Name: Kleinschalig Voortplanting van Human iPSCs in serum-vrij Voorwaarden voor Routine Immunocytochemisch karakterisering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Leer een kleinschalige kweekmethode voor humane iPS-cellen in serumvrije omstandigheden voor routine-immunocytochemische karakterisering. Deze techniek bespaart tijd en kosten bij het onderzoek naar stamcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financieringsbronnen: De Universiteit van Arizona, De Jim Himelic Stichting en het Arizona Centrum voor de Biologie van Complexe Ziekten.

hiPSCs werden afgeleid uit menselijke huidfibroblasten geïsoleerd van 4 mm huid punch biopsieën en opnieuw geprogrammeerd in huis via Sendai-virus bemiddelde herprogrammering 11. De universiteit van Arizona Institutional Review Board goedgekeurd alle procedures voor de werving van deelnemers en biopsie collectie. 1. Voorbereiding van de extracellulaire matrix gecoate oppervlak voor iPSC Cultuur <ol><li> Op een dag voorafgaand aan de samenvloeiing van iPSC culturen groeien op iMEFs, bereiden extracellulaire matrix (Matrigel) beklede platen. </li><li> Langzame dooi een hoeveelheid van de extracellulaire matrix (lot afhankelijk is de instructies in de beschrijving) op ijs in 4 ° C gedurende 2 uur. </li><li> In een bio kap, met koud pipetpunten (bewaard bij -20 ° C), voeg 1 portie van extracellulaire matrix koude Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12 / HEPES) volgens de partijspecifieke verdunningsfactor . </li><li> Verdeel ~ 60081, L extracellulaire matrix per putje van elke nieuwe celcultuur behandeld 12-well plaat nodig. </li><li> Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende verscheidene uren. Hier, gebruik dan een 3 uur incubatietijd. OPMERKING: Platen kunnen direct worden gebruikt of voor maximaal twee weken opgeslagen bij 4 ° C. </li></ol> 2. Overdracht van hiPSCs Grown op iMEF Feeder cellen op extracellulaire matrix voor de voortplanting <ol><li> Op de dag van passage, verwijder de matrix beklede plaat bij 4 ° C en laat de verdichter acclimatiseren tot kamertemperatuur gedurende 1 uur in de weefselkweek kap. </li><li> Zuig het medium van 1 putje van een 6-well plaat van iPSC cultuur groeien op iMEFs en te vervangen door 500 ul collagenase dissociatie reagens (1 mg / ml in de basale kweekmedium). </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende ~ 10 - 30 minuten tot de randen van de iPSC kolonies lijken iets omhoog. LET OP: Incubatietijd is lijn afhankelijk en zal variëren. Monitor dissociatie onder een microscoop. </li><li> Autoefully zuig het dissociatie reagens en was voorzichtig 2 maal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4). </li><li> Voeg 1 ml kamertemperatuur mTeSR1 compleet medium met 10 ng / ml Rho-geassocieerde proteïne kinase inhibitor (Y-27632 ROCK inhibitor) aan de put. LET OP: Het gebruik van een 50:50 mengsel van iMEF-geconditioneerd medium en mTeSR1 tijdens deze eerste passage wordt voorgesteld en kan nuttig zijn voor het voortbestaan ​​van de hiPSCs tijdens deze media overgang. </li><li> Met behulp van een kleine fasecontrastmicroscoop gedeeltelijk aan de binnenkant van de kap, met de hand scoren en pick 1-2 iPSC kolonies (~ 700 - 1000 micrometer in diameter) met behulp van een injectiespuit en naald (25 G, 1½ in). Duwen de scoorden stukken van de kolonie in het medium met een P200 pipet tip. </li><li> Aspireren en afvoeren van de matrix van de nieuwe plaat, zorg dat u de coating niet te verstoren. </li><li> Breng 1 ml van de celsuspensie uit de oude putje met de ingesneden iPSCs in de nieuwe matrix goed bedekt. </li><li> Place de plaat in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2. Rock de plaat in een aantal snelle, heen-en-weer, en side-to-side bewegingen gelijkmatig verspreid de cellen. Raak de plaat niet storen gedurende 24 uur. </li><li> Voer dagelijkse full media verandert met mTeSR1 compleet medium (toevoeging van Y-27632 ROCK Inhibitor is niet nodig na de eerste plating in stap 2.5). </li></ol> 3. Kleinschalig Passage van hiPSCs on-matrix gecoate platen OPMERKING: algemeen, na de eerste overdracht van de hiPSCs op beklede platen matrix, de cellen worden opnieuw aan passage op dezelfde wijze te waarborgen dat alle iMEFs zijn geëlimineerd en