Name: Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Leer de SPLASH-methode voor wereldwijde in vivo mapping van RNA-RNA-interacties met behulp van gebiotinyleerde psoralen. Deze eenvoudige, hoogdoorvoettechniek is toepasbaar op gist, bacteriën en humane cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken leden van het Wan lab en het Nagarajan lab voor informatieve discussies. N.Nagarajan wordt ondersteund door financiering van A * STAR. Y.Wan wordt ondersteund door financiering van A * STAR en Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

<ol><li>Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+transcriptome+through+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Understanding the transcriptome through RNA structure.</a> Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Measurement+of+RNA+Folding+Energies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies.</a> Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).</li>
<li>Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+RNA+structure+using+nuclease+digestion+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing.</a> Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA-RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+interactions+enable+specific+targeting+of+noncoding+RNAs+to+nascent+Pre-mRNAs+and+chromatin+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.</a> Cell. 159 (1), 188-199 (2014).</li>
<li>Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+determination+of+RNA+structure+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation.</a> Nat.Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Duplex+Map+in+Living+Cells+Reveals+Higher-Order+Transcriptome+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure.</a> Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).</li>
<li>Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Human+RNA-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions.</a> Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).</li>
<li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Mapping+of+Eukaryotic+RNA+Interactomes+Reveals+Principles+of+Higher-Order+Organization+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation.</a> Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële belangen.

Hier beschrijven we in detail de experimentele en computational workflow voor SPLASH, een methode die ons toelaat om paar-achtige RNA-interacties op een genoombreedte te identificeren. We hebben succesvol gebruik gemaakt van SPLASH in bacteriële, gist en menselijke culturen en anticiperen dat de strategie op grote schaal toegepast kan worden op diverse organismen onder verschillende cellulaire staten. Een van de kritieke stappen in het protocol is om te beginnen met tenminste 20 μg verknoopt RNA om voldoende materiaal t...

