Name: Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Leer intacte mitochondriën isoleren uit skeletspier door differentiële centrifugatie voor hoogresolutie-respirometrie. Deze methode meet ademhalingsactiviteit van complexen I, II en IV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd ondersteund door de Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).

De quadriceps spieren biopsie wordt genomen uit een verdoofd varken, waarvan mitochondria geïsoleerd door differentiële centrifugatie. Het varken wordt daarna gebruikt voor een ander experiment. Het onderzoek wordt uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en met de goedkeuring van de Animal Care Committee van het kanton Bern, Zwitserland. 1. Skeletal Muscle homogenisering en Mitochondriale Isolation <ol><li> Accijnzen 5-10 g quadriceps specimen van een verdoofde varkens. In deze assay gebruikt varkens skeletspieren. Dit protocol kan ook gebruikt worden om mitochondriën uit andere soorten te isoleren (bijvoorbeeld rat, muis, mens, enz.). OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd door een medisch specialist met expertise in de chirurgie. <ol><li> Sedate varkens intramusculair ketamine (20 mg / kg) en xylazine (2 mg / kg), voor anesthesie geïnduceerd met intraveneuze midazolam (0,5 mg / kg, plus atropine 0,02 mg / kg). Onderhouden anesthesie met continue intraveneuze infusie van propofol (4-8 mg / kg per h) en fentanyl (30 ug / kg per h) gedurende de operatie. </li></ol></li><li> Onmiddellijk Dompel het weefselmonster in een bekerglas met 20 ml ijskoude mitochondriale isolatie buffer (Tabel 1). OPMERKING: Buffers die tijdens homogeniseren en centrifugeren moet ijskoud zijn en een fysiologisch relevante pH met een ionische sterkte en osmotische geschikt cytosol. </li><li> Weeg het weefselmonster in de beker op een analytische weegschaal getarreerd. Tarreer de balans met het bekerglas met 20 ml isolatiebuffer. </li><li> Plaats het bekerglas op een ijsemmer. LET OP: Voer alle van de volgende stappen voor de homogenisering procedure bij de ijsemmer temperatuur en houden alle buffers op het ijs emmer. </li><li> Hak de skeletspier in de beker (te houden op het ijs) in 1-2 mm kleine stukjes voor 3-4 min met behulp van fijne scissors. </li><li> Spoel het gehakt weefsel in het bekerglas tweemaal met ijskoude isolatiebuffer (20 ml per wasstap). </li><li> Suspendeer het weefsel in 10 volumina van de isolatiebuffer weefsel per gewicht (g) die 5 mg protease / g weefsel. </li><li> Plaats het bekerglas in een ijsbad op de magneetroerder en roer gedurende 10 min. </li><li> Verdun de suspensie in het bekerglas met extra 10 volumes isolatiebuffer het weefsel per gewicht (g) aangevuld met 0,2% (w / v) ontvette runderserumalbumine (BSA). </li><li> Decanteren alle isolatie buffer aangevuld met 0,2% BSA en spoel het weefsel in het bekerglas tweemaal met ijskoude isolatiebuffer aangevuld met 0,2% BSA (20 ml per wasstap). </li><li> Resuspendeer het weefsel in 10 volumes isolatiebuffer weefsel per gewicht (g) aangevuld met 0,2% BSA met ontvette. </li><li> Homogeniseren het weefsel met een semi-automatische glazen homogenisator (bewaard op ijs) met een wijde stamper (10 slagen). LET OP: Homogenize het weefsel altijd op dezelfde manier (evenveel slagen, bijvoorbeeld 10 slagen). Een hoger aantal slagen kunnen beschadigen en ontkoppelen van de mitochondriën. Voorkeur Homogeniseer het weefsel met behulp van een geautomatiseerde homogenisator. Handmatig (en subjectief) gehomogeniseerd weefselmonsters in glazen homogenisatoren kunnen verschillende kwaliteiten van geïsoleerde mitochondria te produceren. </li><li> Centrifugeer het gehomogeniseerde weefsel bij 4 ° C gedurende 10 min bij 10.000 x g. OPMERKING: Alle centrifugeren stappen worden uitgevoerd in centrifuges met vaste hoek rotors. </li><li> Verwijder het supernatant met behulp van een serologische pipet en resuspendeer de pellet in BSA-gesupplementeerd ijskoude isolatiemedium (10 ml / g weefsel). </li><li> Centrifugeer de suspensie bij 4 ° C gedurende 10 min bij 350 x g. </li><li> Reserveer de bovenstaande vloeistof met behulp van een serologische pipet en