Name: gerichte In Situ Mutagenese van histon genen in gist (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Leer gerichte in situ mutagenese van histon genen in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode maakt precieze mutaties op endogene chromosomale locaties mogelijk om de rol van specifieke histon residuen in chromatine processen te onderzoeken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken Reine Protacio voor de nuttige opmerkingen tijdens de voorbereiding van dit manuscript. We danken de National Science Foundation (subsidienummers 1243680 en 1613754) en het Hendrix College Odyssey-programma voor de financiële ondersteuning.

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Rando, O. J., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin and transcription in yeast.</a> Genetics. 190 (2), 351-387 (2012).</li>
<li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+for+budding+geneticists%3A+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delitto+perfetto+targeted+mutagenesis+in+yeast+with+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Eng+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides.</a> Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).</li>
<li>Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+genomic+%28SSG%29+and+random+domain-localized+%28RDL%29+mutagenesis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast.</a> BMC Biotechnol. 4, 7(2004).</li>
<li>Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+PCR-based+allele+replacement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cloning-free PCR-based allele replacement methods.</a> Genome Res. 7 (12), 1174-1183 (1997).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
<li>Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18265094">Manipulation of cloned yeast DNA.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).</li>
<li>Hoffman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of yeast DNA.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).</li>
<li>Treco, D. A., Lundblad, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18265093">Preparation of yeast media.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J Bacteriol. 63 (3), 399-406 (1952).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li>
<li>Johnson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mutational+analysis+of+a+histone+H3+residue+in+budding+yeast+provides+insights+into+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics.</a> G3 (Bethesda). 5 (5), 741-749 (2015).</li>
<li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Res. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Cross, S. L., Smith, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+structure+and+cell+cycle+expression+of+mRNAs+encoded+by+two+histone+H3-H4+loci+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 8 (2), 945-954 (1988).</li>
<li>Libuda, D. E., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+histone+genes+by+circular+chromosome+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 443 (7114), 1003-1007 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hoge sequentie homologie tussen de twee niet-allelische genen die coderen voor elk van de vier kern histon eiwitten in S. cerevisiae haploïde cellen een uitdaging voor onderzoekers die willen specifiek op een van de twee genen voor mutagenese kan vertegenwoordigen. Eerder beschreven gist mutagenese methoden, waaronder Delitto Perfetto, plaatsspecifieke genomische (SSG) mutagenese en kloneren vrij-PCR-allel vervangingsmethoden 5, 6,</sup...

