MitoCeption: overbrengen geïsoleerde menselijke MSC Mitochondriën aan glioblastoma Stamcellen
22 februari 2017
Hier, wordt een protocol (MitoCeption) voorgelegd aan mitochondriën geïsoleerd uit menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) over te dragen, glioblastoma stamcellen (GSC), met als doel het bestuderen van hun biologische effecten op het metabolisme en de functies SGR. Een soortgelijk protocol kan worden aangepast aan mitochondriën dragen tussen andere celtypen.
Het algemene doel van deze procedure is om eerder geïsoleerde mitochondriën van donorcellen zoals mesenchymatische stamcellen over te brengen naar doelcellen zoals glioblastoom-stamcellen. Deze procedure kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van metabolisme, zoals de metabolische en biologische effecten van de mitochondriën die spontaan tussen cellen worden overgedragen door processen zoals tunneling nanobuisjes of microvesikels. Het grote voordeel van deze techniek is dat de effecten van de mitochondriën onafhankelijk kunnen worden beoordeeld van andere factoren in de micro-omgeving, zoals cytokinen of metabolieten en ook van andere verbindingen die ook in de tunneling nanobuisjes kunnen worden getransporteerd.
Voor beeldvormingsdoeleinden kunnen MSC-mitochondriën en GSC worden gelabeld met vitale kleurstoffen vóór de mitochondriënoverdracht door MitoCeption. Om te beginnen, verzamel na het vooraf labelen van GSC's met vitale kleurstoffen volgens het tekstprotocol, GSC-neurospheren in een buis van 50 milliliter door centrifugeren bij 270 keer g bij 20 graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik vijf milliliter HBSS om de cellen te wassen en de buis opnieuw te centrifugeren.
Zuig de supernatant op en hersuspendeer voorzichtig de GSC-pellet met 100 microliter 0,25% Trypsin-EDTA. Bewerk de cellen vervolgens gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 10 microliter 20 millimolair calciumchloride toe in twee microliter bij 10 milligram per milliliter DNase I in de buis.
Dissocieer de neurospheren door met een P200 pipet voorzichtig 30 tot 50 keer op en neer te pipetten en de vorming van bellen te vermijden. Voeg 10 microliter 5% Trypsine-remmer toe in 10 milliliter HBSS aan de cellen en centrifugeer de GSC's gedurende zeven minuten. Gooi vervolgens de supernatant en 10 milliliter GSC-basismedium weg in het monster.
Tel nu, met behulp van een Thoma-telkamer, de cellen voordat u opnieuw centrifugeert. Voeg het juiste volume GSC-proliferatiemedium toe om een cellulair concentraat van 10 tot de zesde GSC's per milliliter te bereiken. Zaai vervolgens 10 tot de vijfde GSC's per putje van een 96-welplate.
Centrifugeer de plaat zodat de GSC's op de bodem van de putjes bezinken. Controleer de cellen onder de microscoop. Bewerk de plaat vervolgens bij 37 graden Celsius.
Om de isolatie van MSC-mitochondriën uit te voeren, begint u door de temperatuur van de microcentrifuge in te stellen op vier graden Celsius. Bereid twee buizen van 1,5 milliliter voor, gelabeld A en C, die reagentia bevatten voor de extractie van mitochondriën. Bereid twee extra buizen voor, gelabeld MSC en MiTo.
Houd de buizen op ijs. Bereid ook buizen voor voor de seriële verdunning van mitochondriën die worden ingesteld met de mitochondriënvoorbereiding. Gebruik 10 milliliter PBS, voorverwarmd tot 37 graden Celsius, om de MSC's te wassen.
Was vervolgens de cellen gedurende 10 seconden met twee milliliter EDTA-vrij Trypsin en voeg een extra milliliter Trypsin toe voordat u de cellen gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 graden Celsius bewerkt. Het gebruik van EDTA moet worden vermeden volgens het protocol, in het bijzonder voor MSC Trypsinisatie en voor proteaseremmer die wordt gebruikt in de mitochondriënvoorbereiding. Herstel de MSC's door 10 milliliter Alpha MEM 10%FBS toe te voegen en breng de suspensie over in een buis van 50 milliliter.