gooi de pellet (cellulaire afval). </li><li> Filtreer de bovenstaande vloeistof in een bekerglas (op ijs gehouden) via twee lagen gaas (17 draden / cm 2) naar cel DEBR verwijderenis. </li><li> Centrifugeer de gefilterde suspensie bij 4 ° C gedurende 10 min bij 7000 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in ruwe mitochondriale isolatie buffer (5 ml / g weefsel) aangevuld met 0,2% (w / v) BSA en centrifugeer de suspensie bij 4 ° C gedurende 10 min bij 7000 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in ruwe mitochondriale wasbuffer (tabel 1). Centrifugeer de suspensie opnieuw bij 4 ° C gedurende 10 min bij 7000 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in ruwe mitochondriale wasbuffer en centrifugeer de suspensie opnieuw bij 4 ° C gedurende 10 min bij 7000 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de ruwe mitochondriale pellet in 1,0 ml wasbuffer. </li><li> Bepaal de eiwitconcentratie van de mitochondriale schorsing en houden de geconcentreerde mitochondriale schorsing op ijs. OPMERKING: Eiwit-concentratie kan worden gemeten met behulp van een standaardmethode. </li><li> net voorte testen respirometrie, resuspendeer de mitochondriale ademhaling suspensie in de buffer tot een eindconcentratie van 0,4 mg / ml mitochondriaal eiwit. </li></ol> 2. Hoge-resolutie respirometrietest <ol><li> Pipetteer 2,1 ml ademhaling buffer (Tabel 1) 16 in een hoge-resolutie oxygraph kamer en roer de buffer continu met een magnetische roerstaaf in de kamer (700 rpm) bij 37 ° C gedurende 1 uur totdat een stabiele zuurstofflux signaal polarografische de zuurstofsensor wordt verkregen. LET OP: Polarografische zuurstof elektroden binnen elke oxygraph kamer meet de zuurstofconcentratie en bereken zuurstofverbruik (flux) in elke kamer. De zuurstofconcentratie en zuurstofverbruik (flux) worden real-time online in een computer met behulp van software voor data-acquisitie en analyse. Bovendien, om nauwkeurige en betrouwbare resultaten, moeten instrumentele zuurstof achtergrondcorrectie wordenuitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. OPMERKING: Nauwkeurig 2,1 ml ademhaling buffer wordt toegevoegd aan de kamer voor kalibratie van een definitieve kamervolume van 2,0 ml na het sluiten van de stoppers. </li><li> Voer een lucht kalibratie van het polarografische zuurstofsensor volgens de protocollen van de fabrikant 17. OPMERKING: Bij lucht kalibratie met een gasfase aanwezig is, zal de media zuurstofconcentratie equilibreren in de orde van 15-20 minuten. Afhankelijk van de temperatuur, luchtdruk en oplosbaarheid van concentratie media -oxygen kan worden berekend. </li><li> Na de lucht kalibratie, zuigen de ademhaling medium uit de oxygraph kamer en voeg 2,1 ml van geïsoleerde mitochondriale suspensie (0,4 mg / ml mitochondriaal eiwit) uit stap 1,24 tot een kamer van het oxygraph. LET OP: Het volume van de ademhaling buffer is afhankelijk van de set-up instrument en fabrikant. Voor hoge resolutie respirometrie, de 2,1 ml van de ademhaling buffer wordt toegevoegd aan de kamer voor kalibratie van een definitieve kamervolume van 2,0 ml na het sluiten van de stoppers. </li><li> Sluit de oxygraph kamer door het inbrengen van de stop. </li><li> Roer de mitochondriale suspensie continu met een magnetische roerstaaf in de kamer (700 rpm) bij 37 ° C en opnemen cellulaire ademhaling bij basislijn gedurende 3-5 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt. LET OP: De zuurstofconcentratie en zuurstof flux signaal worden weergegeven in real-time online in een computer met behulp van software voor data-acquisitie en analyse 17. </li><li> Daarna injecteren substraten en remmers voor mitochondriële ademhaling via titanium injectieopeningen van de stoppen met behulp van de volgende standaard protocollen. </li></ol> 3. Complex I-afhankelijke Ademhaling <ol><li> Bereid een oxygraph cupje met de geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) volgens de in stappen 2.1-2.5 en procedurewachten op een stabiele signaal. </li><li> Injecteer 12,5 gl 0,8 M malaat (5 mM eindconcentratie) en 10 pl 2 M glutamaat (10 mM eindconcentratie) in de oxygraph kamer die geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) door de titanium injectiepoort van de kamer stop en opnemen cellulaire ademhaling gedurende 3-5 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt. Opmerking: Alle injecties in de volgende stappen worden uitgevoerd door het titanium injectieopeningen van stoppers via spuiten. </li><li> Injecteer 10 pi van 0,05 M ADP (0,25 mM) in de kamer door de oxygraph titanium injectiepoort van de kamer stop en mitochondriale respiratie opnemen tot zuurstofstroom signaal toeneemt, neemt dan af en stabiliseert (3-5 min). LET OP: Het plateau van de ademhaling na ADP Daarnaast geeft aan dat ADP concentratie was hoog en verzadigende. Afhankelijk van de hoeveelheid mitochondriën tijdens ademhaling dient ADP concentratie getitreerdvoor een stabiele toestand 3 zuurstofverbruik (maximale ademhaling). Toevoeging van ADP aan het mitochondriale suspensie tot een toename van het zuurstofverbruik en de zuurstofstroom signaal induceren stijgen (toestand 3 ademhaling). Nadat de ADP wordt verbruikt, zal de zuurstof flux signaal te verlagen (toestand 4 ademhaling). </li></ol> 4. Complex II-afhankelijke Ademhaling <ol><li> Bereid een oxygraph kamer die geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) volgens de in stappen 2,1-2,5 beschreven en wachten op een stabiele signaal procedure. </li><li> Injecteer 2 pl van 0,2 mM rotenon (0,2 uM) &quot;PAS&quot; in de kamer via de oxygraph titanium injectiepoort van de kamer stop met een injectiespuit en de cellulaire ademhaling gedurende 3-5 min opnemen tot een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt. LET OP: Rotenon is een gevaarlijk gif en kunnen een aanzienlijke impact hebben op de menselijke gezondheid. </li><li> Injecteer 20 pi van 1 M succinaat (10 mM) in de oxygraph chamber en opnemen mitochondriale ademhaling gedurende 3-5 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt. </li><li> Injecteer 10 pi van 0,05 M ADP (0,25 mM) in de kamer door de oxygraph titanium injectiepoort van de kamer stop en cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal toeneemt, stabiliseert, neemt dan af en stabiliseert (3-5 min). OPMERKING: Toevoeging van ADP aan het mitochondriale suspensie tot een toename van het zuurstofverbruik en de zuurstofstroom signaal induceren stijgen (toestand 3 ademhaling). Nadat de ADP wordt verbruikt, zal de zuurstof flux signaal te verlagen (toestand 4 ademhaling). </li></ol> 5. Complex IV-afhankelijke Ademhaling <ol><li> Bereid een oxygraph kamer die geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) volgens de in stappen 2,1-2,5 van het protocol en wacht op een stabiele signaal beschreven procedure. </li><li> Injecteer dan 2,5 ui 0,8 mM ascorbaat (1 mM). Onmiddellijk daarna injecteren 2,5 ui 0,2M TMPD (0,25 mM) en 10 ui 0,05 M ADP (0,25 mM) in de kamer en opnemen oxygraph cellulaire ademhaling totdat de zuurstofstroom signaal toeneemt en stabiliseert (3-5 min). </li><li> Tenslotte Injecteer 10 pi van 1 M natrium azide (5 mM) PAS &quot;in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal af en stabiliseert. OPMERKING: Natriumazide is een gevaarlijk gif en kunnen een aanzienlijke impact hebben op de menselijke gezondheid. </li></ol> 6. cytochroom C Test <ol><li> Bereid een oxygraph kamer die geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) volgens de in stappen 2,1-2,5 van het protocol en wacht op een stabiele signaal beschreven procedure. </li><li> Injecteer 12,5 gl 0,8 M malaat (5 mM eindconcentratie) en 10 pl 2 M glutamaat (10 mM eindconcentratie) in de kamer die oxygraph geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) via de injectiepoort titanium van de kamer stopperen opnemen cellulaire ademhaling gedurende 3-5 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt. </li><li> Injecteer 10 uL 0,5 M ADP (2,5 mM) in de kamer door de oxygraph titanium injectiepoort van de kamer stop en opnemen mitochondriale ademhaling totdat de zuurstofstroom signaal toeneemt, neemt dan af en stabiliseert (3-5 min). </li><li> Tenslotte Injecteer 5 ul van 4 mM cytochroom c (10 uM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt. </li></ol>