cellen aangepast feeder-vrije omstandigheden. <ol><li> Eén dag voor iPSC samenvloeiing bereiden vers beklede matrix platen zoals besproken in paragraaf 1. </li><li> Op de dag van de passage, verwijder de matrix gecoate plaat uit 4 ° C incubatie en laat de plaat te acclimatiseren op kamertemperatuur gedurende 1 uur in het weefsel cultuur capuchon. </li><li> Zuig het medium van 1 putje van een 6-wells plaat van hiPSCs (oorspronkelijk overgegaan van feeder naar matrix) en vervang met 500 ul cel dissociatie buffer. OPMERKING: De commerciële celdissociatiebuffer hier gebruikt (zie Materialen Table) is geschikt voor mTeSR1 medium vergeleken met collagenase. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3-7 min tot de randen van de iPSC kolonies lijken iets omhoog. Zoals eerder vermeld, de incubatietijd lijn en afhankelijke variabele. Daarom volgen de cellulaire dissociatie onder een microscoop om het optimale tijdstip te bepalen. </li><li> Zorgvuldig aspireren de dissociatie buffer en was voorzichtig 2 keer met PBS. </li><li> Voeg 500 ul van kamertemperatuur mTeSR1 compleet medium met 10 ng / ml Y-27632 ROCK inhibitor aan de put. </li><li> In plaats van scoren kolonies als in stap 2.6, druk op de gewenste aantal kolonies in de media met behulp van een P200 tip en voorzichtig vermaal de celsuspensie 2 keer against een hoek van de put om de iPSC kolonies breken in groepjes ~ 50-200 urn in grootte. Bijvoorbeeld, voor een 12-well plaat, pick 1-2 kolonies te dragen in elk 1 nieuwe put. Breng de celsuspensie uit de oude put tot één nieuw putje van een 12-wells plaat. </li><li> Rock de plaat in een aantal snelle, heen-en-weer, en side-to-side bewegingen gelijkmatig verspreid de cellen, en laat de plaat rusten gedurende 24 uur in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator. </li><li> Voer dagelijkse full media verandert met mTeSR1 compleet medium. Zoals eerder vermeld, is het niet nodig om Y-27632 ROCK inhibitor toe na de eerste plating. OPMERKING: Ongebruikte iPSC kolonies van stap 3,7 gemakkelijk gecryopreserveerde op dit punt. </li></ol> 4. Voorbereiding van de Kamer Slides en Coverslips voor het zaaien van hiPSCs voor Immunocytochemie LET OP: Het volgende protocol maakt gebruik van 4-well plastic kamer dia&#39;s en 12 mm dekglaasjes met appropriate volumes van de media in de multi-wells kosteneffectieve immunocytochemie ondersteunen. Echter kan mediavolumes worden verhoogd indien het gebruik van grotere goed dekglaasje en maten gewenst. <ol><li> Eén dag voor iPSC samenvloeiing, voorbereiding van dia&#39;s kamer vers bekleed met extracellulaire matrix zoals besproken in deel 1. Voeg genoeg matrix-oplossing (~ 300-500 ul per putje van een 4-well kamer dia) om volledig vacht goed elke zonder enige zorg van verdamping. Als alternatief, na het plaatsen van 1 gereinigd en gesteriliseerd dekglaasje in elk putje van een 24-wells plaat, jas met 500 pi extracellulaire matrix en zorg ervoor dat het dekglaasje is niet drijven op de top van de oplossing. </li><li> Op de dag van passage, verwijder de beklede objectglaasjes kamer / dekglaasjes van 4 ° C en laat acclimatiseren tot kamertemperatuur gedurende 1 uur in de weefselkweek kap. </li><li> Zuig het medium van 1 putje van een 12-well plaat hiPSCs en vervangen door 500 pl dissociatie buffer. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur temperatuur voor ~ 3-7 min tot de randen van de iPSC kolonies lijken iets omhoog. </li><li> Zorgvuldig aspireren de dissociatie buffer en voeg 1 ml kamertemperatuur mTeSR1 compleet medium met 10 ng / mL Y-27632 ROCK Inhibitor naar de bron. </li><li> Met behulp van een kleine fasecontrastmicroscoop geplaatst in de weefselkweek kap, handmatig 1 kolonie / nieuwe putje van een 4-well kamer dia of 1 nieuw dekglaasje pick worden verzilverd (~ 1000 - 1500 micrometer in diameter) met behulp van een P200 pipet tip door te drukken het uit het plaatoppervlak in het medium. </li><li> Zuig de matrix van de nieuwe kamer slide / dekglaasje, zorg dat u de coating niet te verstoren. </li><li> Zachtjes vermaal de celsuspensie 2 keer tegen een hoek van de put om de iPSC kolonies breken in groepjes ~ 50-200 urn in grootte. Transfer 250 pi van de celsuspensie uit de oude put in elke nieuwe putje van een 4-well kamer slide / dekglaasje. </li><li> Breng het volume van iedere nieuwe put tot 500 pL met mTeSR1 containing 10 ng / mL Y-27632 ROCK Inhibitor. </li><li> Plaats de kamer schuif- / dekglaasjes in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Na 24 uur, uit te voeren dagelijkse full media verandert met mTeSR1 compleet medium. Opnieuw zoals eerder vermeld, de toevoeging van Y-27632 ROCK Inhibitor hoeft na de eerste plating. </li></ol> 5. Voorbereiding van de iPSC voor Immunocytochemie <ol><li> Eenmaal samenvloeiing, het behoud van de iPSC kolonies via fixatie door het verwijderen van het materiaal uit de putten en het toevoegen van voorverwarmde LET OP 4% paraformaldehyde (~ 300 ul / putje van een 4-well kamer slide / dekglaasje). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min. </li><li> Gooi de paraformaldehyde adequaat volgens de institutionele biologisch en chemische veiligheidsrichtlijnen. </li><li> Was de cellen 3 maal gedurende 5 minuten elk op een bench-top shaker met PBS. OPMERKING: Cellen op kamer dia / dekglaasjes kan worden opgeslagen met ruime PBS bij 4 ° C oneindig in dit stadium.Als alternatief kunnen zij direct worden gebruikt voor ICC. </li></ol> 6. Immunokleuring van hiPSCs met Pluripotentie Markers LET OP: Immunostain hiPSCs met standaard pluripotentie antilichamen. Als voorbeeld, hier cellen dubbel gekleurd met antilichamen gericht op één oppervlak en 1 1 intracellulair antigeen in een sequentiële wijze als volgt: Anti-Stage-Specific Antigen Embryonale-4 (SSEA4) met anti-octameer-bindend eiwit 4 (OCT- 4) en anti-Tra-1-60 met anti-SRY verwante HMG BOX gen 2 (SOX2) (zie de Materialen Tafel voor antilichaam details). <ol><li> Zuig het PBS uit de putjes en voeg 500 ul / putje blokkeeroplossing zonder Triton-X-100. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Bereid een vooraf bepaalde concentratie (hier gebruikt 1: 200) van het oppervlak antilichamen, hetzij SSEA4 of Tra-1-60, door verdunning in blokkeeroplossing zonder Triton X-100. <ol><li> Voor kamer dia&#39;s, voor te bereiden 300 ul / putje van een 4-well kamer diadoor het mengen van 298,5 ul van blokkeeroplossing hierboven en 1,5 pl anti-SSEA4 of Tra-1-60 primair antilichaam. </li><li> Voor dekglaasjes bereiden 40 ul / dekglaasje door het mengen van 199 pl blokkeeroplossing en 1 pl anti-SSEA4 of Tra-1-60 primair antilichaam. </li></ol></li><li> Zuig het blokkeren oplossing uit de kamer glijbaan en afzien van het primaire antilichaam in geschikte putjes. Voor dekglaasjes, plaats een stukje parafilm stevig in een petrischaal en afzien 40 pl van het primaire antilichaam op de top als een druppel. Met behulp van een gebogen injectienaald en een tang, til de dekglaasje uit de cultuur goed en plaats deze cel kant naar beneden op de daling van het antilichaam op de parafilm. Incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> De volgende ochtend, 3 keer, 5 was de cellen - 10 minuten elk, door het verwijderen van het antilichaam uit de kamer glijbaan en toevoegen van PBS. Voor dekglaasjes Til elk van de parafilm en plaats het terug in een putje van een 24-well plaat, cel kant naar boven. Voeg voorzichtig PBS. </li><li> Bereid passende secundaire antilichamen 1: 500 in de Blocking Solution. <ol><li> Voor Kamer slides Bereid 300 ul / putje van een 4-well kamer dia door het mengen van 499 pl blokkeeroplossing en 1 pl geit anti-muis IgG3 Alexa Fluor 488 (voor SSEA4) of 1 pl geit anti-muis IgM Alexa Fluor 488 (voor Tra-1-60). </li><li> Voor dekglaasjes bereiden 40 ul / dekglaasje door het mengen van 499 pl blokkeeroplossing en 1 pl geit anti-muis IgG3 Alexa Fluor 488 (voor SSEA4) of 1 pl geit anti-muis IgM Alexa Fluor 488 (voor Tra-1-60 ). </li></ol></li><li> Zuig het PBS uit de kamer glijbaan en afzien van het secundaire antilichaam in geschikte putjes. Voor dekglaasjes, volgende stap 6,2, keer de dekglaasjes op de antilichaamoplossing parafilm geplaatst bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. LET OP: Bij gebruik van fluorescerende gelabeld secundaire antilichamen, moet de cellen worden beschermd tegen het licht. Plaats de kamer dia&#39;s en de dekglaasjes in een donkere environment tijdens incubaties en wast. </li><li> Was de cellen 3 maal gedurende 5-10 minuten elk door verwijdering van het antilichaam uit de