Name: Voorwaardelijke herprogrammeren van Pediatric Human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in Tissue Engineering and Disease Investigation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Leer voorwaardelijke herprogrammering van slokdarmepitheelcellen uit endoscopische biopten zonder genetische modificatie. Deze methode ondersteunt ziekteonderzoek en weefselengineering voor therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen Connecticut Children's Medical Center Strategic Research Funding graag bedanken voor de steun bij dit werk.

Slokdarm biopten werden verkregen na geïnformeerde toestemming werd verkregen van de ouders / verzorgers van de pediatrische patiënten en in overeenstemming met de institutionele Review Board (IRB # 13-094). 1. steriliseren van instrumenten en gelatine-oplossing <ol><li> Autoclaaf tang, scheermesjes en scharen voorafgaand aan de behandeling van weefsel om besmetting te voorkomen. </li><li> Tot 200 ml 0,1% gelatineoplossing te combineren 200 mL gedestilleerd water met 0,2 g gelatine. Autoclaaf en afkoelen voor gebruik. </li></ol> 2. Coating Tissue Culture Plates <ol><li> Ongeveer 2 uur voor celisolatie, voeg genoeg 0,1% gelatine een weefselkweekplaat (100 mm) te bedekken en incubeer bij 37 ° C in een celkweek incubator. Opmerking: Deze platen kunnen van tevoren worden gemaakt en bewaard in de incubator voor gebruik. </li></ol> 3. Het maken Enzymoplossing voor Dissociatie <ol><li> Ongeveer 30 minuten voorafgaand aan de cel isolatie, afgewogen10 eenheden van dispase op een saldo op basis van de eenheden per milligram concentratie op de flacon. Plaats het poeder in een 15 ml conische buis met 10 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) en in een 37 ° C waterbad. </li></ol> 4. Maken celkweekmedium <ol><li> Tot 50 ml voorwaardelijke herprogrammering medium maken, meng de volgende bestanddelen in een steriele conische buis: 35 ml F12 (Ham&#39;s Medium), 11,5 ml DMEM, 0,5 ml L-glutamine, 0,5 ml 100 x penicilline / streptomycine, 2,5 ml foetaal runderserum (FBS), 250 ug humane insuline, 500 ng humane epidermale groeifactor (EGF). </li><li> Om 500 ml medium te 3T3, meng 50 ml FBS, 5 ml 100x penicilline / streptomycine en 5 ml L-glutamine met 500 ml DMEM. </li><li> Tot 500 ml keratinocyt serum vrij medium te ontdooien EGF en runderhypofyse-extract (BPE) supplementen (bij de media). Voeg de aanvullingen op de 500 ml fles basismedium en voeg 5 ml 100x penicilline / streptomycine </li></ol> 5. Het kweken en Bestralen 3T3 cellen als een Feeder Source <ol><li> Bereid 3T3, omvattende DMEM, 10% FBS, 1 x penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine. </li><li> Cultuur 3T3-cellen in weefsel behandeld T-75 kolven ten minste 3 dagen voor de aankomst van de patiënt monsters. <ol><li> Net voor de komst van patiëntenmonsters, trypsinize 3T3 cellen met gebruik van 5 ml 0,25% trypsine-EDTA per kolf en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten of totdat de meeste cellen drijven </li></ol></li><li> Voeg 5 ml 3T3 medium om de reactie te stoppen. Zuig de celsuspensie overgebracht in een 15 ml conische buis. Centrifugeren gedurende 5 min bij 300 x g. </li><li> Zuig het medium en resuspendeer de cellen in een bepaald volume van trypan blauw voor celtelling. Combineer 10 pi cellen met 10 pi van trypan blauw om dode cellen te sluiten. Belasting 10 pi van deze oplossing op een hemocytometer voor celtelling. LET OP: Voor deze protocol, zaaidichtheid voor bestraalde 3T3 cellen 10.900 cellen per cm 2, die gelijk is aan 600.000 cellen per 100 mm plaat. </li><li> Aliquot het aantal cellen noodzakelijk om een ​​100 mm plaat per patiënt monster en resuspendeer plaat in 25 ml 3T3 medium in een 50 ml conische buis en bestralen met 3000 rad. </li><li> Na bestraling, spin-cellen naar beneden voor 5 min bij 300 xg en resuspendeer in voorwaardelijke herprogrammering medium bij 5 ml per 100 mm plaat. </li><li> Zet de buis weg totdat de beplating van de patiënt cellen later plaatsvindt in het protocol (zie stap 7.6). </li></ol> 6. Het verkrijgen, Behoud en vervoeren Pediatric Oesofageale Biopsieën <ol><li> Voeg 5 ml compleet keratinocyt serumvrij medium met 100 ug / ml primocin tot 15 ml conische buizen en brengen de medische inrichting op ijs. Opmerking: Deze buizen drager kan gedurende maximaal 2 maanden worden bewaard bij 4 ° C. </li><li> Het verkrijgen van ongeveer 8 