techniek verbetert de experimentele nauwkeurigheid en biedt inzicht in het gedrag van moleculaire motoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Howard Berg voor het schenken van de bead-tracking microscoop/fotomultipliers en de Texas A&M Engineering Experiment Station voor de fondsen.

1. Celbereiding <ol><li> Groeien overnacht culturen van de gewenste stam die de kleverige flic allel 15,22 in Trypton Broth (TB, 1% pepton, 0,5% NaCl), gevolgd door inoculatie bij 1: 100 verdunning in 10 ml vers TB. Groeien de cultuur bij 33 ° C in een shaker incubator tot OD 600 = 0,5. </li><li> Pellet de cellen bij 1500 xg gedurende 5-7 min en opnieuw dispergeren van de pellet krachtig in 10 ml filter gesteriliseerd motiliteit buffer (MB; 10 mM fosfaatbuffer: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 pM methionine, pH 7,0). </li><li> Herhaal stap 1.2 nog twee keer en re-verspreiden de laatste pellet in 1 ml MB. </li><li> Afschuiving de suspensie door het passeren heen en weer ~ 75 maal tussen twee spuiten met 21 tot 23 gauge adapters verbonden met polyethyleen buis (7-12 cm lang, 0,58 mm binnendiameter). Beperk de totale tijd voor het knippen tot 30 - 45 s. </li><li> Centrifugeer de cellen afgeschoven bij 1500 xg gedurende 5-7 min en opnieuw dispergerenpellet in 100-500 gl MB. </li></ol> 2. Schuif Voorbereiding <ol><li> Bereid een imaging kamer door sandwichen twee dubbelzijdige plakband tussen een cover-slip en een microscoop glijbaan. Voor chemotaxis assays, in dienst nemen elke microfluïdische kamer dat de uitwisseling van MB en chemische stimulerende middelen mogelijk maakt. </li><li> Voeg 0,01% poly-L-lysine oplossing in de kamer en na 5 min zachtjes spoelen oppervlakken MB (80-100 pl). </li><li> Voeg 40 ul van de celsuspensie in de kamer en voldoende tijd voor bevestiging aan het glasoppervlak (7-8 min). Vloeien unstuck cellen door toevoeging van 100 ul MB aan één zijde van de kamer, terwijl de wicking oplossing met filtreerpapier van de andere kant. </li><li> Voeg 10-15 pi van latex bolletjes in de kamer en laat de kralen voldoende tijd om zich te vestigen en te hechten aan de cellen (7-8 min). Voorzichtig spoelen met 100 pl MB, zoals beschreven in stap 2.3, kralen unstuck te verwijderen. Gebruik een bereik van de kraal-siZes van de experimenten zolang een goed contrast is beschikbaar. </li></ol> 3. Bead Tracking <ol><li> Plaats het monster op een microscoop podium en scan het oppervlak beads bevestigd aan een motor. Gebruik een 40X fase doelstelling om opmerkingen te maken, hoewel fase microscopie is niet nodig. Als alternatief, in dienst nemen bright-field imaging zolang voldoende contrast wordt gehandhaafd om duidelijk onderscheid te maken een heldere kraal op een donkere achtergrond. </li><li> Zodra een kraal is geselecteerd, gaat de fase zijdelings aan de korrel positie in een vooraf bepaalde hoek zoals weergegeven in figuur 1B. Positie bolletjes op dezelfde hoek dat de rotatierichting van de kraal goed bekend. De ideale kraal traject is ongeveer cirkelvormig maar elliptisch trajecten ontvankelijk zijn. </li><li> Handhaaf de bemonsteringsfrequentie hoger is dan tweemaal de rotatiefrequentie van de motor om fouten geassocieerd met aliasing te voorkomen. In dit werk, gebruik dan een motor die roteerde bij50 Hz en monster bij frequenties die 10 keer hoger (500 Hz) werden tot een egaal signaal te verkrijgen. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Centrum en schaal van de PMT uitgangsspanningen en correcte ellipticiteit in de trajecten met affiene transformatie indien nodig 23. Gebruik een power-spectrum analyse rotatiesnelheden 17 te bepalen. </li><li> Bepalen polaire hoeken θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Bepaal de variaties in de snelheid van de motor en schakelen na verloop van tijd door het berekenen van ω <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14. </li><li> Gebruik een mediaan filter om de motorsnelheid data glad. Een filter venster over twee volledige omwentelingen wordt aanbevolen 23,24. </li></ol>