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues.+I.+Isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Sims, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+brain+and+subregions+using+Percoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation.</a> J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).</li>
<li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Vuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+catecholamines+on+hepatic+and+skeletal+muscle+mitochondrial+respiration+after+prolonged+exposure+to+faecal+peritonitis+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs.</a> Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).</li>
<li>Corrêa, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+in+septic+shock%3A+effects+on+tissue+perfusion%2C+organ+function%2C+and+mitochondrial+respiration+in+a+porcine+model+of+fecal+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis.</a> Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).</li>
<li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074(2015).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%22">Bioenergetics</a>. 3, Academic Press. San Diego. (2002).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Subj.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3076726/">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), e18317(2011).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+crude+mitochondrial+fraction+by+density-gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell.+Biol.+Chapter+3%22%5BJournal%5D)">Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).</li>
<li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), 382392(2013).</li>
<li>Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li>
<li>Lombardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+muscle+mitochondria+subpopulations+in+pig%3A+a+study+using+top-down+elasticity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis.</a> FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie beschrijven we een protocol van hoge kwaliteit, intact en nauw verbonden skeletspier mitochondria door differentieel centrifugeren kan worden gebruikt voor functionele studies zoals hoge-resolutie respirometrie isoleren. Om intact en nauw verbonden mitochondria isoleren, zijn er enkele kritische punten in het onderhavige protocol te worden beschouwd. Na het oogsten van het skelet weefsel moet meteen ondergedompeld in ijskoude mitochondriale isolatiebuffer. Alle centrifugatie s...