oesofageale biopsies op de time van endoscopie en apart als volgt: <ol><li> Plaatsvindt zes biopsieën in de 15 ml conische met volledige keratinocyt serum vrij medium met 100 ug / ml primocin en plaats op nat ijs. </li><li> Plaats een biopsie in 5 ml gebufferde formaline en leg ze op nat ijs. </li><li> Plaats een biopsie in een kleine biopsie cryomold met een optimale snij-temperatuur compound. <ol><li> Onmiddellijk vallen deze vorm in een beker isopentaan geplaatst in vloeibare stikstof. Eenmaal bevroren, plaats de cryomold in een specimen zak en op te slaan op droog ijs in een piepschuim container. </li></ol></li></ol></li><li> Plaats de buisjes met biopten in medium of formaline in een afsluitbare zak en vervolgens in een scheepvaart doos met nat ijs. Seal en het etiket van de doos met een biologisch label en het vervoer naar het laboratorium. LET OP: De container die het droogijs bevat en bevroren biopsie wordt ook afgesloten en gelabeld met een biologisch label. </li></ol> 7. VerwerkingPatiënt Tissue voor Downstream Cultuur en Analyse <ol><li> Bij aankomst in het laboratorium, de overdracht van de bevroren biopsie op droog ijs tot -80 ° C vriezer voor downstream snijden of RNA-extractie. Plaats het monster in formaline. Opslaan in een 4 ° C koelkast en laat &#39;s nachts op te lossen. </li><li> Spin de resterende biopten neer op 300 xg, en zuig het medium. Voeg 10 ml Dispase oplossing van het conische buis, afdichting en laat het incuberen bij 37 ° C in een waterbad gedurende 15 min. </li><li> Na de incubatie, draai de biopten neer op 300 x g. Zuig het medium en resuspendeer biopsieën in 5 ml 0,05% trypsine-EDTA. </li><li> Breng de 5 ml trypsine-EDTA bevattende biopsies een 100 mm steriele plaat en gehakt biopsies middels 2 gesteriliseerde scheermesjes zo fijn mogelijk. </li><li> Breng de 5 ml trypsine-EDTA bevattende gehakt biopsieën in nieuw 15 ml conische. Spoel de plaat tweemaal met 5 ml 0,05% trypsine-EDTA en toevoegen kegelvormigebuis. Incubeer de buis gedurende 10 minuten in een 37 ° C waterbad. </li><li> Na de incubatie, draai de biopten neer op 300 xg (1,4 toeren) voor 5 min en zuig het medium. Voeg 5 ml voorwaardelijke herprogrammering medium de conische buis en de 5 ml voorwaardelijke herprogrammering medium dat het bestraalde voedingscellen (zie stap 5,7). </li><li> Voeg ROCK inhibitor (1 pi / ml) aan de 10 ml celsuspensie en plaat na het opzuigen van de gelatine weefselkweekschaal. Incubeer bij 37 ° C. </li></ol> 8. Het kweken en uitbreiden Cellen <ol><li> Na ongeveer 5 dagen kweken zuig het eerste medium dat gehakt biopsie stukjes en spoel de schaal 2-3 maal met 5 ml steriel PBS. Voeg nieuwe medium aan de plaat met inbegrip van ROCK-remmer bij 10 uM. </li><li> Bij het bereiken van 70% confluentie, uitbreiden van de cellen. Voeg 5 ml 0,05% trypsine-EDTA op de plaat en incuberen in een 37 ° C incubator hoogste 2,5 min te verwijderen the voedingscellen. Na deze incubatie zuig het trypsine-EDTA en spoel de plaat met 5 ml PBS. </li><li> Zuig het PBS en voeg 5 ml 0,25% trypsine-EDTA op de plaat en incubeer gedurende 5-10 min of totdat de cellen los van de plaat. Voeg gelijke hoeveelheden van medium aan de plaat om de reactie te stoppen en de overdracht van al het fluïdum naar een 50 mL conische buis en spin neer op 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer cellen in een bepaald volume van voorwaardelijke herprogrammering medium en meng 10 pi van de ophanging met 10 pi van trypan blauw. Reken op een hemocytometer totale aantal cellen te bepalen. </li><li> Cellen breiden, voeg 1.000.000 menselijke esophagus cellen een 150 mm plaat met 1,2 miljoen bestraalde 3T3 cellen in een totaal volume van 15 ml. Voeg frisse ROCK-remmer bij 10 pM en voeg de celsuspensie om een ​​gelatine beklede 150 mm schaal. </li></ol> 9. Freeze en Store Human Oesofageale epitheelcellen <ol><li> Om bevriezing medium te maken, voeg 10%DMSO voorwaardelijke herprogrammering medium. Na trypsinizing en tellen aliquot cellen te bevriezen in een nieuwe 50 ml conische buis en spin neer op 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het medium en voeg vriesmedium met een volume van 2 ml per cryoflesje. Zodra de celsuspensie homogeen, aliquot 10 6 cellen in gelabelde cyrovials. Breng in een houder invriezen bij -80 ° C gedurende ten minste 24 uur voor het verplaatsen van de flesjes voor langetermijnopslag vloeibare stikstof. </li></ol>

