Voorwaardelijke herprogrammeren van Pediatric Human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in Tissue Engineering and Disease Investigation
22 maart 2017
Uitbreiding van menselijke kinderen oesofageale epitheelcellen gebruikmaking voorwaardelijke herprogrammering biedt onderzoekers met een patiënt-specifieke populatie van cellen die kunnen worden gebruikt voor de engineering oesofageale constructen autologe implantatie defecten of letsel behandelen en dienen als een reservoir voor therapeutische screeningstesten.
Het algemene doel van deze procedure is om van endoscopische biopsieën afgeleide patiëntspecifieke slokdarm-epitheelcellen te expanderen om slokdarmziekten te bestuderen, of om een 3D-slokdarmstructuur te creëren voor downstream modellering of slokdarmweefselvervanging. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van slokdarm-epitheelcellen bij slokdarmziekten beter te begrijpen. Ze kunnen ook worden gebruikt om 3D-structuren voor modellering of implantatie te zien.
Het voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om patiëntspecifieke epitheelcellen te genereren uit een zeer klein stukje weefsel zonder dat er genetische of permanente wijzigingen nodig zijn. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar het begrijpen van de pathogenese van eosinofiele oesofagitis, evenals het ontwikkelen van behandelingen voor slokdarmatresie en eosinofiele oesofagitis. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek worstelen met de mogelijkheid om de feedercellen volledig te verwijderen voorafgaand aan het oogsten van menselijke slokdarm-epitheelcellen om de zuiverheid te behouden.
Demonstratie van deze techniek zal worden gedaan door Christopher Foster, een technicus van ons laboratorium. Plaats ten minste drie dagen voordat de patiëntmonsters worden verkregen, de 3T3-cellen in 3T3-kweekmedium in weefselbehandelde T75-kolven. Op de dag van het experiment, net voordat de monsters worden verkregen, los de 3T3-cellen op met 5 milliliter 0,25% Trypsin-EDTA per kolf gedurende ongeveer vijf minuten bij 37 graden Celsius.
Wanneer de meeste cellen zweven, voeg dan 5 milliliter 3T3-medium toe om de reactie te stoppen en breng de celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis voor centrifugatie. Re-suspendeer het pellet in medium voor telling. Breng vervolgens het juiste aantal cellen over voor het zaaien in een 15 milliliter conische buis.
Voeg vervolgens 25 milliliter vers 3T3-medium toe aan de cellen voor bestraling bij 3000 rads. Verzamel vervolgens de cellen door centrifugatie en re-suspendeer het pellet in conditioneel programmeermedium bij vijf milliliter per 100 millimeter plaat. Nadat u ongeveer zes slokdarmbiopsieën heeft verkregen tijdens de endoscopie, plaatst u zes biopsieën in een 15 milliliter conische buis met compleet serumvrij keratinocytenmedium, aangevuld met Primocin op nat ijs.
Plaats een biopsie in vijf milliliter gebufferd Formalin op nat ijs en plaats een biopsie in een kleine biopsie cryomold bevattende inbeddingsmedium. Dompel de mal onmiddellijk in een beker met ijs of pentaan in een container met vloeibare stikstof. Zodra het weefsel bevroren is, plaatst u de cryomold in een monstersteek in een polystyreenschuimcontainer.
Plaats vervolgens de buizen met biopsies in een verzegelbare zak in een verzenddoos met het biogevaarlabel dat nat ijs bevat, en verzegel en label beide containers met een biogevaarsticker voor transport naar het laboratorium. Bij binnenkomst in het laboratorium, brengt u onmiddellijk de bevroren biopsie over naar een opslag van minuus 80 graden Celsius voor downstream sectie of RNA-extractie. Plaats het monster in Formalin in een koelkast van vier graden Celsius voor overnacht fixatie en plaats de resterende biopsies in de centrifuge.
Vervang het medium in elke buis met 10 milliliter dispase-oplossing en verzegel de buizen voor een 15 minuten incubatie bij 37 graden Celsius in een waterbad. Aan het einde van de incubatie, centrifugeert u de biopsies weer neer en re-suspendeert u de monsters in vijf milliliter 0,25% Trypsin-EDTA. Breng de biopsies over naar een enkele 100 milliliter steriele plaat en gebruik twee gesteriliseerde scheermessen om de weefsels zo fijn mogelijk te snijden.
Wanneer al het weefsel is gesneden, brengt u de weefselfragmenten over naar een nieuwe 15 milliliter buis en spoelt u de plaat twee keer met vijf milliliter 0,05% Trypsin-EDTA. Pool de wasbeurten in de buis en breng de monsters terug naar een waterbad van 37 graden Celsius. Na 10 minuten centrifugeert u de verteerde monsterdelen en de feedercellen en re-suspendeert u de pellets in vijf milliliter conditioneel reprogrammeringsmedium, elk.
Combineer vervolgens de feeder- en slokdarmbiopsiemonsters in één buis en voeg rho kinase of ROCK-remmer toe aan de cellen voor hun co-cultuur op een gelatine-gecoate weefselkweekschotel. Na ongeveer vijf dagen, verwijdert u het medium en gehakte biopsiestukjes door aspiratie en spoelt u de schotel twee tot drie keer met vijf milliliter steriele PBS. Na de laatste wasbeurt, voegt u 10 milliliter vers medium toe dat is aangevuld met ROCK-remmer, aan de plaat toe en brengt u de co-cultuur terug naar de incubator totdat de cellen 70% confluency bereiken.
