Voorwaardelijke herprogrammeren van Pediatric Human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in Tissue Engineering and Disease Investigation

Het algemene doel van deze procedure is het expanderen van patiënt-afgeleide oesofageale epitheelcellen uit endoscopische biopten om oesofageale ziekten te bestuderen, of om een 3D-oesofageaal steunstructuur te creëren voor vervolgmodellering of vervanging van oesofageaal weefsel. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van oesofageale epitheelcellen bij oesofageale ziekten beter te begrijpen. Ze kunnen ook worden gebruikt om 3D-steunstructuren te maken voor modellering of implantatie.

Het voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om patiëntspecifieke epitheelcellen te genereren uit een zeer klein stukje weefsel, zonder dat er genetische of permanente modificaties nodig zijn. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het begrijpen van de pathogenese van eosinofiele oesofagitis, evenals het ontwikkelen van behandelingen voor oesofageale atresie en eosinofiele oesofagitis. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben met het volledig verwijderen van de feeder-cellen voorafgaand aan het oogsten van menselijke oesofageale epitheelcellen om de zuiverheid te behouden.

Christopher Foster, een technicus uit ons laboratorium, zal deze techniek demonstreren. Plaats ten minste drie dagen voordat de patiëntenmonsters worden verkregen de 3T3-cellen in 3T3-kweekmedium in weefselbehandelde T75-flessen. Op de dag van het experiment, vlak voordat de monsters worden verkregen, worden de 3T3-cellen losgemaakt met 5 milliliter 0,25%Trypsin-EDTA per fles gedurende ongeveer vijf minuten bij 37 °C.

Wanneer de meeste cellen zweven, voegt u 5 milliliters 3T3-medium toe om de reactie te stoppen en brengt u de celsuspensie over naar een 15 milliliter conische buis voor centrifugatie. Resuspendeer de pellet in medium voor het tellen. Breng vervolgens het juiste aantal cellen voor het uitplaten over naar een 15 milliliter conische buis.

Voeg vervolgens 25 milliliter vers 3T3-medium toe aan de cellen voor bestraling bij 3000 rads. Verzamel daarna de cellen door middel van centrifugatie en resuspendeer het pellet in conditioneel programmeermedium in een volume van vijf milliliter per 100 millimeter plaat. Nadat er tijdens de endoscopie ongeveer zes slokdarmbiopten zijn verkregen, worden deze zes biopten geplaatst in een 15 milliliter conische buis met volledig serumvrij keratinocytmedium, aangevuld met Primocin op nat ijs.

Plaats één biopsie in vijf milliliter gebufferde Formalin op nat ijs, en plaats één biopsie in een kleine biopsie-cryomold met inbeddingsmedium. Dompel de mold onmiddellijk onder in een bekerglas met ijs of pentaan binnen een container met vloeibare stikstof. Zodra het weefsel bevroren is, plaatst u de cryomold in een monsterzak op droog ijs, in een container van polystyreen schuim.

Plaats vervolgens de buisjes met biopten in een afsluitbare zak in een verzenddoos met het biohazard-label en nat ijs, en sluit en label beide containers met een biohazard-sticker voor transport naar het laboratorium. Verplaats de bevroren biopsie bij aankomst in het lab onmiddellijk naar een opslag van -80 °C voor verdere sectie of RNA-extractie. Plaats het monster in Formaline in een koelkast van 4 °C voor overnacht fixatie en plaats de resterende biopten in de centrifuge.

Vervang het medium in elke buis door 10 milliliters dispase-oplossing en sluit de buizen af voor een incubatie van 15 minuten bij 37 degree Celsius in een waterbad. Centrifugeer de biopsieën aan het einde van de incubatie opnieuw en resuspendeer de monsters in vijf milliliters 0,25% Trypsin-EDTA. Breng de biopsieën over naar één enkele steriele plaat van 100 milliliter en gebruik twee gesteriliseerde scheermesjes om de weefsels zo fijn mogelijk te fijnmalen.

Wanneer al het weefsel is gesneden, worden de weefselfragmenten overgebracht naar een nieuwe buis van 15 milliliter en wordt de plaat twee keer gespoeld met vijf milliliter 0,05% Trypsin-EDTA. Verzamel de spoelvloeistoffen in de buis en plaats de monsters terug in een waterbad van 37 graden Celsius. Centrifugeer na 10 minuten de verteerde monsterstukjes en de feeder-cellen, en resuspendeer de pellets elk in vijf milliliter conditioneel herprogrammeringsmedium.

Combine vervolgens de feeder- en slokdarmbiopsie-monsters in één buis en voeg rho-kinase-, of ROCK-remmer, toe aan de cellen voor hun co-kweek op een met gelatine gecoate weefselkweekschaal. Verwijder na ongeveer vijf dagen het medium en de fijngehakte biopsiestukjes door aspiratie en spoel de schaal twee tot drie keer met vijf milliliter steriele PBS. Voeg na de laatste wasbeurt 10 milliliter vers medium, aangevuld met ROCK-remmer, toe aan de plaat en plaats de co-kweek terug in de incubator totdat de cellen een confluentie van 70% bereiken.