<ol><li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob.+Ag%22%5BJournal%5D)">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li>
<li>Lane, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+motility+in+the+colonization+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract.</a> Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).</li>
<li>Kao, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+interplay+among+bacterial+motility+and+virulence+factors+in+different+Escherichia+coli+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).</li>
<li>Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rotary+motor+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The rotary motor of bacterial flagella.</a> Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).</li>
<li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+Dynamometer+Controls+Swarmer+Cell+Differentiation+of+V.+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li>
<li>Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mechanosensing+in+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).</li>
<li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Belas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%2C+flagella%2C+and+mechanosensing+of+surfaces+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria.</a> Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).</li>
<li>Silverman, M., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+rotation+and+the+mechanism+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility.</a> Nature. 249, 73-74 (1974).</li>
<li>Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+Kinetics+in+Bacterial+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis.</a> J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).</li>
<li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).</li>
<li>Blair, D. F., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+torque+in+defective+flagellar+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoration of torque in defective flagellar motors.</a> Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).</li>
<li>Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-generating+units+of+the+flagellar+motor+of+Escherchia+coli+have+a+high+duty+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio.</a> Nature. 403, 444-447 (2000).</li>
<li>Yuan, J., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurrection+of+the+flagellar+rotary+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).</li>
<li>Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+of+the+bacterial+flagellar+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Switching of the bacterial flagellar motor near zero load.</a> J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).</li>
<li>Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+Relationship+of+the+Na%2B-driven+Flagellar+Motor+of+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus.</a> J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).</li>
<li>Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+relationship+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).</li>
<li>Meacci, G., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+bacterial+flagellar+motor+with+multiple+stators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellar+motor+of+Caulobacter+crescentus+generates+more+torque+when+a+cell+swims+backwards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards.</a> Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).</li>
<li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).</li>
<li>Berg, H. C., Turner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+Generated+by+the+Flagellar+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).</li>
<li>Bai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Spread+as+a+Mechanism+for+Cooperativity+in+the+Bacterial+Flagellar+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch.</a> Science. 327, 685-689 (2010).</li>
<li>Reid, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maximum+number+of+torque-generating+units+in+the+flagellar+motor+of+Escherichia+coli+is+at+least+11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).</li>
<li>Chen, X., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-Speed+Relationship+of+the+Flagellar+Rotary+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).</li>
<li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om vastgebonden kraal-tracking en correcte inschatting van de motor-koppels te vergemakkelijken, dient de volgende gegevens te worden beoordeeld. Bij het uitvoeren van deze metingen met gegeseld cellen, scheren is een cruciale stap. Shearing vermindert de flagellaire filament tot slechts stomp, waardoor wordt gewaarborgd dat de viskeuze belasting van de motor is hoofdzakelijk te wijten aan de korrel en kan worden geschat op 10% fout 16. Shearing verbetert ook de kans op het vinden van cirkelvormige trajecten ...