Om de cellen te expanderen, verwijdert u de feeders met vijf milliliter 0,05% Trypsin-EDTA bij 37 graden Celsius gedurende maximaal twee en een half minuten. Spoel de plaat met vijf milliliter vers PBS om de zwevende feedercellen te verwijderen en voeg vijf milliliter 0,25% Trypsin-EDTA toe voor een incubatie van vijf tot tien minuten totdat de biopsiemonstercellen loskomen van de bodem van de plaat. Stop vervolgens de reactie met 10 milliliter vers medium en breng de cellen over in een 50 milliliter conische buis voor centrifugatie.
Re-suspendeer het pellet in vers conditioneel reprogrammeringsmedium voor telling en tel nu een keer 10 tot de zesde menselijke slokdarmcellen in een nieuwe conische buis. Voeg 1,2 keer 10 tot de zesde geïrradieerd 3T3-cellen toe aan de slokdarmcellen en breng het totale volume in de buis naar 15 milliliter met vers conditioneel reprogrammeringsmedium. Voeg vervolgens vers ROCK-remmer toe aan de cellen en plateer de co-cultuur op een gelatine-gecoate 150 millimeter schotel.
Om de slokdarmcellen te bevriezen voor opslag bij minuus 80 graden Celsius, verwijdert u de feeders en los de slokdarmcellen op zoals net gedemonstreerd. Breng vervolgens de cellen over in een nieuwe 50 milliliter conische buis voor centrifugatie en re-
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt een methode voor het uitbreiden van humane pediatrische slokdarmepitheliale cellen door middel van conditionele herprogrammering. Deze techniek maakt de generatie van patiëntspecifieke cellen mogelijk die kunnen worden gebruikt voor de ontwikkeling van slokdarmsconstructies en therapeutische screening.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Weefseltechniek
Achtergrond
- Patiëntafgeleide slokdarmepitheliale cellen kunnen worden verkregen uit endoscopische biopten.
- Deze methode helpt bij het bestuderen van slokdarmziekten en het creëren van 3D-scaffolds.
- Het vereist geen genetische modificaties, waardoor de celzuiverheid behouden blijft.
- De techniek heeft implicaties voor het begrijpen van eosinofiele oesofagitis en slokdarmatresie.
Doel van het onderzoek
- Om slokdarmepitheliale cellen uit te breiden voor ziektestudie.
- Om 3D-scaffolds te creëren voor modellering en weefselvervanging.
- Om het begrip van de rol van slokdarmepitheliale cellen in ziektes te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Conditionele herprogrammering van slokdarmepitheliale cellen.
- Endoscopische biopsie-inzameling voor celbron.
- Ontwikkeling van 3D-scaffolds voor weefselmodellering.
- Zuivering van epitheliale cellen na cultuur.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle uitbreiding van patiëntspecifieke slokdarmepitheliale cellen.
- Creatie van levensvatbare 3D-scaffolds voor mogelijke implantatie.
- Inzichten in de pathogenese van slokdarmziekten.
- Mogelijkheid voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingen voor slokdarmcondities.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare bron van patiëntspecifieke cellen.
- Het verbetert de onderzoekscapaciteiten in het begrijpen van slokdarmziekten.
- Toekomstige toepassingen kunnen leiden tot verbeterde therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Conditional reprogramming of pediatric human esophageal epithelial cells enables scalable expansion of patient-specific primary cells for disease modeling and tissue engineering. This approach addresses the bottleneck of limited tissue availability and inefficient expansion, supporting translational research and preclinical pipeline continuity. The method enhances predictive confidence for therapeutic screening and construct seeding in esophageal disease portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of esophageal disease mechanisms using patient-derived epithelial cells.
- Supports functional target validation by preserving native cell phenotype during expansion.
- Facilitates mechanistic de-risking for esophageal disease triggers and pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of primary epithelial cells for assay standardization.
- Enables quantitative readouts in antigen screening and inflammation assays.
- Supports scalability for high-content screening and downstream 3D model development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems for modeling pediatric esophageal disorders.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-matched cells.
- Supports risk-adjusted advancement of tissue-engineered constructs for implantation studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, assay development, and translational modeling with patient-specific esophageal epithelial cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven investigation of esophageal disease mechanisms and antigen triggers.
- Screening: Delivers assay-ready, phenotypically stable epithelial cells for reproducible screening workflows.
- Analytics: Provides quantitative outputs via flow cytometry, qRT-PCR, and immunofluorescence for condition comparison.
- Translational Research: Maintains disease relevance for preclinical modeling and construct seeding.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for expanding primary epithelial cells across multiple studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in esophageal disease research.
- Operational Value: Standardizes cell expansion and characterization for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for therapeutic and tissue engineering programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of disease models and engineered constructs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and feeder cell management.
- Needs access to irradiation equipment and analytical platforms for cell characterization.
- Demands rigorous sterile technique and cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different patient samples or disease states.
- Feeder cell removal and cell purity are critical for downstream applications.