Het bestuderen van hoe macromoleculen elkaar vouwen en interageren, is de sleutel tot het begrijpen van genregulering in de cel. Hoewel er in het afgelopen decennium veel moeite werd gelegd om te begrijpen hoe DNA en eiwitten bijdragen tot genregulatie, is er relatief minder bekend over posttranscriptie van genexpressie. RNA voert informatie in zowel zijn lineaire volgorde als in zijn secundaire en tertiaire structuur 1 . Het vermogen om met zichzelf en met anderen te koppelen, is belangrijk voor zijn functie in vivo . Recente vooruitgang in high-through RNA secundaire structuuronderzoek heeft waardevolle inzicht gegeven in de locaties van dubbele en enkelstrengige gebieden in de transcriptome 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer informatie over de pairing interaction partners is nog steeds grotendeels ontbreken. Om te bepalen welke RNA-sequentie in wisselwerking met een ander RNA-gebied in het transcriptomeet is, hebben we wereldwijde paar-wise informatie nodig. Mapping pair-wise RNA interacties op een globale, onpartijdige manier is traditioneel een grote uitdaging geweest. Terwijl eerdere benaderingen, zoals CLASH 9 , hiCLIP 10 en RAP 11 , worden gebruikt om RNA-interacties op grote schaal te identificeren, worden deze technieken typisch RNA-basisparen in kaart gebracht voor een subset van RNA&#39;s die ofwel interactie hebben met een bepaald eiwit of RNA-soort. Recente ontwikkelingen bij het bestuderen van globale RNA-interacties omvatten de methode RPL 12 , die geen RNA-interacties in vivo stabiliseert en derhalve alleen een subset van in vivo interacties kan vastleggen. Om deze uitdagingen te overwinnen hebben we en anderen ontwikkeld genoom-brede, onbevooroordeelde strategieën voor maP RNA-interacties in vivo , onder gebruikmaking van gemodificeerde versies van de crosslinkerpsoralen 13 , 14 , 15 . In dit protocol beschrijven we de details voor het uitvoeren van S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated en S gekozen H ybrids (SPLASH), die biotinyleerde psoralen gebruikt om RNA&#39;s in vivo te crosslinken, gevolgd door proximale ligatie en high-through sequencing naar Identificeer RNA base-pairing partners genoom breed ( figuur 1 ) 15 . In dit manuscript beschrijven we de stappen om SPLASH uit te voeren met behulp van gekweekte aanhechtende cellen, in dit geval HeLa-cellen. Hetzelfde protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan suspensie zoogdiercellen en aan gist- en bacteriecellen. In het kort worden HeLa-cellen behandeld met biotinyleerde psoralen en bestraald bij 365 nm om interactie RNA-basisparen in vivo te crosslinken. De RNA&#39;s worden dan geëxtraheerd uit de cellen, gefragmenteerd en verrijkt voor verknopingsgebieden onder toepassing van streptavidine kralen. Interactieve RNA-fragmenten worden dan gelijktijdig gelijktijdig gelijktijdig gelegeerd en in een cDNA-bibliotheek gemaakt voor diepvolgorde. Bij sequentiebepaling worden de chimere RNA&#39;s op het transcriptoom / genoom toegewezen om de RNA-interactie-gebieden die met elkaar gepaard zijn te identificeren. We hebben SPLASH succesvol gebruikt om duizenden RNA-interacties in vivo te identificeren in gist en verschillende menselijke cellen, waaronder intramoleculaire en intermoleculaire RNA base pairing in diverse klassen van RNA&#39;s, zoals snoRNAs, lncRNAs en mRNAs, om te kijken naar de structurele organisatie en interactiepatronen Van RNA&#39;s in de cel.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10787026</td><td>DNA ladder</td></tr><tr><td>10 bp DNA ladder</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10821-015</td><td>DNA ladder</td></tr><tr><td>20% SDS solution</td><td>First BASE</td><td>BUF-2052-1L&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>First BASE</td><td>BUF-3050-20X1L</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Sodium Acetate Solution</td><td>First BASE</td><td>BUF-1151-1L-pH5.2&nbsp;&nbsp;</td><td>Vereist voor nucleïnezuurprecipitatie</td></tr><tr><td>40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610145</td><td>TBE Urea gel component</td></tr><tr><td>Ambion Buffer Kit</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate, Molecular Grade&nbsp;&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V3131&nbsp;</td><td>TBE Urea gel component</td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chloorform</td><td>Merck</td><td>1.02445.1000</td><td>RNA extractie</td></tr><tr><td>Single strand DNA ligase</td><td>Epicentre</td><td>CL9025K</td><td>CircLigase II ssDNA Ligase</td></tr><tr><td>Centrifugebuisfilters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8160-96EA</td><td>Costar Spin-X centrifugebuisfilters</td></tr><tr><td>D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628-1G</td><td>Voor celbehandeling</td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator&nbsp;</td><td>Clare Chemical Research</td><td>Dark Reader DR89X Transilluminator</td><td>Blauwe lichttransilluminator</td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>R0611</td><td>Vereist voor agarose gel elektroporatie</td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Arends Medium</td><td>Pan BioTech</td><td>P04-03500</td><td>Voor Hela celcultuur</td></tr><tr><td>Streptavidine magnetische kralen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>65002</td><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnetische standaard voor 15&nbsp;mL buizen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12301D</td><td>DynaMag-15</td></tr><tr><td>Magnetische standaard voor 15&nbsp;mL buizen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.015</td><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp;C</td></tr><tr><td>Biotinyleren psoraleen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>29986</td><td>EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin</td></tr><tr><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>365 nm UV lamp</td></tr><tr><td>Fetaal Rundserum</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10270106&nbsp;&nbsp;</td><td>Componenten van Hela medium</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Promega</td><td>H5052&nbsp;&nbsp;</td><td>Component in hybridisatiebuffer</td></tr><tr><td>G8T5</td><td>Sankyo-Denki</td><td>G8T5</td><td>254 nm UV lamp</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10814010</td><td>Vereist voor nucleïnezuur precipitatie</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Nanodrop 2000</td><td>Spectrofotometer voor nucleïnezuur kwantificering</td></tr><tr><td>Nuclease vrij water&nbsp;</td><td>First BASE</td><td>BUF-1180-500ml&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine&nbsp;&nbsp;</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15140122&nbsp;&nbsp;</td><td>Componenten van Hela medium</td></tr><tr><td>High-Fidelity DNA polymerase (2x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>F531L&nbsp;</td><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix met HF Buffer (2x)</td></tr><tr><td>Primer Set 1</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335L&nbsp;</td><td>PCR primers</td></tr><tr><td>DNA Gel Extractie Kit</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>QIAquick Gel Extractie Kit</td></tr><tr><td>Fluorometrische Kwantificering kit</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Q32854</td><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td></tr><tr><td>RNA opruimset</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNeasy Mini Kit Silica-membraankolom</td></tr><tr><td>Rnase Inhibitor</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM2696</td><td>SUPERase In</td></tr><tr><td>Reverse transcriptase</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>18080400</td><td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix</td></tr><tr><td>Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>S11494</td><td>SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>End reparatie enzym</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>Enzym voor proximale ligatie</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2, afgeknotte KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373L</td><td>Enzym voor adapterligatie</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>TBE Urea gel component</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15596018</td><td>TRIzol&reg; Reagent voor RNA extractie</td></tr><tr><td>Urea</td><td>First BASE</td><td>BIO-2070-5kg&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Stratalinker 1800</td></tr><tr><td>UV Transilluminator</td><td>UVP</td><td>95-0417-01</td><td>Voor het visualiseren van bands</td></tr><tr><td>Xyleen Cyanool FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>DNA cleanup it</td><td>Zymo Research&nbsp;</td><td>D4004</td><td>Zymo DNA concentrator-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Lijst van vereiste software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC software</td><td>0.11.4</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td></tr><tr><td>SeqPrep software</td><td>1.0.7</td><td>https://github.com/jstjohn/SeqPrep</td><td></td></tr><tr><td>BWA software</td><td>0.7.12</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td></td></tr><tr><td>SAMTOOLS software</td><td>1.2.1</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr><tr><td>PULLSEQ software</td><td>1.0.2</td><td>https://github.com/bcthomas/pullseq</td><td></td></tr><tr><td>STAR software</td><td>2.5.0c</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td></td></tr><tr><td>rem_dups.py PYTHON script</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>find_chimeras.py PYTHON script</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5