Flagellaire motoren in staat cellen te zwemmen door roterende spiraalvormige extracellulaire filamenten. De hoeveelheid koppel van de motor kan genereren voor een bepaalde lengte van het flagellum (dat wil zeggen, de viskeuze belasting) bepaalt het zwemmen snelheden. Anderzijds, zijn vermogen om de draairichting schakelaar regelt celmigratie als reactie op chemische stoffen, een proces dat bekend staat als chemotaxis. Chemotaxis en beweeglijkheid zijn virulentiefactoren 1-3, flagellaire motoren zijn goed gekarakteriseerd door de jaren heen 4. Toenemende bewijs nu dat de motor werkt als een mechanosensor - het mechanisch detecteert de aanwezigheid van vaste substraten 5,6. Dit vermogen waarschijnlijk helpt bij het ontstaan oppervlaktekolonisatie en infecties 5,7. Hierdoor mechanismen waardoor de motor detecteert oppervlakken en ingewijden signalering significantieniveau 8,9. De flagellaire motor kan gemakkelijk worden bestudeerd door tethering de flagellum op een substraat en waarnemen cel rotatie. Dergelijke tethering werd eerst bereikt door Silverman en Simon, die met een polyhook mutant in E. coli en succesvol verbonden haken glassubstraten met anti-haak antilichamen 10 werkte. De gebonden cel assay konden de onderzoekers de antwoorden van de motor-schakelaar bestuderen van verschillende chemische stimuli. Bijvoorbeeld, Segall en collega chemisch gebonden gestimuleerde cellen met behulp van iontoforetische pipetten. De overeenkomstige wijzigingen in de CW vertekening (de fractie van de tijd motoren draaien met de klok mee, CW) stelde hen in staat om de kinetiek van de aanpassing te meten in de chemotaxis netwerk 11,12. Terwijl de tethered cel assay effectief in het bestuderen switch reacties, het was alleen in staat om inzichten in motor mechanica bieden meer dan een beperkt aantal viskeuze lasten 13. Om dit probleem te overwinnen, Ryu en medewerkers aangebonden bolvormige, latex kralen stubs op cellen vast oppervlakken gloeidraad. De kralen warenvervolgens gevolgd met behulp van back-focal interferometrie met zwakke optische vallen 14. Door te werken met kralen van verschillende afmetingen, kunnen onderzoekers de motor te bestuderen over een veel breder scala van lasten. Deze test werd later verbeterd door Yuan en Berg, die een fotovermenigvuldiger-gebaseerde bead-tracking-techniek in combinatie met laser donkerveld belichting ontwikkeld. Hun methode mogelijk volgen van tethered goud nanobeads die zo klein waren (~ 60 nm) dat de externe viskeuze weerstanden waren lager in vergelijking met de interne weerstanden viskeuze rotatie 15,16. Dit leidde tot de metingen van de maximaal haalbare snelheid in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, soortgelijke kralen assays mogelijk metingen van de spinnen tarieven op tussenliggende viskeuze belasting (~ 700 Hz) 17. Door het inschakelen van de metingen van motorische reacties over het gehele mogelijke waaier van viskeuze lasten (van nul-belasting op near-stal), de kraal-assays mits een belangrijk biofysische hulpmiddel om te begrijpen van de torque generatie proces 18,19. Onlangs, bewerkt we de Yuan-Berg assay optische pincetten die ons in staat om precieze mechanische stimuli van toepassing op individuele motors 6 omvatten. Met deze techniek hebben we aangetoond dat de kracht-generators de motor draaien dynamisch mechanosensors - ze verbouwen in reactie op veranderingen in viskeuze belastingen. Het is mogelijk dat dergelijke load-sensing triggers celdifferentiatie in zwermen bacteriën, hoewel de mechanismen onduidelijk. Het is ook waarschijnlijk dat de flagellar motoren van andere species zijn ook mechanosensitieve 20, ofschoon direct bewijs ontbreekt. Hier bespreken we de fotovermenigvuldiger-gebaseerde (PMT) benadering voor het volgen van de rotatie van latex bolletjes gebonden aan flagellaire filamenten 15. In vergelijking met het volgen van ultrasnelle camera, de fotovermenigvuldiger-opstelling is voordelig omdat het relatief eenvoudig om één kralen in real time en over lange duragen. Het is vooral handig bij het bestuderen van de lange tijd remodeling in flagellaire motor complexen te wijten aan prikkels uit de omgeving 21. Hoewel we detail protocollen specifiek voor E. coli, kunnen zij gemakkelijk worden aangepast voor het bestuderen flagellaire motoren in andere soorten.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>1 mL Luer Slip Tip Syringe</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427565</td><td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td>Polyethylene tubing</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-8325</td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>Photomultiplier Tubes</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,&nbsp; 0.78 ns response time&nbsp; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>3 x 1 mm precision slits</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts&nbsp; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>8 Pole LP/HP Filter</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.&nbsp;&nbsp;&nbsp; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Optiphot microscope</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R:T) Cube Beamsplitter</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

