Sublimatie van DAN Matrix voor de detectie en Visualisatie van gangliosiden in Rat Brain Tissue voor MALDI Imaging Mass Spectrometry

Het algemene doel van dit sublimatieprotocol is om een gedetailleerd, gemakkelijk te volgen monstervoorbereidingsproces te bieden, voor de detectie van ganglioziden in MALDI-beeldvorming massaspectrometrie experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurobiologie, inclusief de anatomische verdeling en functie van ganglioziden, zowel in de gezonde hersenen als in hersenpathologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden aangepast voor hoogwaardige beeldvorming van veel lipidesoorten met weinig wijzigingen in het protocol.

Om met deze procedure te beginnen, verwijdert u hersenweefsel uit de rat en bereidt u het voor op cryostaat zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats vervolgens het weefsel in de cryostaat. Snijd het weefsel tot de gewenste anatomische locatie.

Zorg ervoor dat de snijdikte tussen de acht en 12 micrometer ligt. Gebruik de anti-rolbalk van de cryostaat om langzaam een afgeplatte weefselsectie te snijden. Gaten of markeringen op het weefsel kunnen voorkomen als de rolbalk niet correct is geplaatst of als het mes bot is.

Verplaats het weefsel naar het midden van het snijvlak met schone verfborstels. Om het weefsel in kaart te brengen, bevriest u geleidende dia's of metalen platen door ze in de cryostaat te plaatsen tijdens het snijden. Wanneer de dia volledig bevroren is, verplaatst u de weefselsectie voorzichtig naar de geleidende zijde van de dia met schone verfborstels.

Zodra alle weefselsecties correct op de dia zijn gepositioneerd, plaatst u een vinger onder de dia tegenover het weefsel en drukt u tot de sectie ontdooit. Plaats vervolgens de dia's met weefsel gedurende vijf tot 10 minuten in een droogkast. Als alternatief kunt u een warme dia gebruiken en deze lichtjes aandrukken, geleidende kant naar beneden, tegen de afgeplatte weefselsecties.

Werkend in de afzuiging, plaats een zandbad in een aluminium container op een hotplate. De hotplate moet op een metalen schaarlift van de juiste oppervlakte zijn. Zet de hotplate aan en stel de temperatuur in op 140 graden Celsius.

Gebruik de temperatuurfeedbacksonde om de zandtemperatuur gedurende het hele experiment te bewaken en zorg voor temperatuurconsistentie. Plaats vervolgens 300 milligram DAN-matrix op het onderste oppervlak van het sublimatieapparaat. Verdeel de matrix in een gelijkmatige laag in het midden van het apparaat tot de geschatte breedte en lengte van de dia die wordt gesublimeerd.

Plaats een metalen plaat op het binnenoppervlak van het apparaat, waarbij de plaat direct contact maakt met de bodem van de condensator. Plak een lege testdia diagonaal over het oppervlak van de metalen plaat, met een tape op de buitenranden van de dia. Verbind de bovenste en onderste delen van het apparaat met een rubberen O-ring in het midden om een volledige afdichting te garanderen.

Plaats een metalen U-joint rond het midden van het apparaat en draai de klemmen vast totdat de bovenste en onderste helft van het apparaat stevig op elkaar zijn afgesloten. Plaats vervolgens het apparaat in de metalen O-ring boven het zandbad. Plaats vervolgens een handvol gemalen ijs in de condensator.

Vul de condensator een kwart tot de helft met koud water om ijsslush te creëren. De ijsslush zal de metalen plaat aan de binnenkant van het apparaat koelen, en vervolgens de dia die eraan is bevestigd. Wacht minimaal vijf minuten tot de temperatuur een stabiele toestand bereikt.

Giet vervolgens 300 ml methanol in de koude vangbak en plaats de glasapparatuur in de vangbak. Verbind de vacuümpomp met de uitgang van de koude vangbak met behulp van rubberen slangen. Gebruik een andere rubberen slang om de ingang van de koude vangbak te verbinden met het sublimatieapparaat.

Zorg ervoor dat de slangen stevig zijn bevestigd met behulp van metalen klemmen. Gebruik de vacuümpomp om een vacuüm van 30 tot 50 millitorr te leveren. Laat de pompen minimaal vijf minuten draaien voor drukvereffening.

Laat twee tot drie kleine stukjes droog ijs vallen in de ethanol, in de bodem van de koude vangbak. De koude vangbak helpt voorkomen dat matrixdeeltjes zich ophopen in de vacuümpomp. Klemmen op de U-ring van het sublimatieapparaat moeten mogelijk worden vastgedraaid zodra de vacuümpomp is ingeschakeld vanwege de verminderde druk in het apparaat.

Zorg ervoor dat de temperatuur van het zandbad is gestabiliseerd op 140 graden Celsius. Controleer ook of de vacuümpomp is ingeschakeld en of het apparaat is bevestigd in de metalen O-ring boven het zandbad met alle slangen aangesloten. Stel de timer in op zeven minuten, maar start de timer niet.

Til langzaam de schaarlift en het zandbad op tot het sublimatieapparaat totdat de U-joint van de sublimator ruim boven de metalen O-ring ligt. Deze extra ruimte maakt het mogelijk om het apparaat op het zand aan te passen. Druk de sublimator voorzichtig op het zandoppervlak om ervoor te zorgen dat het apparaat gelijkmatig op het zand ligt.

En start vervolgens onmiddellijk de timer. Wanneer de timer afgaat, zet de vacuümpomp uit en laat de schaarlift voorzichtig zakken tot de sublimator niet langer het zandbad raakt en stevig in de metalen O-ring zit. Draai langzaam de microventkraan open om de druk in het apparaat vrij te geven.

Maak de metalen klem los rond de rubberen slang van het sublimatieapparaat en begin langzaam de slang los te maken. Zodra de rubberen slang enigszins is losgemaakt, buig de slang naar één kant om resterende druk te laten ontsnappen. Wanneer de omgevingsdruk terugkeert, verwijdert u voorzichtig de rubberen slang van het sublimatieapparaat.

Los vervolgens de klemmen op de U-joint van het apparaat en verwijder ze. Scheid voorzichtig de twee helften van het sublimatieapparaat en trek de dia van de bovenkant van het binnenglas. Controleer de dia om te bevestigen dat de matrix gelijkmatig is verdeeld.

Als de verdeling en hoeveelheid gesublimeerd matrix voldoende is, plakt u een nieuw