Mitochondriale bioenergetica en respiratoire capaciteit kan worden onderzocht niet alleen gepermeabiliseerde cellen of vezels, maar ook in geïsoleerde mitochondriën. In de huidige studie beschrijven we een protocol om intact skeletspieren mitochondriën met behulp van differentiële centrifugatie voor hoge-resolutie respirometrie metingen te isoleren. Intact mitochondria isoleren respirometrie, het weefsel gehomogeniseerd en mitochondria geïsoleerd door differentiële centrifugatie gebruikelijke methode. De differentiële centrifugatie methode waarbij in de centrifugaties (in een reeks van toenemende snelheid) weefsel homogenaten werd eerst geïntroduceerd door Pallade en medewerkers bijna 70 jaar geleden 1. Het weefsel wordt eerst fijngehakt met een schaar en mechanisch gehomogeniseerd in een glazen homogenisator met een loszittende stamper. Daarna het homogenaat wordt gecentrifugeerd bij lage snelheid en de resulterende pellet die ononderbroken weefsel bevat, cellulairepuin en kernen wordt weggegooid. Vervolgens wordt de bovenstaande vloeistof meerdere malen gecentrifugeerd bij hoge snelheid en de mitochondriale verrijkte fractie wordt verzameld. De voordelen van de differentiële centrifugatie methode voor het isoleren mitochondria dat: i) de werkwijze is snel en mitochondria kunnen worden geïsoleerd binnen 1-1,5 uur (respiratoire experimenten worden uitgevoerd zo snel mogelijk); ii) het is goedkoop; en iii) het is zeer efficiënt en verkregen door differentiële centrifugatie mitochondria zuiver genoeg voor respirometrie assays. De nadelen van differentiële centrifugatie methode voor het isoleren mitochondria zijn dat i) mitochondriën kunnen beschadigd raken en ontkoppeld tijdens homogenisering; ii) de verontreiniging van mitochondriën met andere cellulaire componenten (kan worden opgelost door verder wassen van het mitochondriale pellet extra centrifugatiestappen); iii) de mogelijkheid tot het selecteren van verschillende mitochondriale subpopulaties, bijvoorbeeld tijdens differentiële centrifugering stappen, mitochondria met lagere dichtheid kan worden uitgesloten 7; en iv) de cellulaire mitochondriale omringende ontbreekt en alleen de theoretische maximale ademhaling kan worden gemeten. Een andere werkwijze voor mitochondria isoleren respirometrie assays is de dichtheidsgradiënt centrifugatie 2. In deze techniek wordt het weefsel extract gelaagd over een oplossing van sucrose of een Percoll gradiënt (met hogere dichtheid op de bodem van de centrifugebuis) en gecentrifugeerd bij een bepaalde snelheid, waardoor de mitochondriën te isoleren uit andere cellulaire componenten op basis van hun dichtheden. Deze werkwijze wordt vaak gebruikt om de hersenen mitochondriën geïsoleerd met zeer lage verontreiniging uit synaptosomen. Echter, de rattenlever mitochondriën geïsoleerd door dichtheidsgradiënt centrifugatie sterk verontreinigd met andere cellulaire organellen 3. Een van de beperkingen van deze methode is dat de sucrosegradiënt in de centrifugebuis zo kan scheurenme mitochondria (osmotische shock). Afhankelijk van het type weefsel; er enkele belangrijke factoren te overwegen voor de isolatie van intacte mitochondriën door differentiële centrifugatie. Allereerst moet weefsels homogeniseren op een zachte manier. Zachte weefsels zoals de nieren, de hersenen en lever nodig zachte mechanische krachten die tijdens homogenisering. Dit in tegenstelling tot harde weefsels zoals hart en skeletspier sterker mechanische krachten vereisen. Gehakt weefsel wordt gewoonlijk behandeld met proteinase vóór de homogenisatie om het weefsel te verzachten. Alle buffers tijdens homogenisatie en centrifugatie moet ijskoud zijn en een fysiologisch relevante pH met een ionische sterkte en osmotische geschikt cytosol 4, 5. Een van de voordelen van het bestuderen geïsoleerd mitochondriale bioenergetica dat cellulaire plasmamembranen hoeft te zijn permeabiseerd met detergentia zoals digitonine en saponine 4, 6, waarbij de buitenste mitochondriale membraan integriteit in gevaar kan brengen. Een ander voordeel van de geïsoleerde mitochondria is de afwezigheid van andere cytosolische factoren, die kunnen interfereren met de analyse van de mitochondriële functies zoals zuurstofconsumptie. De nadelen van het gebruik van de geïsoleerde mitochondriën de mogelijke selectie van bepaalde mitochondriale populatie tijdens de centrifugatiestappen, schade aan de mitochondriën tijdens homogenisatie, en het vereiste van grote hoeveelheden biologische monsters om een goede opbrengst van geïsoleerde mitochondria 7, 8 te verkrijgen. Na de isolatie procedure, de luchtwegen tarieven van de mitochondriale complexen I, II en IV-afhankelijke (staten 2, 3 en 4) worden bepaald met behulp van hoge-resolutie respirometrie. Voor complexe innovatie aangestuurde ademhaling, glutamaaten malaat worden toegevoegd, gevolgd door adenosine difosfaat (ADP). Voor complexe II aangedreven ademhaling, succinaat wordt toegevoegd gevolgd door ADP. Voor complexe IV aangedreven ademhaling, ascorbaat en tetramethylphenylendiamine (TMPD) worden toegevoegd gevolgd door ADP 9, 10, 11, 12. State 2 verwijst naar zuurstofverbruik in aanwezigheid van alleen substraten. State 3 verwijst naar zuurstofverbruik in aanwezigheid van substraten en ADP. Staat 4 verwijst naar het zuurstofverbruik na ADP uitputting. De respiratoire controle ratio (RCR) is een index van koppeling van zuurstofverbruik ATP productie wordt berekend als de verhouding tussen toestand 3 en 4 staat 13, 15. Samengevat beschrijven we een protocol om functionele en intacte skeletspier mitochondria geïsoleerd door differentiële centrifugatie en gebruikt deze geïsoleerde mitochonDria voor functionele en bio-energetische studies zoals hoge-resolutie respirometrie.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Chemisch, oplosbaar in ethanol</td></tr><tr><td>Ascorbaat</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A 7699</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Glutamaat</td><td>Sigma,</td><td>G 1626</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>K-lactobionaat</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Morpholinopropaansulfonzuur (MOPS)</td><td>Merck</td><td>1.06129</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>O2k-Core: Oxygraph-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Hoge resolutie respirometrie instrument</td></tr><tr><td>Proteinase, bacterieel</td><td>Sigma</td><td>P 8038</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Chemisch, oplosbaar in ethanol</td></tr><tr><td>Succinaat</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Schuett homogen-plus semiautomatische homogenisator&nbsp;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>Weefselhomogenisator</td></tr><tr><td>Tauriin</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Chemisch</td></tr></tbody></table>