kamer glijbaan en toevoegen van PBS. Voor dekglaasjes Til elk voorzichtig uit de parafilm en plaats opnieuw in een putje van een 24-wells plaat, cel naar boven. Voorzichtig PBS toe te voegen tijdens wasbeurten. </li><li> Vóór peilen naar de tweede antigeen intracellulair oktober-4 of SOX2 in casu incuberen in blokkeeroplossing opnieuw gemaakt met permeabilisatie reagens (Triton-X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Om immunostain voor oktober-4 of SOX2, volgt u de in de stappen 6,1-6,6 beschreven voor het aanbrengen van de primaire en secundaire antilichamen methodologie. Voor de toepassing van dit protocol gebruikt oktober-4 en SOX2 bij een concentratie van 1: 200 en het secundaire antilichaam geit anti-konijn IgG Alexa Fluor 594 op 1: 500. </li><li> elke 10 min met PBS en tegenkleuring met 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2 - Na de bovengenoemde primaire en secundaire antilichaam behandelingen, was de cellen 3 keer voor 5-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) volgende standaard protocollen als nucleaire visualisatie is gewenst. </li></ol> 7. Voorbereiding voor Viewing <ol><li> Voor kamer dia&#39;s, verwijder voorzichtig de bovenste kamer van de glijbaan, volgens de instructies van de fabrikant. Dan afspoelen in gedestilleerd water en voeg montage medium en een dekglaasje te microscopie mogelijk te maken. </li><li> Voor dekglaasjes, keren de dekglaasjes naar een druppel montage medium op een microscoopglaasje geplaatst. </li><li> Afbeelding onder een standaard of confocale fluorescentiemicroscoop. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Hallett, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+function+of+autologous+iPSC-derived+dopamine+neurons+following+transplantation+in+a+non-human+primate+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease.</a> Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).</li>
<li>Haston, K. M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Trials+in+a+Dish%3A+The+Potential+of+Pluripotent+Stem+Cells+to+Develop+Therapies+for+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+rev+pharm+toxicol%22%5BJournal%5D)">Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases.</a> Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+heart+fail%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).</li>
<li>Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+subpopulation+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts.</a> PloS one. 4, 7118(2009).</li>
<li>Sivapatham, R., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+Characterization+of+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+for+Disease+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling.</a> Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Ruff, D., Lieu, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+stem+cells+using+quantitative+PCR+protein+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays.</a> Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).</li>
<li>Pripuzova, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protein+marker+panel+for+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28hiPSCs%29+using+global+quantitative+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res%22%5BJournal%5D)">Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis.</a> Stem cell res. 14, 323-338 (2015).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+jpn+acad+ser+B+phys+biol+sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Bigdeli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+embryonic+stem+cells+to+feeder-free+and+matrix-free+culture+conditions+directly+on+plastic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces.</a> J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De systematische protocol hier gepresenteerde een tijdbesparende en kosteneffectieve methode, in de vorm van een verkleinde kweektechniek, speciaal ontworpen om effectieve pluripotentie analyse ondersteunen via immunocytochemie. De belangrijkste voordelen van de beschreven werkwijze zijn als volgt. Traditioneel meer dan 3-4 passages nodig zijn iPSCs van voedingslagen overgang naar voedingsvrije kweekomstandigheden om resterende iMEFs resteert na de toepassing van bulk dissociatie technieken ...