mapping rna-rna interactions globally using biotinylated psoralen

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Het weten hoe RNA&#39;s met zichzelf en met anderen interageren, is de sleutel tot het begrijpen van RNA-gebaseerde genregulering in de cel. Terwijl voorbeelden van RNA-RNA-interacties, zoals microRNA-mRNA-interacties, zijn aangetoond dat de expressie van genen wordt geregeld, is de volledige mate waarin RNA-interacties zich voordoen in de cel nog steeds onbekend. Eerdere methoden om RNA-interacties te bestuderen hebben voornamelijk betrekking op subsets van RNA&#39;s die interactie hebben met een bepaald eiwit- of RNA-soort. Hierin geven we een methode aan, genaamd S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated, en S gekozen H ybrids (SPLASH), die genoom-breed vastleggen van RNA-interacties in vivo op een onpartijdige manier mogelijk maakt. SPLASH maakt gebruik van in vivo crosslinking, proximity ligatie en high throughput sequencing om wereldwijd intramoleculaire en intermoleculaire RNA base pairing partners te identificeren. SPLASH kan worden toegepast op verschillende organismen, waaronder bacteriën, gist en menselijke cellen, evenals aS diverse cellulaire condities om het begrip van de dynamiek van RNA organisatie onder diverse cellulaire contexten te vergemakkelijken. Het volledige experimentele SPLASH-protocol duurt ongeveer 5 dagen om te voltooien en de berekeningswerkstroom duurt ongeveer 7 dagen om te voltooien.

Figuur 1 geeft de schematische weergave van de SPLASH workflow weer. Bij de toevoeging van biotinyleerde psoralen in aanwezigheid van 0,01% digitonine en UV-verknoping wordt het totale RNA uit de cellen geëxtraheerd en wordt een dot blot uitgevoerd om ervoor te zorgen dat verknoping van biotinyleerd aan het RNA efficiënt is gebeurd ( Figuur 2 ). We gebruiken biotinyleerde 20 base oligo&#39;s als positieve controles om de hoeveel...