Centrifugeer vervolgens de cellen. Gooi de supernatant weg en voeg 10 milliliter Alpha MEM 10%FBS toe aan het cellulair pellet. Gebruik vervolgens een Malassez-telkamer om de MSC's te tellen voordat u vier tot vijf keer 10 tot de vijfde cellen opnieuw centrifugeert.
Gooi de supernatant weg, voeg een milliliter ijskoud Alpha MEM 10%FBS toe aan het cellulair pellet en breng de cellen over naar de eerder voorbereide MSC-gelabelde buis terwijl u deze op ijs blijft houden. Centrifugeer vervolgens de MSC-buis bij 900 keer g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten en verwijder al het resterende medium uit de buis. Voeg vervolgens 200 microliter mitochondriënisolatiereagens A toe met EDTA-vrije proteaseremmers aan de MSC's en vortex gedurende vijf seconden op gemiddelde snelheid.
Laat vervolgens de buizen precies twee minuten op ijs staan. Voeg 2,5 microliter mitochondriënisolatiereagens B toe en vortex de cellen met maximale snelheid gedurende 10 seconden voordat u de buizen weer op ijs legt. Herhaal het vortexen elke 30 seconden gedurende vijf minuten.
Voeg nu 200 microliter mitochondriënisolatiereagens C toe met EDTA-vrije proteaseremmers aan de buis en meng de inhoud door de buis ongeveer 30 keer te kantelen. Centrifugeer de buizen bij 700 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng het supernatant dat de MSC-mitochondriën bevat over naar de eerder bereide MiTo-buis.
Centrifugeer het monster bij 3.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Gooi na het weggegooien van de supernatant 200 microliter reagens C weg om het mitochondriale pellet te spoelen. Draai vervolgens de suspensie bij 12.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten om de organellen te bezinken.
Om geïsoleerde MSC-mitochondriën over te brengen naar GSC's, voegt u 200 microliter voorgekoeld GSC-proliferatiemedium toe aan het mitochondriale pellet. Verdun het mitochondriale preparaat in GSC-proliferatiemedium om consistent de toevoeging van 20 microliter mitochondriale suspensie aan de GSC's mogelijk te maken. Voeg vervolgens langzaam de mitochondriën dicht bij de bodem van de put toe.
Om lekkage van vitale kleurstoffen van MSC-mitochondriën te controleren, voegt u dezelfde hoeveelheid mitochondriënvoorbereiding toe aan de putjes van een 96-welplate die alleen GSC-proliferatiemedium bevat. Centrifugeer de platen bij 1.500 keer g bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Plaats vervolgens de culturen onmiddellijk bij 37 graden Celsius.
De volgende dag, om de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol genaamd MitoCeption voor het overdragen van mitochondriën van menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) naar glioblastoomstamcellen (GSC). Het doel is om de biologische effecten van deze mitochondriën op het metabolisme en de functies van GSC te onderzoeken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Metabolisme
Achtergrond
- Mitochondriën kunnen tussen cellen worden overgedragen via mechanismen zoals tunnelbuisjes.
- Deze overdracht kan het cellulaire metabolisme en de functie beïnvloeden.
- Het begrijpen van deze effecten kan inzicht bieden in de kankerbiologie.
- De techniek maakt een onafhankelijke beoordeling van mitochondriale effecten mogelijk.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor mitochondriële overdracht met gebruik van MSC en GSC.
- Het onderzoeken van de metabole en biologische effecten van overgedragen mitochondriën.
- Het beoordelen van mitochondriële effecten zonder interferentie van de micro-omgeving.
Gebruikte methoden
- Isolatie van mitochondriën uit MSC.
- Labeling van MSC en GSC met vitale kleurstoffen.
- Centrifugatie om GSC-neurosferen te verzamelen.