isolatie van intact mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor high-resolution respirometrietest metingen

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria zijn betrokken bij cellulaire energiemetabolisme en gebruiken zuurstof om energie te produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP). Differentiële centrifugatie met lage en hoge snelheid wordt vaak gebruikt om mitochondria uit weefsels en gekweekte cellen te isoleren. Ruwe mitochondriale fracties verkregen door differentiële centrifugatie worden gebruikt voor respirometriemetingen. De techniek van differentiële centrifugatie is gebaseerd op de scheiding van organellen op basis van hun grootte en sedimentatiesnelheid. De isolatie van mitochondria wordt onmiddellijk uitgevoerd na het oogsten van weefsel. Het weefsel wordt ondergedompeld in een ijskou homogenisatiemedium, gesneden met schaar en gehomogeniseerd in een glazen homogenisator met een loszittende stamper. De techniek van differentiële centrifugatie is efficiënt, snel en goedkoop en de mitochondria verkregen door differentiële centrifugatie zijn zuiver genoeg voor respirometrie-assays. Enkele van de beperkingen en nadelen van geïsoleerde mitochondria, gebaseerd op differentiële centrifugatie, zijn dat de mitochondria kunnen worden beschadigd tijdens de homogenisatie- en isolatieprocedure en dat grote hoeveelheden weefselbiopsie of gekweekte cellen nodig zijn voor de mitochondriale isolatie.

Complex I-afhankelijke ademhaling Geïsoleerde mitochondriële complex I-afhankelijke ademfrequentie (staten 2, 3 en 4) worden bepaald met behulp van hoge-resolutie respirometrie (figuur 1, een representatief diagram). Mitochondriale complex I substraten glutamaat en malaat, worden toegevoegd gevolgd door de toevoeging van ADP. State 2 verwijst naar zuurstofverbruik in aanwezigheid van de substr...

Hier wordt een quadricepsspiermonster genomen van een geanesthetiseerd varken en mitochondriën worden geïsoleerd door differentiële centrifugatie. Vervolgens worden de ademhalingssnelheden van mitochondriale ademhalingsketencomplexen I, II en IV bepaald met behulp van hoogwaardige respirometrie.

Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Het algemene doel van deze procedure is om skeletspier-mitochondriën te isoleren via differentiële centrifugatie en de respiratiesnelheden van de mitochondriale respiratoire ketencomplexen I, II en IV te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de mitochondriale bio-energetica, zoals ziekten en syndromen die geassocieerd zijn met mitochondriale dysfunctie, waaronder diverse neurologische aandoeningen, sepsis en ouderdomsgerelateerde stoornissen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de afwezigheid van de meeste cytologische factoren in de geïsoleerde mitochondriale preparatie, die de analyse van de mitochondriale functies kunnen beïnvloeden. De procedure zal worden gedemonstreerd door Sandra Nansoz, de technicus uit mijn laboratorium.Om deze procedure te starten, neemt u een beker met skeletspierstalen zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de beker in een ijsbak. Snijd de spier met een fijne schaar in stukjes van één tot twee millimeter groot.Spoel daarna het fijngehakte weefsel twee keer met ijskoud isolatiebuffer, waarbij voor elke wasbeurt 20 milliliters wordt gebruikt. Suspendeer het gewassen weefsel in 10 millil

isolation-intact-mitochondria-from-skeletal-muscle-differential

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft een procedure om de ademhaling van mitochondriën geïsoleerd van skeletspieren studie. Deze methode werd aangepast van...

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Werkwijze voor snelle isolatie van mitochondria uit zoogdierweefsel biopsies beschreven. Rat lever of skeletspieren voorbereidingen werden gehomogeniseerd met een commerciële weefsel Dissociator en mitochondriën werden door differentiële filtratie geïsoleerd door nylon mesh filters. Mitochondriale isolatie is &lt;30 min ten opzichte van 60-100 min met behulp van alternatieve methoden.

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Mitochondriën zijn belangrijke metabole organellen die een hoog niveau van fenotypische plasticiteit in de skeletspieren vertonen. De import van eiwitten uit het cytosol is een kritieke route voor organelbiogenese, essentieel voor de uitbreiding van het reticulum en het behoud van de mitochondriale functie.  Daarom dient eiwitimport als een barometer van cellulaire gezondheid.

Meting van eiwitimportcapaciteit van skeletspier mitochondriën

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

Paarden hebben een uitzonderlijke aërobe inspanningscapaciteit, waardoor paardenskeletspieren een belangrijk weefsel zijn voor zowel de studie van paardeninspanningsfysiologie als de mitochondriale fysiologie van zoogdieren. Dit artikel beschrijft technieken voor de uitgebreide beoordeling van de mitochondriale functie in de skeletspieren van paarden.

Hoge resolutie fluorrespirometrie van equine skeletspieren

Bio-energetische en metabolomische studies op mitochondriën hebben hun veelzijdige rol bij veel ziekten aan het licht gebracht, maar de isolatiemethoden voor deze organellen variëren. De hier beschreven methode is in staat om hoogwaardige mitochondriën uit meerdere weefselbronnen te zuiveren. De kwaliteit wordt bepaald door ademhalingscontroleratio's en andere meetwaarden die worden beoordeeld met respirometrie met hoge resolutie.

Robuuste mitochondriale isolatie van knaagdierweefsel 

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Hier beschreven is een methode om direct te meten calcium vonken, de elementaire eenheden van Ca2 + vrij van sarcoplasmatisch reticulum in intacte spiervezels. Deze methode maakt gebruik van osmotische stress-gemedieerde activering van Ca 2 + vrijlating uit ryanodinereceptor in geïsoleerde spiervezels. De dynamiek en homeostatische aantal intracellulaire Ca2 +-signalen kunnen worden gebruikt om spierfunctie in gezondheid en ziekte te beoordelen.

Beoordeling van Calcium Sparks in Intact Skeletal spiervezels

Leer intacte mitochondriën isoleren uit skeletspier door differentiële centrifugatie voor hoogresolutie-respirometrie. Deze methode meet ademhalingsactiviteit van complexen I, II en IV.

Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen (Video) | JoVE Journal

Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen

Meer video's verkennen