Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen

Het algemene doel van deze procedure is om skeletspier-mitochondriën te isoleren via differentiële centrifugatie en de respiratiesnelheden van de mitochondriale respiratoire ketencomplexen I, II en IV te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de mitochondriale bio-energetica, zoals ziekten en syndromen die geassocieerd zijn met mitochondriale dysfunctie, waaronder diverse neurologische aandoeningen, sepsis en ouderdomsgerelateerde stoornissen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de afwezigheid van de meeste cytologische factoren in de geïsoleerde mitochondriale preparatie, die de analyse van de mitochondriale functies kunnen beïnvloeden. De procedure zal worden gedemonstreerd door Sandra Nansoz, de technicus uit mijn laboratorium.

Om deze procedure te starten, neemt u een beker met skeletspierstalen zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de beker in een ijsbak. Snijd de spier met een fijne schaar in stukjes van één tot twee millimeter groot.

Spoel daarna het fijngehakte weefsel twee keer met ijskoud isolatiebuffer, waarbij voor elke wasbeurt 20 milliliters wordt gebruikt. Suspendeer het gewassen weefsel in 10 milliliters isolatiebuffer per gram weefsel en voeg vervolgens vijf milligrams protease-G weefsel toe. Plaats de beker daarna in een ijbad met een magneetroerder en roer gedurende 10 minuten.

Verdun daarna de suspensie met nog eens 10 milliliter isolatiebuffer aangevuld met 0,2% ontvet BSA per gram weefsel. Giet vervolgens alle isolatiebuffer uit de beker. Was het weefsel tweemaal met ijskoude isolatiebuffer aangevuld met 0,2% BSA, waarbij voor elke wasbeurt 20 milliliter wordt gebruikt.

Resuspendeer het weefsel vervolgens in 10 milliliter isolatiebuffer aangevuld met BSA per gram weefsel. Gebruik een semi-automatische glazen homogenisator met een lospassende stamper om het weefsel te homogeniseren. Breng het homogenisaat vervolgens over naar een centrifugebuis en centrifugeer 10 minuten bij 10.000 ×g bij vier graden Celsius.

Verwijder het supernatant met een serologische pipette. Resuspendeer de pellet met 10 milliliters ijskoud isolatiemedium aangevuld met BSA per gram weefsel. Centrifugeer de suspensie bij 350 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Gebruik daarna een serologische pipette om het supernatant op te vangen en gooi de pellet weg. Filtreer het supernatant door twee lagen gaas in een bekerglas dat op ijs staat. Breng de gefiltreerde suspensie over naar een centrifugebuis en centrifugeer 7 000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Verwijder vervolgens het supernatant. Resuspendeer het ruwe mitochondriële pellet in vijf milliliter isolatiebuffer aangevuld met BSA per gram weefsel. Centrifugeer deze suspensie 7.000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de pellet in 20 milliliters wasbuffer. Centrifugeer 10 minuten bij 7.000 ×g bij vier graden Celsius. Herhaal dit proces van resuspenderen en centrifugeren nogmaals.

Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer de pellet in één milliliter wasbuffer. Bepaal de proteïneconcentratie met een standaardmethode naar keuze. Bewaar de geconcentreerde mitochondriale suspensie vervolgens op ijs tot de respirometriemetingen worden uitgevoerd.

Begin met het resuspenderen van het mitochondriale concentraat in de respiratiebuffer tot een uiteindelijke concentratie van 0,4 mg/mL mitochondriaal eiwit. Aspireer vervolgens het respiratiemedium uit de luchtgekalibreerde oxygraafkamer. Voeg 2,1 mL van de geïsoleerde mitochondriale suspensie toe.

Plaats een stopper om de oxygraafkamer te sluiten. Roer vervolgens de mitochondriële suspensie continu bij 700 RPM bij 37 °C. Registreer de cellulaire respiratie bij de baseline gedurende drie tot vijf minuten totdat een stabiel zuurstofstroomsignaal is bereikt.

Om de complex I-afhankelijke respiratie te starten, injecteert u 12,5 µL 0,8 M malaat in een oxygraafkamer die is voorbereid met de geïsoleerde mitochondriële suspensie, via de titanium injectiepoort van de stop. Injecteer vervolgens 10 µL 2 M glutamaat. Registreer de cellulaire respiratie gedurende drie tot vijf minuten totdat een stabiel zuurstofstroomsignaal is bereikt.