De vier kern histon-eiwitten H2A, H2B, H3, H4 en spelen een centrale rol in de verdichting, organisatie en functie van eukaryote chromosomen. Twee sets van elk van deze histonen vormen de histon octameer, een moleculaire spoel dat de verpakking van ~ 147 basenparen van DNA rond zichzelf richt, uiteindelijk resulterend in de vorming van een nucleosoom 1. Nucleosomen actief deel aan een verscheidenheid van chromosoom processen, zoals de regulering van gentranscriptie en de vorming van heterochromatine en euchromatine in chromosomen, en als zodanig zijn de focus van intens onderzoek in de loop van de afgelopen decennia. Een aantal mechanismen beschreven waarmee nucleosomen kan worden gemanipuleerd op een manier die uitvoering van specifieke processen vergemakkelijken - deze mechanismen omvatten posttranslationele modificatie van histon residuen, ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling en ATP-onafhankelijke nucleosoom reorganisatieen montage / demontage 2, 3. De gist Saccharomyces cerevisiae is een bijzonder krachtige modelorganisme voor het begrijpen van histone functie in eukaryoten. Dit is grotendeels te wijten aan de hoge mate van evolutionaire conservering van het histon eiwitten gehele domein Eukarya en de ontvankelijkheid van gist aan een verscheidenheid van genetische en biochemische experimentele benaderingen 4. Omgekeerde genetische technieken in gist zijn op grote schaal gebruikt om de effecten van specifieke histon mutaties op de verschillende aspecten van chromatine biologie bestuderen. Voor deze soorten experimenten is het vaak de voorkeur om cellen waarin het mutant histonen tot expressie gebracht vanaf hun eigen genomische loci, zoals expressie van autonome plasmiden gebruik kan leiden tot abnormale intracellulaire niveaus van histon eiwitten (vanwege variërende aantallen plasmiden in cellen) en gelijktijdige wijziging van chromatine environments, die uiteindelijk de interpretatie van de resultaten kan verwarren. Hier beschrijven we een PCR-gebaseerde techniek die het mogelijk maakt voor gerichte mutagenese van histon genen op hun oorspronkelijke genomische locaties die geen kloneringsstap en resulteert in het genereren van de gewenste mutatie (s) zonder overgebleven exogene DNA-sequenties in het genoom vereist. Deze techniek maakt gebruik van een efficiënte homologe recombinatie systeem in gist en heeft een aantal kenmerken gemeen met andere soortgelijke technieken ontwikkeld door andere groepen - vooral de Delitto Perfetto, plaatsspecifieke genomische (SSG) mutagenese en kloneren vrij-PCR allel vervangingsmethoden 5, 6, 7. De techniek beschrijven we de beeldverhouding dat maakt het bijzonder geschikt voor mutagenese van histon-genen. In haploïde gistcellen, elk van de vier kernhistonen wordt gecodeerd door twee niet-allelic en zeer homologe genen: bijvoorbeeld, histon H3 wordt gecodeerd door de HHT1 en HHT2 genen, en de open leesramen (ORFs) van beide genen dan 90% identiek in sequentie. Deze hoge mate van homologie kunnen experimenten ontworpen om specifiek op een van de twee-histon coderende genen voor mutagenese bemoeilijken. Dat voornoemde werkwijzen vereisen vaak het gebruik van ten minste enkele sequenties binnen het ORF van het doelwitgen homologe recombinatie drijven de techniek hier beschreven maakt gebruik van sequenties die het ORF van het histon-genen (die veel minder sequentiehomologie delen) voor de recombinatie stap, waardoor de kans op succesvolle targeting van mutagenese verhogen tot de gewenste locus. Bovendien kan de homologe gebieden die recombinatie rijden zeer omvangrijk zijn, wat verder bijdraagt ​​aan efficiënte gerichte homologe recombinatie.

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA Ladder (DNA standards)</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5093-100G</td><td></td></tr><tr><td>Boriumzuur</td><td>Sigma</td><td>B0394-500G</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix (10 mM elk)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-oplossing (0,5 M, pH 8,0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-824</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetaat dihydraat</td><td>Sigma</td><td>L6883-250G</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethyleenglycol) (PEG)</td><td>Sigma</td><td>P3640-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase)&nbsp; en 5x buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-443-960</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm DNA-oplossing</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 7-9 (Tris-base, poedervorm)</td><td>Sigma</td><td>T1378-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat trihydraat</td><td>Sigma</td><td>236500-500G</td><td></td></tr><tr><td>Supra Sieve GPG Agarose (low metting temperature agarose)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00985-00100</td><td></td></tr><tr><td>Taq-polymerase en 10x-buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>M0273X</td><td></td></tr><tr><td>Toothpicks</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67859</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8,0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>a-D(+)-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC170080025</td><td>voor gistmedia</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>voor gistmedia</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-07-2</td><td>voor YPD-medium</td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>voor YPD-medium</td></tr><tr><td>4-aminobenzoëzuur</td><td>Sigma</td><td>A9878-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A8626-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>G2879-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Sigma</td><td>A7627-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Arginine monohydrochloride</td><td>Sigma</td><td>A5131-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Asparagine monohydraat</td><td>Sigma</td><td>A8381-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Asparaginezuur natriumzout monohydraat</td><td>Sigma</td><td>A6683-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Cysteïne hydrochloride monohydraat</td><td>Sigma</td><td>C7880-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutaminzuur hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>G2128-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G3126-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Histidine monohydrochloride monohydraat</td><td>Sigma</td><td>H8125-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Sigma</td><td>I2752-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8000-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Lysine monohydrochloride</td><td>Sigma</td><td>L5626-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Sigma</td><td>M9625-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>Sigma</td><td>P2126-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma</td><td>S4500-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Sigma</td><td>T8625-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Sigma</td><td>T0254-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T3754-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma</td><td>V0500-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0919-07-3</td><td>voor compleet minimaal dropout-medium&nbsp;</td></tr><tr><td>5-Fluoroorotinezuur (5-FOA)</td><td>AmericanBio</td><td>AB04067-00005</td><td>voor&nbsp; 5-FOA-medium</td></tr></tbody></table>