Herprogrammeren van menselijke volwassen somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) biedt een manier om een potentieel onbeperkt aanbod van patiënt-specifieke cellen te krijgen om te studeren en vaatziekten 1, 2. Recapitulerend een ziekte fenotype in vitro zou het aannemelijk cellulaire en moleculaire mechanismen van ziekte en versterken en geneesmiddelen en gepersonaliseerde geneeskunde 3. Bovendien humane iPSCs (hiPSCs) bieden de mogelijkheid het afleiden specifieke celtypen die als unieke bron kan worden gebruikt om dode cellen te vervangen of disfunctioneel en herstelfunctie in de context van diverse aandoeningen 4, 5. Een belangrijke voorwaarde voor het gebruik van iPSCs in de bovengenoemde toepassingen is ervoor te zorgen dat hun pluripotente en ongedifferentieerde staat tijdens de expansie in de cultuur in stand wordt gehouden. Typisch, techniqUES zoals flowcytometrie, Western blotting, polymerasekettingreactie en functionele testen die grote hoeveelheden cellen en gespecialiseerde apparatuur nodig, worden gebruikt voor een gedetailleerde analyse van iPSC pluripotentie 6, 7, 8, 9, 10. Echter, routine evaluatie van ongedifferentieerde staat de iPSCs &#39;kan effectief worden bereikt door de beperkte verspreiding van deze cellen specifiek voor immunocytochemie (ICC), dus met betrekking tot verminderde tijd en middelen. Recente ontwikkelingen zorgen voor de groei van iPSCs in gedefinieerde serumvrije omstandigheden, hetgeen een aanzienlijke verbetering ten opzichte van conventionele kweeksystemen die murine fibroblast feeder lagen en serum bevattende media vereisen. Echter, de huidige literatuur niet bevatten duidelijke stapsgewijze protocollen die beschrijven hoe iPSCs van feeder overganglaag op voedingsvrije systemen. In dit verband systematisch beschrijft de onderhavige protocol hoe hiPSCs gekweekt op bestraalde muis embryonale fibroblasten (iMEF) feeder lagen kan (1) ingericht voor het propageren in serumvrij medium, en (2) gekweekt op kleine schaal specifiek ondersteunen robuuste immunocytochemische analyse. Kortom, dit methode is een tijdige en kosteneffectieve procedure voor het vermeerderen van menselijke iPSCs in serum-vrije omstandigheden ter bevestiging van hun pluripotentie op een routine-basis met behulp van immunocytochemie.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12/HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-Basic</td><td>Cell Sciences</td><td>CRF001B</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK Inhibitor</td><td>R&amp;D</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC-qualified Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Basal Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 5x Supplement</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Buffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>07174</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M PO4 Buffer</td><td>In-House</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, prill</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb</td><td>Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling</td><td>2840 3579 4755 4746</td><td>Alternatief kan een combinatie van 6 pluripotentie primaire antilichamen worden gekocht als een kit in Catalogus #9656</td></tr><tr><td>Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21151</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Cell Culture Plates</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>0720080/0720081</td><td>Beschikbaar in 6, 12, 24, 48, 96 well maten</td></tr><tr><td>Chamber Slides</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12 565 21</td><td>Beschikbaar in glas of Permanox plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well maten</td></tr><tr><td>Coverglass voor groei</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12 545 82</td><td>Beschikbaar in 12, 15, 18, 22 en 25 mm maten</td></tr></tbody></table>