<ol><li>Clark, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+atresia+and+tracheoesophageal+fistula%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula.</a> Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).</li>
<li>Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+prevalence+of+eosinophilic+esophagitis+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Gastroenterol+Nutr%22%5BJournal%5D)">Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children.</a> J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).</li>
<li>Sjöqvist, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+orthotopic+transplantation+of+a+tissue-engineered+oesophagus+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats.</a> Nat Commun. 5, 3562(2014).</li>
<li>Saxena, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophagus+tissue+engineering%3A+designing+and+crafting+the+components+for+the+%27hybrid+construct%27+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach.</a> Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).</li>
<li>Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+ovine+esophageal+epithelial+cells+and+in+vitro+esophagus+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering.</a> Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).</li>
<li>Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophagus+tissue+engineering%3A+hybrid+approach+with+esophageal+epithelium+and+unidirectional+smooth+muscle+tissue+component+generation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastrointest+Surg%22%5BJournal%5D)">Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro.</a> J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).</li>
<li>Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+isolation+of+epithelial+cells+from+ovine+esophagus+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater+Eng%22%5BJournal%5D)">A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering.</a> Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).</li>
<li>Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Mouse+Models+in+Dissecting+the+Mechanism+of+Human+Eosinophilic+Gastrointestinal+Diseases+%28EGID%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol+Hepatol+Res%22%5BJournal%5D)">Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID).</a> J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).</li>
<li>Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Problems+and+Advantages+when+Applying+them+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine.</a> Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).</li>
<li>Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering tissue from human embryonic stem cells.</a> J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).</li>
<li>Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+an+argument+for+continued+research+on+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells.</a> Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).</li>
<li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2013).</li>
<li>Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+system+for+differentiation+of+intestinal+epithelium+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells.</a> Sci Rep. 5, 17297(2015).</li>
<li>Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human alveolar epithelial cells.</a> Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).</li>
<li>Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+and+human+tissue-engineered+esophagus+form+from+sufficient+stem%2Fprogenitor+cells+and+do+not+require+microdesigned+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+urothelial+cells+in+vitro%3A+proliferation+and+induction+of+stratification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification.</a> Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Geraghty, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+cell+lines+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of cell lines in biomedical research.</a> Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).</li>
<li>Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLodish%2C+H+%22Molecular+Cell+Biology%22">Molecular Cell Biology</a>. , W.H. Freeman. New York. (2000).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li>
<li>Davis, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+that+retains+epithelial+characteristics+after+prolonged+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).</li>
<li>Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+inflammation+on+the+proliferation+of+human+gingival+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro.</a> J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De belangrijkste stappen om te isoleren en vergroten esophageal epitheelcellen van patiënt biopsies zijn: 1) voldoende dissociëren biopsie weefsel met minimale celdood; 2) zorgen ROCK inhibitor wordt toegevoegd aan het celkweekmedium bij elke mediumverversing; 3) Gebruik niet meer feeder-cellen dan aanbevolen; 4) handhaven van een schone aseptische cultuur; en 5) passage cellen vlak voor het bereiken van samenvloeiing. Door de patiënt verschillen in biopsie monsters verkregen voor voorwaarde...