Hier worden we gedetailleerd beschreven over de methode van S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated en S gekozen H ybrids (SPLASH), die genoom-wide mapping van intramoleculaire en intermoleculaire RNA-RNA interacties in vivo mogelijk maakt . SPLASH kan toegepast worden om RNA-interacties van organismen te bestuderen, waaronder gist, bacteriën en mensen.

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Het algemene doel van deze video is het beschrijven van de methode voor sequencing van psoralen-crosslinked ligated and selected hybrids of SPLASH, waarbij paarsgewijze in vivo RNA-RNA-interacties op genoombrede schaal in kaart worden gebracht. Deze techniek is een eenvoudige methode met een hoge doorvoersnelheid voor het in kaart brengen van RNA-interacties in vivo. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de RNA-genomics, zoals de wijze waarop verschillende regio's langs een enkele RNA-streng of tussen verschillende RNA-strengen met elkaar interageren.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in gist- en menselijke cellen, kan deze ook worden toegepast op studies naar andere moderne organismen, waaronder bacteriën en celmembranen. We kregen het eerste idee voor deze methode toen we een manier zochten om moleculaire interacties in kaart te brengen. Let op dat de volgende procedure verschillende stoppunten bevat.Op deze momenten kan het experiment kortstondig of onbepaald worden onderbroken. Details hiervoor zijn te vinden in de begeleidende tekst. Begin deze procedure door HeLa-cellen twee keer te wassen met vijf milliliters PBS.Plaats de schaal ged

mapping-rna-rna-interactions-globally-using-biotinylated-psoralen

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

RNA transcripten zijn onderworpen aan een uitgebreide posttranscriptionele regulering die wordt bemiddeld door een veelheid van trans-werkende RNA-bindende eiwitten (RBPs). Hier presenteren wij een generaliseerbaar methode om te identificeren precies en op een transcriptoom schaal van de RNA-bindingsplaatsen van RBPs.

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

Lasers worden vaak gebruikt in studies van de cellulaire respons op DNA-schade. Echter, ze genereren lesies waarvan de afstand, frequentie en botsingen met replicatievorken worden zelden gekenmerkt. We beschrijven een benadering die de bepaling van deze parameters laser gelokaliseerde crosslinks tussen de strengen mogelijk maakt.

Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Een gedetailleerd protocol voor de toepassing van de klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vastleggen (CARIC) strategie ter identificatie van eiwitten bindende naar beide taalcode-instellingen en noncoding RNAs wordt gepresenteerd.

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

RNA/eiwitcomplexen gezuiverd met behulp van botin-streptavidine strategie worden geëlueerd oplossing onder denatureren voorwaarden in een vorm die ongeschikt zijn voor verdere zuivering en de functionaalanalyse. Hier beschrijven we een wijziging van deze strategie dat gebruik maakt van een foto-cleavable linker in RNA en een zachte UV-elutie stap, inheemse en volledig functionele RNA/eiwitcomplexen oplevert.

-Voor-stapmodus zuivering van macromoleculaire complexen met behulp van RNA gekoppeld aan biotine en een foto-cleavable Linker

Hier beschrijven we de assemblage van RNA polymerase II (Pol II) rek complexen waarvoor alleen korte synthetische DNA en RNA oligonucleotiden en gezuiverde Pol II. Deze complexen zijn nuttig voor het bestuderen van mechanismen die onderliggende co-transcriptionele verwerking van transcripties in verband met het Pol II rek complex.

Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen

Hier zijn de protocollen voor in vitro biochemische assays met behulp van biotine etiketten die algemeen toepasbaar voor het bestuderen van eiwit-nucleïnezuur interacties.

In vitro biochemische assays met behulp van biotine etiketten om eiwit-nucleïnezuur interacties te bestuderen

Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.

Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Leer de SPLASH-methode voor wereldwijde in vivo mapping van RNA-RNA-interacties met behulp van gebiotinyleerde psoralen. Deze eenvoudige, hoogdoorvoettechniek is toepasbaar op gist, bacteriën en humane cellen.

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Meer video's verkennen