kleinschalig voortplanting van human ipscs in serum-vrij voorwaarden voor routine immunocytochemisch karakterisering

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

Er is veel belangstelling voor het gebruik van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) voor ziektemodellering en celtherapieën vanwege hun patiëntspecificiteit en karakteristieke stamceleigenschappen. De pluripotentie van iPSC's, die essentieel is voor hun functionaliteit, moet echter worden bevestigd voordat deze cellen in dergelijke toepassingen kunnen worden gebruikt. Hoewel een rigoureuze karakterisering van iPSC's, door middel van verschillende cellulaire en functionele assays, noodzakelijk is om hun pluripotentie vast te stellen, kan routinematige beoordeling van het behoud van pluripotentie eenvoudiger en effectiever worden bereikt door middel van immunocytochemische technieken. Hier presenteren we een systematisch protocol voor het kweken van hiPSC's, op een verkleinschaalde manier, om met name de verificatie van hun pluripotente toestand te vergemakkelijken door middel van immunocytochemie. Meer specifiek omvat deze methodologie een efficiënte en kosteneffectieve manier om iPSC's te laten groeien in serumvrije omstandigheden en ze te plateren op kleine kamerslides of glazen dekglasjes die ideaal zijn voor immunocytochemie.

Dit protocol verschaft een stapsgewijze beschrijving van hoe menselijke iPSCs kan worden overgedragen van voedingslaag feeder-vrije omstandigheden, en vervolgens vermeerderd in beperkte mate in staat om specifiek kosteneffectieve immunocytochemie te bevestigen pluripotentie onderhoud. Figuur 1 toont een schematische weergave van dit protocol. Figuur 2A toont iPSC kolonies groeien op iMEFs in 6-well platen. Deze kolonies vertonen typische morfologie met g...

Regelmatige karakterisering van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), om het behoud van hun pluripotente toestand vast te stellen, is een belangrijke stap voordat deze cellen voor andere toepassingen worden gebruikt. Hier beschrijven we een methode voor de kleinschalige vermenigvuldiging van menselijke iPSC's, specifiek ontworpen om hun eenvoudige en routinematige karakterisering via immunocytochemie mogelijk te maken.

Kleinschalig Voortplanting van Human iPSCs in serum-vrij Voorwaarden voor Routine Immunocytochemisch karakterisering