Om de cellen te expanderen, worden de feeder-cellen verwijderd met vijf milliliter 0,05% Trypsin-EDTA bij 37 °C gedurende maximaal twee en een halve minuut. Spoel de plaat met vijf milliliter vers PBS om de zwevende feeder-cellen te verwijderen en voeg vijf milliliter 0,25% Trypsin-EDTA toe voor een incubatie van vijf tot 10 minuten, totdat de cellen van het biopsimonster loslaten van de bodem van de plaat. Stop vervolgens de reactie met 10 milliliter vers medium en breng de cellen over in een conische buis van 50 milliliter voor centrifugatie.

Resuspendeer het pellet in vers conditioneel herprogrammeringsmedium voor het tellen en breng vervolgens 1 × 10⁶ menselijke slokdarmcellen over naar een nieuwe conische buis. Voeg 1,2 × 10⁶ bestraalde 3T3-cellen toe aan de slokdarmcellen en vul het totale volume in de buis aan tot 15 milliliter met vers conditioneel herprogrammeringsmedium. Voeg vervolgens vers ROCK-inhibitor toe aan de cellen en zaai de co-cultuur uit op een met gelatine gecoate schaal van 150 millimeter.

Om de slokdarmcellen te vriezen voor opslag bij -80 °C, verwijdert u de feeder-cellen en detacheert u de slokdarmcellen zoals zojuist gedemonstreerd. Transfer de cellen vervolgens naar een nieuwe conische buis van 50 mL voor centrifugatie en resuspendeer de pellet in vriesmedium tot een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per 2 mL. Transfer daarna 2 mL cellen naar elke vooraf gelabelde cryovial en bewaar de monsters ten minste 24 uur bij -80 °C voordat ze worden overgebracht naar langetermijnopslag in vloeibare stikstof.

Epitheliale celkolonies zullen zich in ongeveer vier tot vijf dagen vormen en zullen worden omringd door fibroblast-voedercellen. Naarmate deze kolonies uitbreiden, zullen ze samensmelten met andere kolonies tot grotere kolonies. Zodra de cultuur 70% confluent is geworden, moeten ze worden uitgebreid.

Nadat de feeder-cellen zijn verwijderd, kunnen de adherente epitheelcellen worden getrypsoniseerd en opnieuw worden geplaatst op nieuwe bestraalde feeder-cellen. Fenotypische karakterisering van deze cellen via qRT-PCR onthult een opregulatie van P63, een marker voor progenitorcellen, aan het einde van passage één vergeleken met het initiële biopsiemonster, wat aangeeft dat de cellen zijn hergeprogrammeerd naar een meer progenitor-stamcelachtige staat. Wanneer deze cellen worden overgebracht naar normale weefselkweekplaten, neemt de expressie van P63 af en nemen de expressies van tight junction protein one, of TJP1, en E-cadherine toe, wat een fenotypische verschuiving aantoont van progenitorcel naar een meer gedifferentieerde epitheelcel.

Flowcytometrische analyse van de cellen na passage één geeft aan dat meer dan 90% van de cellen ook positief is voor EpCAM. Immunofluorescentiekleuring toont aan dat de cellen hun expressie van epitheliale marker, progenitor-marker, proliferatiemarker en epitheliaal tight-junction-eiwit behouden. De verdubbelingstijd van slokdarmcellen van een niet-zieke patiënt is berekend op ongeveer 36 tot 40 uur, hoewel het waarschijnlijk is dat de verdubbelingstijd van zieke cellen lager zal zijn.

Zodra deze techniek onder de knie is, zou deze in ongeveer één uur moeten worden voltooid. Gebruik bij het uitvoeren van deze procedure een steriele techniek om contaminatie te voorkomen en werk vlot om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Na deze procedure kunnen andere assays, zoals transwell-cultuur, worden uitgevoerd om te evalueren welke antigenen slokdarmontsteking of pathogenese veroorzaken.

Na de ontwikkeling zal deze assay de weg vrijmaken voor onderzoekers om triggerende antigenen te identificeren die eosinofiele oesofagitis veroorzaken, evenals nieuwe behandelingsopties voor de behandeling van deze patiënten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u oesofageale epitheelcellen uit endoscopische biopsieën kunt isoleren en expanderen voor gebruik bij het bestuderen van oesofageale aandoeningen of het genereren van 3D-modellen. Vergeet niet dat het werken met scherpe instrumenten en biologische weefsels gevaarlijk kan zijn.

Zorg ervoor dat scherpe instrumenten correct worden afgevoerd en pas goede biosafety-praktijken toe.