Inject daarna 10 µL 0,05 M ADP in de kamer via de injectiepoort. Registreer de cellulaire respiratie totdat het zuurstoffluxsignaal toeneemt, vervolgens afneemt en stabiliseert. Voor de complex II-afhankelijke respiratie injecteert u 2 µL 0,2 mM rotenon in een oxygraafkamer die is voorbereid met een suspensie van geïsoleerde mitochondriën.

Registreer de cellulaire respiratie totdat een stabiel zuurstofstroomsignaal is bereikt. Injecteer vervolgens 20 µL van één molair succinaat. Registreer de cellulaire respiratie totdat een stabiel zuurstofstroomsignaal is bereikt.

Inject vervolgens 10 µL 0,05 M ADP in de kamer via de injectiepoort. Registreer de cellulaire respiratie tot het zuurstoffluxsignaal toeneemt, vervolgens afneemt en stabiliseert. Voor de complex IV-afhankelijke respiratie injecteert u 2,5 µL 0,8 mM ascorbaat in een oxygraafkamer die is voorbereid met een isolaat van mitochondriale suspensie.

Inject vervolgens onmiddellijk 2,5 µL 0,2 M TMPD en 10 µL 0,05 M ADP. Registreer de cellulaire respiratie totdat een stabiel zuurstofstroomsignaal is bereikt. Injecteer daarna 10 µL 1 M natriumazide.

Registreer de cellulaire respiratie tot het zuurstofstroomsignaal afneemt en vervolgens stabiliseert. In deze studie worden intacte mitochondriën geïsoleerd uit skeletspieren. Vervolgens worden de Complex I-afhankelijke respiratiesnelheden gemeten via high-resolution respirometrie.

Zoals te zien is, stijgt de mitochondriële ademhalingssnelheid onmiddellijk na de toevoeging van ADP. Na uitputting van het ADP daalt de ademhalingssnelheid naar niveaus die vergelijkbaar zijn met die voor de toevoeging van ADP. Dit geeft aan dat de verhouding tussen state 3 en state 4, bekend als de respiratory control ratio of RCR, hoog is en dat de mitochondriële integriteit goed behouden is gebleven tijdens de isolatieprocedure.

De complex II-afhankelijke respiratiesnelheden worden vervolgens waargenomen door de complex I-respiratie te remmen met rotenon en het complex II-substraat succinaat te injecteren. Vervolgens wordt ADP toegevoegd, wat resulteert in een onmiddellijke toename van de respiratie. Zodra het ADP is uitgeput, neemt de respiratie af tot niveaus die vergelijkbaar zijn met die vóór de toevoeging van ADP, wat wijst op een hoge RCR en dat de mitochondriale integriteit tijdens de isolatie goed is behouden.

Complex IV-afhankelijke respiratiesnelheden worden waargenomen door ascorbaat, TMPD en ADP toe te voegen. Natriumazide wordt vervolgens toegevoegd om complex IV te remmen. Het verschil in zuurstofverbruik vóór en na de toevoeging van natriumazide wordt geïnterpreteerd als de werkelijke complex IV-respiratie. De hoge complex IV-afhankelijke respiratiesnelheid die in staat 3 wordt waargenomen, geeft aan dat de mitochondriale integriteit goed bewaard is gebleven tijdens de isolatieprocedure.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in minder dan anderhalf uur worden uitgevoerd mits dit correct gebeurt. Tijdens deze procedure is het belangrijk om voorafgaand aan de homogenisatie een kalibratie van de zuurstofsensoren uit te voeren. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals metingen van het cellulaire ADP-gehalte, de mitochondriale membraanpotentiaal, de enzymatische activiteit van ATP-synthase en substraatniveaus, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of veranderingen in de ademhalingssnelheden te wijten zijn aan een gebrek aan mitochondriaal substraat, de membraanpotentiaal of een verminderde enzymatische activiteit van ATP-synthase.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe mitochondria uit skeletspieren kunnen worden geïsoleerd via differentiële centrifugatie en hoe de respiratiesnelheden van mitochondriale complexen I, II en IV kunnen worden gemeten met behulp van hoge-resolutie respirometrie. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van mitochondriaal energiemetabolisme om de energetische functie van mitochondria te onderzoeken in vakgebieden zoals genetische mitochondriale ziekten, myopathieën en ischemie-reperfusieschade in geïsoleerde mitochondria. Vergeet niet dat het werken met antimycine A, rotenon, natriumazide en FCCP extreem gevaarlijk kan zijn.

En er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en laboratoriumjassen, tijdens het uitvoeren van deze procedure.