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

Het algemene doel van deze kweekmethode is het vermeerderen van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, of menselijke iPSCs, op kleine schaal om specifiek hun routinematige karakterisering via immunocytochemie mogelijk te maken. Dit protocol uit mijn laboratorium presenteert een techniek voor het verkleinen van de schaal om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen over te brengen van de onderliggende foetale laag naar een substraat dat geschikter is voor antigeendetectie met behulp van specifieke pluripotentiteitsantilichamen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een tijd- en kosteneffectieve manier biedt om pluripotente cellen te kweken in kleine kamerslides of op dekglasjes, die ideaal zijn voor immunocytochemie.Verwijder op de dag van het passeren de met matrix gecoate plaat uit de koelkast (4 °C) en laat de plaat één uur acclimatiseren naar kamertemperatuur in de weefselkweekkap. Aspireer vervolgens het medium uit één putje van een zes-puts plaat met menselijke iPSC-culturen die groeien op iMEFs en vervang dit door 500 µL collagenase-dissociatiereagens. Incubeer de cellen vervolgens 10 tot 30 minuten bij 37 °C totdat de randen van de iPSC-kolonies onder de microscoop licht lijken op te tillen; aspireer daarna voorzichtig het dissociatiereagens en was de cellen twee keer voorzichtig met PBS.Aangezien het dissociatieprofiel van elke specifieke iPSC-lijn kan verschillen, is het belangrijk om de loslating van koloniën onder een microscoop te volgen om de optimale incubatietijd met het dissociatiereagens te bepalen. Voeg één milliliter mTeSR-volledig medium op kamertemperatuur met 10 nanogram per milliliter ROCK-remmer toe aan de put. Gebruik een kleine fasecontrastmicroscoop die gedeeltelijk in de laminaire flowkast is geplaatst om handmatig één tot twee menselijke iPSC-koloniën te markeren en te selecteren.Duw de uitgesneden stukjes van de kolonie met een P200-pipetpunt in het medium. Aspireer daarna de matrix uit de nieuwe wells die geplaatst gaan worden, waarbij u er zorgvuldig op let dat de coating niet wordt verstoord. Breng één milliliter van de celsuspensie uit de oude well met de uitgesneden iPSCs over naar de nieuwe matrix-gecoate well.Plaats de plaat in de incubator en schud de plaat met enkele korte heen-en-weerse en zijwaartse bewegingen om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur. Na de overdracht van de humane iPSCs van iMEF naar de extracellulaire matrix, worden ze overgebracht naar een 12-wells plaat op een manier die vergelijkbaar is met de voorgaande passage-stappen.Deze passage maakt het mogelijk om alle resterende iMEF's uit de cultuur te elimineren en zorgt ervoor dat de cellen zich aanpassen aan feeder-vrije condities. Duw het gewenste aantal koloniën met een P200-tip in het medium en titreer de celsuspensie voorzichtig twee keer tegen één hoek van de well om de humane iPSC-koloniën op te breken in klonters van ongeveer 50 tot 200 micrometer grootte. Duw voor een 12-wellplaat één tot twee koloniën in het medium en breng vervolgens de celsuspensie van de oude well over naar één nieuwe well van een 12-wellplaat.Beweeg de plaat in enkele korte heen-en-weerse en zijwaartse bewegingen om de cellen gelijkmatig te verspreiden en laat de plaat 24 uur rusten bij 37 graden Celsius. Deze sectie behandelt het passeren van de iPSC's in de 12-well platen en het uitplaten ervan op kleine kamerglaasjes en dekglasjes die geschikt zijn voor immunocytochemie. Aspireer bij deze procedure het medium uit één well van een 12-well plaat met menselijke iPSC's en vervang dit door 500 microliters dissociatiebuffer.Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende ongeveer drie tot zeven minuten totdat de randen van de iPSC-kolonies licht lijken op te tillen. Aspireer vervolgens voorzichtig de dissociatiebuffer en voeg één milliliter mTeSR-compleet medium op kamertemperatuur met 10 nanogram per milliliter ROCK-inhibitor toe aan de put. Gebruik een kleine fasecontrastmicroscoop in de weefselkweekkap om de losgekomen kolonies van het platoppervlak in het medium te duwen, en aspireer daarna de matrix uit de nieuwe 24-wellplaat met dekglasplaatjes en kamerglaasje, waarbij u er zorg voor neemt de coating niet te verstoren.Titreer de cel-suspensie voorzichtig twee keer tegen één hoek van de put om de menselijke iPSC-kolonies op te breken in klonten van ongeveer 50 tot 200 micrometers groot. Overbreng 250 microliters van de cel-suspensie vanuit de oude put naar elke nieuwe put van een chamber slide met vier putten. Bij het uitplaten op de dekglasjes wordt één kolonie uit de oorspronkelijke put losgeduwd door te titreren, waarna de cel-suspensie wordt overgebracht naar deze dekglasjes in de nieuwe putten van een 24-wells plaat.Vul vervolgens het volume van elke nieuwe put aan tot 500 µL met mTeSR1 dat 10 ng/mL Y27632 ROCK-remmer bevat. Plaats daarna de chamber slide en dekglasplaten in de incubator bij 37 °C. Zodra de menselijke iPSCs confluentie bereiken, worden de cellen klaargemaakt voor immunocytochemie met behulp van standaard fixatie met paraformaldehyde en blokkering voorafgaand aan de incubatie met het primaire antilichaam.Bereid nu een vooraf bepaalde concentratie van het oppervlakte-antilichaam, SSEA4 of TRA-1-60, door het te verdunnen in blokkeringsoplossing zonder Triton X-100. Bereid voor kamerdia's voldoende antilichaamoplossing door 298,5 µL blokkeringsoplossing te mengen met 1,5 µL anti-SSEA4 of TRA-160 primair antilichaam, zodat elke put 300 µL antilichaamoplossing ontvangt. Aspireer de blokkeringsoplossing uit de kamerdia en breng het primaire antilichaam aan in de betreffende putten.Voor dekglasplaatjes: breng 40 µL antilichaamoplossing aan op een schaaltje bekleed met Parafilm. Plaats het dekglasplaatje voorzichtig met de celzijde naar beneden op de oplossing en incubeer de cellen een nacht bij 4 °C. Verwijder de volgende ochtend de antilichaamoplossing van de chamber slides met vier putjes en was de cellen drie keer met PBS, telkens gedurende 5 tot 10 minuten.Plaats de dekglasjes terug in de putjes van een 24-wells plaat en was ze met PBS; volg vervolgens een vergelijkbare procedure als bij de incubatie met het primaire antilichaam voor de incubatie met het secundaire antilichaam, alvorens de immunogekleurde cellen voor fluorescentiemicroscopie voor te bereiden. Hier wordt de dichte iPSC-kolonie getoond die is gegroeid op iMEF-voedercellen. Na de initiële passage naar een matrix-gecoate 12-wells plaat in serumvrij medium kunnen er nog enkele iMEF's in de cultuur worden waargenomen.Deze afbeelding toont de typische morfologie van een monolaag iPSC-kolonie die zonder feeder-cellen is gekweekt; in dit stadium zijn er geen iMEF's meer aanwezig in de cultuur. De representatieve immunofluorescentiebeelden van iPSC's, verkregen via een confocale microscoop, tonen een positieve expressie van de pluripotentiemarkers Oct-4 en SSEA4 met de kernkleuring DAPI, en Sox2 en TRA-1-60 met DAPI. Deze twee zijn de overlay-beelden.Zodra deze techniek onder de knie is, biedt deze een economische manier om iPSC's van iMEF-feederlagen over te zetten naar matrixoppervlakken en immunocytochemie uit te voeren, wat tijd en dure reagentia bespaart. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat elke primaire iPSC-lijn zich anders gedraagt in kweek en gemonitord moet worden tijdens de passagerings- en uitplaatprocessen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u menselijke iPSC's op kleine schaal economisch kunt kweken en passageren voor routinematige immunocytochemische karakterisering.