Slokdarmkanker tissue engineering en eosinofiele esophagitis (EoE) hebben de focus van het onderzoek in veel laboratoria de afgelopen tien jaar geweest. Aangeboren afwijkingen, zoals slokdarmatresie worden waargenomen bij ongeveer 1 op 4000 levendgeborenen, waardoor de onvolledige ontwikkeling van de slokdarm leidt tot het onvermogen om te eten 1. De incidentie en prevalentie van EoE hebben op de stijging sinds de identificatie van de ziekte entiteit 1993. De incidentie van EoE varieerde 0,7-10 / 100.000 per jaar en de prevalentie varieerde 0,2-43 / 100.000 2 geweest. Een aantrekkelijke nieuwe chirurgische benadering van de behandeling lange periode slokdarmatresie bestaat uit het genereren van weefselconstructen voor implantatie gebruikmaking eigen cellen van de patiënt. Deze cellen samen met synthetische steigers zullen autologe construct die geen immunosuppressie vereist genereren. Sommige groepen zijn al begonnen met het ons te onderzoekene van stamcellen-achtige cellen slokdarm weefselmanipulatie 3 en het gebruik van natieve slokdarm epitheelcellen aan het slijmvlies herbevolking 4-7. Ziekten die in de slokdarm van pediatrische patiënten zijn vaak moeilijk te diagnosticeren of te bestuderen zonder tussenkomst. Bovendien, met behulp van diermodellen of in vitro onsterfelijk gemaakte cellijn modellen voor pediatrische ziekten zoals EoE omvatten niet de exacte pathogenese van de ziekte of de patiënt specifieke 8 verschillen. Daarom is de mogelijkheid om ziekteproces een patiënt in vitro bestuderen teneinde specifieke ziekte triggering antigenen te identificeren, evalueren en onderliggende mechanismen te onderzoeken drugbehandelingen nieuw zouden zijn en een clinici informatie die kan helpen bij de behandeling van patiënten. Er zijn veel autologe of patiënt-specifieke celtypen die voor gebruik in tissu voorgesteld geweeste engineering en de studie van de menselijke ziekte pathogenese. Enkele van deze celtypen zijn beperkt in hun vermogen om voldoende cellen van een specifiek fenotype genereren een grote scaffold zaad of voer high throughput in vitro studies. Het gebruik van pluripotente of multipotente stamcellen is het onderwerp van veel onderzoek gediscussieerd echter beperkingen en tekortkomingen van het gebruik van deze cellen zijn goed beschreven 9. Het gebruik van menselijke embryonale stamcellen is zeer besproken en presenteert een groot aantal ethische kwesties. Belangrijker, deze cellen vormen teratomas, die vergelijkbaar met een tumor, als ze niet worden onderscheiden van hun pluripotente toestand voor het leveren ze in een levende gastheer 10. Bovendien zou het gebruik van embryonale stamcellen patiënt-specifiek en zou een allogene reactie en de noodzaak van immuunsuppressie 10 opwekken. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn pluripotente cellen die kunnenworden afgeleid uit eigen cellen van de patiënt. Somatische cellen, zoals huidcellen, kunnen worden geïnduceerd om een ​​pluripotente toestand met verschillende geïntegreerde als niet-geïntegreerde technieken. Deze cellen dienen dan als een patiënt-specifieke cel bronnen voor tissue engineering of de ziekte van onderzoek. De integratie van ongewenst genetisch materiaal in deze cellen is veel zorg omschreven en zelfs als sequenties volledig verwijderd lijken iPSCs een epigenetische &quot;memory&quot; naar het celtype waaruit ze zijn afgeleid 11 behouden. Deze cellen zullen teratomas vormen in vivo als niet vóór transplantatie 11 gedifferentieerd. Vele differentiatie protocollen zijn onderzocht gericht op epitheliale lijnen 12, 13, 14, echter, is het zeer belangrijk op te merken dat de celtypen verkregen eind differentiatie niet homogeen en only hebben een fractie van het celtype. Dit resulteert in een lage opbrengst en de noodzaak om het gewenste celtype te zuiveren. Hoewel iPSCs zijn een potentiële patiënt-specifieke cel bron, het proces voor het verkrijgen van een celtype van belang zijn voor beide tissue engineering of de ziekte van onderzoek is zeer inefficiënt. Menselijke epitheelcellen met succes geïsoleerd uit een verscheidenheid aan zowel zieke als niet-zieke weefsels in het menselijk lichaam met inbegrip van: 15 long-, borst- 16, 17 dunne darm, colon 18, blaas 19 en de slokdarm 20. Het is belangrijk op te merken dat de humane primaire cellen een eindig aantal passages waarin het fenotype wordt gehandhaafd 