Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Het algemene doel van deze video is om de methode voor het sequentiëren van psoralen gekruiste geligeerd en geselecteerde hybriden of SPLASH te beschrijven waarbij paarsgewijze in vivo RNA-RNA interacties op een genome-wide manier worden gekarteerd. Deze techniek is een eenvoudige, hoogdoorvoer methode voor het mappen van de RNA interactie in vivo. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het RNA genomics veld, zoals hoe verschillende regio's langs een enkele RNA-streng of tussen verschillende RNA-strengen met elkaar interageren.

Hoewel deze methode inzichten kan bieden in gista en menselijke cellen, kan het ook worden toegepast op studies in andere moderne organismen, inclusief bacteriën en membranen in cellen. We hadden het idee voor deze methode toen we een manier wilden bedenken om moleculaire interacties te mappen. Merk op dat de volgende procedure verschillende stoppunten bevat.

Op deze momenten kan het experiment kort of onbepaald lang worden onderbroken. Details zijn te vinden in de bijbehorende tekst. Begin deze procedure door HeLa cellen twee keer te wassen met vijf milliliter PBS.

Plaats de schaal verticaal gedurende één minuut om eventueel overtollig PBS volledig te laten weglopen. Voeg vervolgens één milliliter PBS toe dat 200 micromolar biotinyleren psoralen en 0.01% digitonine bevat, wat de celpermeabiliteit verhoogt. Zorg ervoor dat de oplossing gelijkmatig over het oppervlak van de cellen wordt toegevoegd.

Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, verwijder de deksel van de schaal en plaats deze op ijs binnen een UV Crosslinker op drie centimeter van de UV-lamp. Bestraal met 365 nanometer UV gedurende 20 minuten.

Na 20 minuten verwijdert u de schaal uit de Crosslinker en isoleert u vervolgens het fragment en precipiteer het RNA uit HeLa cellen volgens de instructies in het bijbehorende document. Laad gedenatureerde ladder en RNA monsters op een 8,6 centimeter vierkante 6% TBE-ureageel. Deeltjesgrootte fractie door middel van elektroforese bij 180 volt gedurende 40 minuten.

Kleur de gel in 10 milliliter TBE buffer die een 1:10.000 verdunning van nucleïnezuur gel kleurstof bevat gedurende vijf minuten in het donker. Terwijl de gel wordt gekleurd, gebruik een naald van 24 gauge om een schone 0,6 milliliter microcentrifugebuis op de bodem te prikken. Plaats deze in een twee milliliter microcentrifugebuis.

Gebruik een transilluminator om de banden op de post-gekleurde gel te visualiseren en snijdt een gel stukje uit dat overeenkomt met 90 tot 110 nucleotiden. Breng het gel stukje over in de gepunctureerde 0,6 milliliter microcentrifugebuis in de twee milliliter microcentrifugebuis. Grootte selectie stelt ons in staat om de minimale lengte voor de chimerische fragmenten in te stellen en om later onderscheid te maken tussen geligeerde producten en niet-geliigeerd producten.

Centrifugeer de gel stukken bij 12.000 keer g bij kamertemperatuur gedurende twee minuten om het gel stukje te vergruizen en het te verzamelen in de twee milliliter microcentrifugebuis. Na het centrifugeren, gooit u de lege 0,6 milliliter microcentrifugebuis weg. Voeg 700 microliter elutie buffer toe aan het vergruinde gel stukje.

Incubeer bij vier graden Celsius een nacht lang met constante rotatie om diffusie van de monsters in de buffer mogelijk te maken. Breng de gel stukken en de elutie buffer over naar een centrifugebuisfilter en centrifugeer bij 20.000 keer g gedurende 20 minuten. Na het centrifugeren zullen de gel stukken worden vastgehouden in het bovenste compartiment van het filter dat kan worden weggegooid.

Precipiteer en kwantificeer het RNA zoals beschreven in het bijbehorende document. Bevries snel en bewaar het RNA bij min 80 graden Celsius in vloeibare stikstof totdat het wordt gebruikt. Om RNA kruislinks gebieden te verrijken, begint u door 100 microliter lyse buffer toe te voegen die RNase inhibitor bevat om streptavidine-gecoate magnetische kralen in een microcentrifugebuis te wassen.

Voeg in een 15 milliliter conische centrifugeerbuis twee milliliter vers bereide hybridisatie buffer toe, één milliliter aangevulde lyse buffer, 1,5 microgram grootte gefractieerde RNA en 100 microliter resuspendeerde kralen. Vorm voorzichtig een vortex in de buis. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met einde-op-einde rotatie.

Na de incubatie, was de kralen vijf keer met voorverwarmd was buffer. Aan het einde van de vijfde wassing, plaats de microcentrifugebuis met de kralen op de magneetstandaard voor één minuut en verwijder vervolgens het was buffer. Voeg één milliliter koude T4 polynucleotide kinase buffer toe aan de gewassen kralen.

Incubeer de kralen gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius met einde-op-einde rotatie. Plaats de microcentrifugebuis met de kralen op de magnetische strip. Na één minuut, verwijdert u voorzichtig het buffer.

Herhaal deze stap voor een totaal van twee wasbeurten en verwijder het buffer na de laatste wasbeurt. Volg vervolgens de instructies in het bijbehorende document om de vijf prime en drie prime uiteinden te converteren om ligatie compatibel te zijn en voer de nabijheidsligatie uit. Na een wasbeurt, voeg 100 microliter RNA PK buffer toe aan de kralen en resuspendeer ze door op en neer te pipetten.

Verhit de monsters gedurende 10 minuten bij 95 graden Celsius op een hitteblok. Koel vervolgens het monster af op ijs gedurende één minuut. Voeg 500 microliter guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform toe aan het monster.

Meng door krachtig te vortexen gedurende 10 seconden. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Na de incubatie, gebruik een kit om te precipiteren, op te schonen en het RNA te herstellen, zorg ervoor dat zelfs kleine RNA's worden behouden.

Elueer het RNA in 100 microliter nuclease-vrij water. Breng 100 microliter van de elueerde monsters over in een putje van een 24-wells plaat op ijs. Houd het monster op ijs, UV bestraal het gedurende vijf minuten op 254 nanometer.

Breng het omgekeerd gekruiste monster over naar een