biofysische karakterisering van flagellaire motor functies

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

De rol van flagellaire motoren bij bacteriële beweeglijkheid en chemotaxis is goed begrepen. Recente ontdekkingen suggereren dat flagellaire motoren in staat zijn om zich aan te passen in reactie op een verscheidenheid aan omgevingsstimuli en behoren tot de triggers voor oppervlaktekolonisatie en infecties. De precieze mechanismen waarmee motoren zich aanpassen en cellulaire aanpassing bevorderen, zijn waarschijnlijk afhankelijk van belangrijke motorkenmerken. De hier gepresenteerde fotomultiplier-gebaseerde bead-trackingtechniek maakt nauwkeurige biofysische karakterisering van motorfuncties mogelijk, inclusief aanpassingen in motorsnelheden en schakeldynamica. Deze aanpak biedt het voordeel van real-time tracking en de mogelijkheid om het gedrag van motoren gedurende langere perioden te onderzoeken. De besproken protocollen kunnen gemakkelijk worden uitgebreid om flagellaire motoren in een verscheidenheid aan bacteriële soorten te bestuderen.

De fotovermenigvuldiger opstelling is weergegeven in figuur 1A. Het is belangrijk dat de PMT hoge gevoeligheden over het bereik van golflengten verstrooid door de kralen plaats. De PMT&#39;s hier in dienst werken in het zichtbare en nabij-infrarode bereik, en waren in staat om het licht verstrooid door kralen verlicht door een halogeen lichtbron detecteren. De optimale lichtomstandigheden en voltages zal variëren van de ene instelling naar de andere. Voor de installatie ...

Recente bevindingen suggereren dat bacteriële flagellaire motoren een verscheidenheid aan omgevingssignalen detecteren en als reactie hierop veranderen. De hier besproken bead-assays zullen naar verwachting helpen bij het verklaren van de rol van verandering in cellulaire aanpassing aan omgevingsstressors.