21, 22. Helaas betekent dit dat het aantal cellen nodig zijn voor ziekte onderzoek of zaaien een aangelegde scaffoldvoor implantatie niet wordt verkregen. Daarom zijn nieuwe technieken die nodig zijn om de patiënt cellen uit te breiden, terwijl nog steeds een epitheliale fenotype behoud. Voorwaardelijke herprogrammering van normale en kankercellen epitheelcellen gebruik te maken van feeder-cellen en ROCK-remmer werd in 2012 beschreven door Liu et al. 2 3. Deze techniek werd gebruikt om kankercellen epitheelcellen verkregen uit biopsieën van prostaatkanker en borstkanker gebruikt bestraalde voedingscellen, ROCK inhibitor en voorwaardelijke herprogrammering medium breiden. Het doel was om voldoende cellen voor in vitro assays zoals drugs screenen. Deze techniek kan uitbreiden epitheelcellen onbeperkt door &quot;herprogrammering&quot; deze cellen een stam- of voorouder-achtige toestand, die zeer proliferatieve. Het is aangetoond dat deze cellen niet-tumorigene en hebben het vermogen om teratomas 23, 24 vormen bezitten. Bovendien is er geenchromosomale abnormaliteiten of genetische manipulaties waren aanwezig na passage van deze cellen in kweek deze techniek 23, 24. Belangrijker, deze cellen zijn alleen in staat te differentiëren in de natieve celtype plaats. Daarom biedt deze techniek een groot reservoir van patiënt specifieke epitheelcellen voor ziekte onderzoek of weefselmanipulatie zonder de noodzaak voor immortalisatie. Verkrijgen epitheelweefsel van een specifiek orgaan om ziekteprocessen bestuderen vaak beperkt is en niet altijd mogelijk vanwege het risico patiënt. Voor die patiënten met oesofageale ziekte of gebreken, endoscopische biopsie retrieval is een minimaal invasieve benadering voor het verkrijgen van epitheelweefsel die kunnen worden gedissocieerd en voorwaardelijk geherprogrammeerd onbepaalde celbron die specifiek is voor het slijmvlies van de slokdarm van die patiënt. Dit zorgt dan voor in vitro studiesvan de epitheelcellen ziekteprocessen en onderzoeken op mogelijke therapeutische evalueren. Een ziekteproces die sterk kunnen profiteren van deze aanpak is eosinofiele oesofagitis, die is beschreven als allergische aandoening van de slokdarm 8. Allergietesten en therapeutische benaderingen kunnen in vitro worden geëvalueerd middels eigen epitheelcellen van de patiënt en deze informatie kan dan binnen de behandelend arts worden doorgegeven geïndividualiseerde behandelingen te ontwikkelen. De techniek van voorwaardelijke herprogrammering in samenhang met het verkrijgen endoscopische biopten van pediatrische patiënten biedt de mogelijkheid om normale slokdarm epitheelcellen onbeperkt uitbreiden van een patiënt. Deze cel bron kan dus samen worden samen met natuurlijke of synthetische steiger aan een patiënt-specifieke chirurgische optie voor gebreken, ziekte of trauma te bieden. Het hebben van een onbepaald aantal cellen zou helpen engineer oesofageale constructies die beschikken over een volledig reseededlumen met oesofageale epitheelcellen om te helpen regenereren van de overblijvende celtypen vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>Primocin</td><td>InVivogen</td><td>ant-pm2</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258-1L</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin From Porcine Skin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>TissueTek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Cryomatrix OCT</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tubes</td><td>Denville Scientific</td><td>C1017-p</td><td></td></tr><tr><td>Complete Keratinocyte Serum Free Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10724011</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ml</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td><td>Fisher Scientific</td><td>125410</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Medium&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Dishes</td><td>Denville Scientific</td><td>T1110-20</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Dishes</td><td>Denville Scientific</td><td>T1115</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conicals</td><td>Denville Scientific</td><td>&nbsp; C1062-9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811</td><td></td></tr><tr><td>9" Pasteur Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL1658</td><td></td></tr></tbody></table>