- Overdracht van mitochondriën met behulp van het MitoCeption-protocol.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt een succesvolle overdracht van mitochondriën tussen celtypen mogelijk.
- De biologische effecten van de overgedragen mitochondriën kunnen worden gemonitord.
- Een onafhankelijke beoordeling van de mitochondriële functie is haalbaar.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van het kankermetabolisme.
Conclusies
- MitoCeption biedt een waardevol instrument voor mitochondriaal onderzoek.
- Deze methode kan het begrip van het celmetabolisme bij kanker verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen het protocol aanpassen voor andere celtypen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Mitochondriale overdracht tussen stamcellen en kankercellen vormt een mechanistische as in het tumormetabolisme en therapeutische resistentie. Het MitoCeption-protocol maakt een geïsoleerde beoordeling mogelijk van de effecten van exogene mitochondriën op glioblastoomstamcellen, wat bijdraagt aan het verminderen van risico's bij het identificeren van targets in oncologisch geneesmiddelenonderzoek. Deze aanpak biedt een gecontroleerd systeem om metabole herprogrammering en fenotypische plasticiteit gedreven door mitochondriale uitwisseling te evalueren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar mitochondriële overdracht als therapeutische hypothese in het metabolisme van glioblastoomstamcellen mogelijk.
- Operationele waarde: Isoleert mitochondriële effecten van micro-omgevingsfactoren zoals cytokinen en metabolieten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanische risicoreductie door kwantificering van mitochondriële DNA-overdracht en functionele read-outs via FACS en confocale beeldvorming.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert dosisafhankelijke metrieken voor mitochondriële overdracht met behulp van fluorescente labeling en flowcytometrie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de isolatie van mitochondriën en de overdrachtsomstandigheden voor een reproduceerbare assay-prestatie.
- Schaalbaarheid: Aanpasbaar naar 96-well plaatformaten voor medium-throughput screening van mitochondriële modulatoren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt mitochondriale overdracht met veranderingen in celproliferatie, plasticiteit en therapierespons in GSC's.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale tracking van overgedragen mitochondriën mogelijk via haplotype-specifieke mtDNA-kwantificatie.
- Translationele continuïteit: Biedt een ziekterellevant systeem om spontane mitochondriale uitwisseling in tumormicro-omgevingen te modelleren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het MitoCeption-protocol past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door mechanistische ondervraging van mitochondriale overdracht mogelijk te maken voorafgaand aan de fasen van targetvalidatie en lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over mitochondriële uitwisseling als modulator van fenotypen van kankerstamcellen.
- Screening: Levert kwantitatieve fluorescentie- en imaging-uitlezingen voor assay-standaardisatie en hit-bevestiging.
- Analytics: Biedt FACS-gebaseerde kwantificering van mitochondriële transfer en confocale lokalisatiegegevens voor comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt metrieken van mitochondriële transfer aan functionele uitkomsten in modellen voor proliferatie en therapieresistentie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor mitochondriële transfer dat toepasbaar is op meerdere donor-doelcelcombinaties.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in hypothesen gericht op mitochondriën door organelspecifieke effecten te isoleren.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor mitochondriële isolatie, labelen en transfer.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door risico's met betrekking tot mitochondriële mechanismen in glioblastoommodellen te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van de efficiëntie van mitochondriële transfer en de functionele gevolgen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, mitochondriële isolatie en fluorescentiegebaseerde detectiemethoden.
- Afhankelijk van toegang tot centrifuges, flowcytometers, confocale microscopen en infrastructuur voor kleuring met vitale kleurstoffen.
- vereist standaardisatie van de kwaliteit van de mitochondriële preparatie en het tijdstip van overdracht tussen experimentele batches.
- Aanpassing aan neurosfeer- versus monolayer-doelcellen vereist optimalisatie van de dissociatie- en uitzaaiingscondities.
- Praktische beperkingen omvatten een lagere overdrachtsefficiëntie in neurosfeerkweken vergeleken met gedissocieerde enkelcelpreparaten.