Biofysische karakterisering van flagellaire Motor Functies

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Het algemene doel van deze experimentele procedure is het meten van de rotatie van probe-beads die zijn bevestigd aan individuele flagellaire motoren in levende bacteriële cellen. De techniek die we zullen beschrijven biedt het voordeel van real-time tracking van motorresponsen en de mogelijkheid om in real-time onderscheid te maken tussen toelaatbare en niet-toelaatbare gegevens. Deze aanpak helpt ons om kernvragen in het veld van de mechanobiologie te beantwoorden en de fysica te ontrafelen die ten grondslag ligt aan het gedrag van moleculaire motoren.Hoewel we deze technieken voornamelijk gebruiken om flagellaire motoren in E.coli te bestuderen, kunnen deze protocollen eenvoudig worden aangepast om motoren in andere soorten geflagelleerde bacteriën te bestuderen. Kweek overnightculturen van de gewenste stam die het sticky fliC-allel draagt in TB. Inoculeer de volgende dag 10 milliliters verse TB met een verdunning van 1:100. Kweek de cultuur bij 33 °C in een schudincubator totdat de optische dichtheid bij 600 nm gelijk is aan 0,5.Centrifugeer de cellen bij 1500 ×g gedurende vijf tot zeven minuten om een pellet te vormen. Resuspendeer de pellet vervolgens krachtig in 10 milliliters filtersteriele motiliteitsbuffer. Herhaal de centrifugatie en resuspensie nog twee keer.Resuspendeer het uiteindelijke pellet in één milliliter MB. Shear de suspensie door deze ongeveer 75 keer heen en weer te bewegen tussen twee spuiten met 21 tot 23 gauge adapters die zijn verbonden door polyethyleen slangjes. Beperk de totale shearing-tijd tot 30 tot 45 seconden. Resuspendeer na centrifugatie van de geshearde cellen het pellet in 100 tot 500 µL MB. Bereid een beeldkamer voor door twee dubbelzijdige plakbanden tussen een dekglas en een objectglas te plaatsen.Voeg 0,01% poly-L-lysine-oplossing toe aan de kamer en spoel na vijf minuten de oppervlakken voorzichtig af met MB. Voeg 40 µL van de celсусpensie toe aan de kamer en geef voldoende tijd voor hechting aan het glazen oppervlak. Spoel niet-gehechte cellen weg door 100 µL MB aan één zijde van de kamer toe te voegen, terwijl de oplossing aan de andere zijde met filterpapier wordt weggezogen. Voeg vervolgens 10 tot 15 µL latex beads toe aan de kamer.Gebruik voor de experimenten een reeks kraalgroottes die zorgen voor een goed contrast. Geef de kralen voldoende tijd om te bezinken en zich aan de cellen te hechten. Spoel de kralen voorzichtig af met 100 µL MB om niet-gehechte kralen te verwijderen.Plaats het monster op een microscooptafel en scan het oppervlak op zoek naar kralen die aan motoren zijn bevestigd. Gebruik bright-field imaging met een 60X objectief, zolang er voldoende contrast behouden blijft om een heldere kraal duidelijk te onderscheiden tegen een donkere achtergrond. Zodra er een kraal is geselecteerd, wordt de tafel zijdelings verplaatst om de kraal in een vooraf bepaalde hoek te positioneren.Plaats de kralen in dezelfde hoek om ervoor te zorgen dat de rotatierichting van de kraal correct bekend is. Houd de bemonsteringsfrequentie hoger dan twee keer de rotatiefrequentie van de motor om fouten door aliasing te voorkomen. In dit werk werden bemonsteringsfrequenties die 10 keer hoger waren gebruikt om een motor te observeren die roteerde bij 50 hertz.Als de kraaltjes na de koppeling lijken te wiebelen met een excentriciteit die groter is dan één tot twee keer de straal van het kraaltje, dan wordt aanbevolen om de cellen een groter aantal keren te shearren. Hier wordt een visuele vergelijking getoond tussen een correct gekoppeld kraaltje en een kraaltje dat niet is gekoppeld. De outputs van de twee fotomultiplicatoren, bemonsterd op 500 hertz, worden weergegeven over een kort tijdsbestek van de meting.De gefilterde outputs van de PMT's werden, na centrering en schaling, gebruikt om de cirkelvormige trajecten van het roterende kraaltje te reconstrueren, zoals hier wordt getoond. Het ideale traject van het kraaltje is nagenoeg cirkelvormig, maar elliptische trajecten zijn acceptabel. De hoeksnelheden, berekend op basis van de trajecten van het kraaltje voor een enkele motor, zijn weergegeven over een venster van drie seconden.De herhaalde overgangen van de motor tussen de tegen- en met de klok mee draaiende rotatierichtingen worden aangegeven door wisselingen tussen positieve en negatieve waarden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kralen die aan enkele flagellaire motoren zijn bevestigd met hoge nauwkeurigheid kunt volgen, met behulp van de hier gepresenteerde technieken op basis van fotomultiplicators. De bacteriële flagellaire motor brengt een unieke reeks uitdagingen met zich mee omdat deze in staat is om te roteren met snelheden van enkele honderden hertz.Hoogwaardige nauwkeurige tracking van probe-beads die aan moleculaire motoren zijn gekoppeld, heeft de karakterisering van verschillende typen motoren gefaciliteerd, waaronder kinesines, myosines en F1-ATPase. De uitbreiding van de bead-koppelingstechniek naar flagellaire motoren stelde onderzoekers in staat om motormechanica met een ongekende nauwkeurigheid te bestuderen. Een visuele demonstratie van deze methode zal onderzoekers die deze techniek willen gebruiken helpen bij het overwinnen van uitdagingen, zoals het correct lokaliseren van beads die aan individuele motoren zijn gekoppeld.Er wordt verwacht dat de hier gedemonstreerde methoden zullen bijdragen aan het verkrijgen van nieuwe inzichten in de aanpassingscapaciteit van deze nanomachines in diverse bacteriële soorten.

biophysical-characterization-of-flagellar-motor-functions

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Intracellulair transport van ladingen, zoals blaasjes of organellen, wordt uitgevoerd door moleculaire motoreiwitten die op gepolariseerde microtubuli volgen. Dit protocol beschrijft de correlatie van de directionele richting van transport van individuele vrachtdeeltjes die zich binnen neuronen bewegen, naar de relatieve hoeveelheid en het type van geassocieerde motoreiwitten.

Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van &quot;Cargo Mapping&quot; Analyse

Het doel van dit protocol is het vormen van ensembles van moleculaire motoren op DNA origami nanostructuren en observeren het ensemble motiliteit met behulp van totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie.

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Veel bacteriën gebruiken flagella-gedreven beweeglijkheid om door hun omgeving te navigeren en gunstige omgevingen te koloniseren, zowel individueel als als collectief. Hier wordt het gebruik aangetoond van drie gevestigde methoden die motiliteit als selectietool gebruiken om componenten / paden te identificeren die bijdragen aan zwem- en zwermmotiliteit.

Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen

Hier wordt een procedure gepresenteerd om myosine 5a uit te drukken en te zuiveren, gevolgd door een bespreking van de karakterisering ervan, met behulp van zowel ensemble- als single molecule in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays, en hoe deze methoden kunnen worden aangepast voor de karakterisering van niet-amuskel myosine 2b.

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Hier wordt een uitgebreid protocol gepresenteerd om ultrasnelle krachtklemexperimenten uit te voeren op processieve myosine-5-motoren, die gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar de studie van andere klassen processieve motoren. Het protocol beschrijft alle noodzakelijke stappen, van de opstelling van het experimentele apparaat tot monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse.

Het ontleden van mechano-enzymatische eigenschappen van processieve myosinen met ultrasnelle krachtklemspectroscopie

Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio's die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.

Generatie van null-mutanten om de rol van bacteriële glycosyltransferasen in bacteriële motiliteit op te helderen

De bidirectionele mitotische kinesine-5 Cin8 hoopt zich op in clusters die splitsen en samensmelten tijdens hun beweeglijkheid. Accumulatie in clusters verandert ook de snelheid en directionaliteit van Cin8. Hier wordt een protocol voor motiliteitstests met gezuiverde Cin8-GFP en analyse van beweeglijke eigenschappen van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 beschreven.

Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

Vorming van actomyosinebundels in vitro en het meten van myosine ensemblekrachtgeneratie met behulp van een optisch pincet wordt gepresenteerd en besproken.

Myosine Ensemble Mechanics onderzoeken in Actin Filament Bundles met behulp van optische pincetten

Hier presenteren we een protocol voor het reconstitueren van microtubulibundels in vitro en het direct kwantificeren van de krachten die erin worden uitgeoefend met behulp van gelijktijdige optische vangmethoden en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze test maakt het mogelijk om op nanoschaal de krachten en verplaatsingen te meten die worden gegenereerd door eiwitensembles binnen actieve microtubulinetwerken.

Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

Deze studie beschrijft de zuivering van KIF1A (1-393LZ), een lid van de kinesine-3-familie, met behulp van het Sf9-baculovirusexpressiesysteem. In vitro single-molecule en multi-motor zweefanalyse van deze gezuiverde motoren vertoonde robuuste motiliteitseigenschappen vergelijkbaar met motoren van zoogdiercellysaat. Sf9-baculovirussysteem is dus vatbaar voor expressie en zuivering van motoreiwit van belang.

Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren

Dit protocol beschrijft de procedures voor het recombinant produceren van het humaan myosine-7a holo-enzym met behulp van het MultiBac Baculovirus-systeem en voor het bestuderen van de beweeglijkheid ervan met behulp van een op maat gemaakte in vitro filament glijdende test.

MultiBac-systeemgebaseerde zuivering en biofysische karakterisering van humaan myosine-7a

Ontdek hoe je de rotatie van sondeparels op flagellaire motoren in levende bacteriële cellen meet met behulp van real-time tracking. Deze techniek verbetert de experimentele nauwkeurigheid en biedt inzicht in het gedrag van moleculaire motoren.

Biofysische karakterisering van flagellaire Motor Functies

Meer video's verkennen