voorwaardelijke herprogrammeren van pediatric human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in tissue engineering and disease investigation

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Het identificeren en uitbreiden van patiëntspecifieke cellen in cultuur voor gebruik in weefselengineering en ziekteonderzoek kan zeer uitdagend zijn. Het gebruik van verschillende soorten stamcellen om de interessante celtypen te verkrijgen is vaak kostbaar, tijdrovend en zeer inefficiënt. Bovendien moeten ongewenste celtypen worden verwijderd voordat deze celbron wordt gebruikt, wat een extra stap in het proces vereist. Om voldoende slokdarmslijmvliescellen te verkrijgen om de holte van een slokdarmconstructie te ontwerpen of therapeutische benaderingen voor de behandeling van slokdarmziekten te screenen, moeten inheemse slokdarmslijmvliescellen worden uitgebreid zonder hun genexpressie of fenotype te veranderen. Conditionele herprogrammering van slokdarmslijmvliesweefsel biedt een veelbelovende aanpak voor het uitbreiden van patiëntspecifieke slokdarmslijmvliescellen. Bovendien hoeven deze cellen niet te worden gesorteerd of gezuiverd en zullen ze terugkeren naar een volwassen epitheeltoestand nadat ze uit de conditionele herprogrammeringscultuur zijn verwijderd. Deze techniek is beschreven in veel kankerscreeningsstudies en maakt een onbepaalde uitbreiding van deze cellen over meerdere passages mogelijk. De mogelijkheid om slokdarmscreeningsassays uit te voeren, zou de behandeling van pediatrische slokdarmziekten zoals eosinofiele oesofagitis kunnen revolutioneren door het identificeren van het triggermechanisme dat de symptomen van de patiënt veroorzaakt. Voor die patiënten die lijden aan een aangeboren defect, ziekte of verwonding van de slokdarm, zou deze celbron kunnen worden gebruikt als een middel om een synthetisch construct te zaaien voor implantatie om het aangetaste gebied te repareren of te vervangen.

Een overzicht van de belangrijkste stappen bij het isoleren esophageal epitheelcellen van patiënt biopsies wordt samengevat in figuur 1. Kolonies van epitheelcellen wordt gevormd in ongeveer 4-5 dagen en wordt omringd door fibroblast feeder-cellen (Figuur 2A). Aangezien deze kolonies uit te breiden zullen zij fuseren met andere kolonies tot grotere kolonies (figuur 2B) te vormen. Zodra de kweken 70% confluent zijn geworden, moeten ze wor...

Uitbreiding van menselijke kinderen oesofageale epitheelcellen gebruikmaking voorwaardelijke herprogrammering biedt onderzoekers met een patiënt-specifieke populatie van cellen die kunnen worden gebruikt voor de engineering oesofageale constructen autologe implantatie defecten of letsel behandelen en dienen als een reservoir voor therapeutische screeningstesten.

Voorwaardelijke herprogrammeren van Pediatric Human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in Tissue Engineering and Disease Investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Het algemene doel van deze procedure is het expanderen van patiënt-afgeleide oesofageale epitheelcellen uit endoscopische biopten om oesofageale ziekten te bestuderen, of om een 3D-oesofageaal steunstructuur te creëren voor vervolgmodellering of vervanging van oesofageaal weefsel. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van oesofageale epitheelcellen bij oesofageale ziekten beter te begrijpen. Ze kunnen ook worden gebruikt om 3D-steunstructuren te maken voor modellering of implantatie.Het voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om patiëntspecifieke epitheelcellen te genereren uit een zeer klein stukje weefsel, zonder dat er genetische of permanente modificaties nodig zijn. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het begrijpen van de pathogenese van eosinofiele oesofagitis, evenals het ontwikkelen van behandelingen voor oesofageale atresie en eosinofiele oesofagitis. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben met het volledig verwijderen van de feeder-cellen voorafgaand aan het oogsten van menselijke oesofageale epitheelcellen om de zuiverheid te behouden.Christopher Foster, een technicus uit ons laboratorium,

conditional-reprogramming-pediatric-human-esophageal-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven een methode om humane enteroïden te kweken uit kleine darmcrypten en colonoïden uit coloncrypten die zijn verzameld uit zowel chirurgisch weefsel als biopsieën. In dit methodologische artikel presenteren we de kweekmodaliteiten die essentieel zijn voor het succesvolle groeien en onderhouden van humane enteroïden en colonoïden.