small-scale-propagation-human-ipscs-serum-free-conditions-for-routine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Opschorting immunocytochemische kleuring van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) voor het celoppervlak markers (SSEA-3/SSEA-4) werd bereikt op basis van het gebruik van een zelfgemaakte Cytospin apparaat tot een monolaag van cellen voor observatie en kwantificering te creëren.

Immunocytochemische analyse van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een Self-Made Cytospin Apparatuur

We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Dit protocol beschrijft hoe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gegenereerd uit menselijke perifere T-cellen onder feeder-vrije omstandigheden door gebruik te maken van een combinatie van matrigel en Sendai-virusvectoren die reprogrammeringsfactoren bevatten.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

Hier rapporteren we een protocol voor het ontwikkelen van een driedimensionaal (3-D) systeem van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), het serumvrije embryoïde lichaam (SFEB) genoemd. Dit 3-D model kan gebruikt worden als een organotypische plakcultuur om menselijke corticale ontwikkeling te modelleren en voor de fysiologische ondervraging van neurale ontwikkelingen.

Ontwikkeling van HiPSC-afgeleide serumvrije embryoïde lichamen voor de ondervraging van 3-D stamcelculturen met behulp van fysiologisch relevante analyses

Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Een protocol is bedoeld om te bereiden polyvinyl alcohol-co-itacon zuur hydrogels met verschillende stijfheid, die waren geënt met en zonder oligopeptides, te onderzoeken van het effect van de stijfheid van biomaterialen op de differentiatie en de verspreiding van de cellen van de stam. De stijfheid van de hydrogels werd gecontroleerd door het crosslinking tijd.

Menselijke pluripotente stamcel cultuur op Polyvinyl Alcohol-Co-itacon zuur Hydrogels met verschillende stijfheid onder voorwaarden Xeno-gratis

Wij presenteren hier een protocol voor de differentiatie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen in elke Somiet derivaat (myotome, sclerotome, dermatoom en syndetome) in chemisch gedefinieerde voorwaarden, die toepassingen heeft in de toekomst ziekte modellering en cel-gebaseerde therapieën in orthopedische chirurgie.

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

Het doel van het protocol is om verschillende extracellulaire matrix (ECM) coatingcondities te vergelijken om te beoordelen hoe differentiële coating de groeisnelheid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) beïnvloedt. In het bijzonder streven we ernaar om voorwaarden te creëren om een optimale groei van iPSC-culturen te verkrijgen.

Het meten van de samenvloeiing van iPSC's met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem.

Hier beschrijven we een protocol dat de differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen tot functionele voorhersenspecifieke astrocyten mogelijk maakt. Dit maakt onderzoek mogelijk naar de rol van gliacellen in de pathogenese van neurologische ontwikkelingsstoornissen, zoals het Fragiele X-syndroom, en modellering van andere hersenaandoeningen.

Generatie en karakterisering van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten zonder fragiel X-boodschapperribonucleoproteïne

Leer een kleinschalige kweekmethode voor humane iPS-cellen in serumvrije omstandigheden voor routine-immunocytochemische karakterisering. Deze techniek bespaart tijd en kosten bij het onderzoek naar stamcellen.

Kleinschalig Voortplanting van Human iPSCs in serum-vrij Voorwaarden voor Routine Immunocytochemisch karakterisering

Meer video's verkennen