Oprichting van Human Epithelial Enteroids en Colonoids van Whole Tissue en Biopsie

Dit manuscript beschrijft de productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een tissue engineered 3D-oesofageale construct bereid uit normale primaire menselijke slokdarm fibroblast en squameuze epitheelcellen gezaaid binnen een de-cellularized varkens schavot. De resultaten tonen de vorming van een volwassen gelaagd epitheel gelijk aan de normale menselijke esophagus.

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Deze publicatie toont methoden voor succesvol bemonsteren en kweken van nasale epitheliale mucosa van kinderen, en het herprogrammeren van deze cellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's).

Cultiveren primaire nasale epitheelcellen van Kinderen en Programmeer in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Slokdarmreconstructie is een uitdagende procedure, en de ontwikkeling van een weefsel-engineered slokdarm die regeneratie van slokdarmslijmvlies en spier mogelijk maakt en die kan worden geïmplanteerd als een kunstmatige graft is noodzakelijk. Hier presenteren we ons protocol om een kunstmatige slokdarm te genereren, inclusief steigerproductie, bioreactorteelt en verschillende chirurgische technieken.

Tissue-Engineered Graft voor circumferential slokdarmreconstructie bij ratten

Het protocol beschrijft een beeldvormingsgerichte bioreactor die de selectieve verwijdering van het endogene epitheel uit de rattenluchtpijp en homogene verdeling van exogene cellen op het lumenoppervlak mogelijk maakt, gevolgd door langdurige in vitro kweek van het celweefselconstruct.

Imaging-guided bioreactor voor het genereren van bio-technisch luchtwegweefsel

Het huidige protocol beschrijft de mogelijkheden en de essentiële kweekmodaliteiten van de Open-Top Organ-Chip voor de succesvolle vestiging en rijping van organ-on-chip culturen van volledige dikte van primaire weefsels (huid, alveolus, luchtwegen en darm), waardoor de mogelijkheid wordt geboden om verschillende functionele aspecten van de menselijke epitheliale / mesenchymale en vasculaire niche-interface in vitro te onderzoeken.

Reconstitutie cytoarchitectuur en functie van menselijke epitheelweefsels op een open-top orgaanchip

Organoïde-fibroblast co-culturen bieden een model om de in vivo stamcelniche te bestuderen. Hier wordt een protocol voor slokdarmorganoïde-fibroblast co-culturen beschreven. Bovendien wordt beeldvorming van de hele montage gebruikt om de fibroblast-organoïde interactie te visualiseren.

Functionele karakterisering en visualisatie van slokdarmfibroblasten met behulp van organoïde coculturen

Hier wordt een protocol verstrekt voor de cultuur van menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistof-interfacecultuur. De lucht-vloeistofinterfacecultuur van slokdarmorganoïden kan worden gebruikt om de impact van cytokines op de slokdarmepitheelbarrière te bestuderen.

Driedimensionale celkweekmodellen om de epitheelbarrière bij eosinofiele oesofagitis te onderzoeken 

Het huidige protocol beschrijft de opstelling en histologische analyse van slokdarmorganoïdemodellen die verschillende stadia van tumorprogressie vertegenwoordigen. Deze methode stelt onderzoekers in staat om veranderingen in cellulaire morfologie, ruimtelijke organisatie en moleculaire markerexpressiepatronen te bestuderen tijdens de overgang van normale naar kankerweefsels.

Oprichting en histologische analyse van slokdarmorganoïden die de progressie van normale naar kankerachtige weefsels modelleren

Leer voorwaardelijke herprogrammering van slokdarmepitheelcellen uit endoscopische biopten zonder genetische modificatie. Deze methode ondersteunt ziekteonderzoek en weefselengineering voor therapeutische toepassingen.

Voorwaardelijke herprogrammeren van Pediatric Human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in Tissue Engineering and Disease Investigation (Video) | JoVE Journal

Voorwaardelijke herprogrammeren van Pediatric Human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in Tissue Engineering and Disease Investigation

Meer video's verkennen