gerichte<em&gt; in situ</em&gt; mutagenese van histon genen in gist

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We beschrijven een op PCR en homologe recombinatie gebaseerd systeem voor het genereren van gerichte mutaties in histongenen in knopvormende gistcellen. De resulterende mutante allelen bevinden zich op hun endogene genomische plaatsen en er worden geen exogene DNA-sequenties achtergelaten in het genoom na de procedure. Aangezien in haploïde gistcellen elk van de vier kernhiston-eiwitten wordt gecodeerd door twee niet-allelele genen met sterk homologe open leesframes (ORF's), kan het targeten van mutagenese specifiek naar een van de twee genen die een bepaald histon-eiwit coderen problematisch zijn. De strategie die we hier beschrijven omzeilt dit probleem door gebruik te maken van sequenties buiten, in plaats van binnen, de ORF van de doelgenen voor de homologe recombinatiestap. Een ander kenmerk van dit systeem is dat de DNA-regio's die de homologe recombinatieprocessen aansturen zeer uitgebreid kunnen worden gemaakt, waardoor de kans op succesvolle integratie-gebeurtenissen toeneemt. Deze kenmerken maken deze strategie bijzonder geschikt voor histongenen mutagenese, maar kunnen ook worden aangepast voor mutagenese van andere genen in het gistgenoom.

We beschrijven het genereren van een hht2 allel tot expressie histon H3 mutant eiwit herbergen een substitutie op positie 53 van een arginine naar een glutaminezuur (H3-R53E mutant) als een representatief voorbeeld van de beoogde in situ mutagenese strategie. We genereerden een stam waarin het gehele ORF van HHT2 wordt vervangen door de URA3-gen (zie stap 1 van het protocol). Deze stam, yAAD...

Een strategie voor het genereren van mutaties in histongenen op hun endogene locatie in Saccharomyces cerevisiae wordt gepresenteerd.

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van specifieke mutaties in histongenen op hun endogene chromosomale locaties in budding yeast-cellen. Deze methode kan worden gebruikt om de bijdrage van specifieke histoneresiduen te bepalen in diverse processen die chromatine als substraat gebruiken, zoals DNA-transcriptie en elke combinatie daarvan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat specifieke histongenen gericht kunnen worden gemuteerd, ondanks het feit dat elk histonproteïne in gist wordt gecodeerd door twee sterk homologe, niet-allelische genen.Nadat een giststam is gegenereerd waarbij het doelhस्टोनgen is uitgeschakeld en vervangen door URA3, worden PCR-producten gegenereerd voor twee gedeeltelijk overlappende fragmenten van het doelhस्टोनgen door de volgende reactie op te zetten voor de eerste helft van het gen. Voor de tweede helft van het gen wordt een soortgelijke PCR-reactie opgezet met behulp van andere primers. Plaats de reacties in een thermocycler en stel het volgende programma in.Voer 20 tot 50 µL van de PCR-reacties uit op een 0,9% agarosegel met een laag smeltpunt in TBE-buffer. Gebruik vervolgens een schoon scheermesje om de PCR-producten ui

targeted-in-situ-mutagenesis-of-histone-genes-in-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Genetische studies in gist kan worden gebruikt om de moleculaire en cellulaire functies van de menselijke genen te onderzoeken in de cellulaire DNA metabolisme. Methoden beschreven voor de genetische karakterisering van het...

Genetische studies van het menselijk DNA Repair eiwitten met behulp van gist als een model-systeem

De HO-gestimuleerde translocatie assay monitoren enkelstrengs gloeien na de oprichting van DNA dubbelstrengs breuken op meerdere loci in...

Kwantificering en analyse van de vorming van HO-endonuclease chromosomale translocaties Gestimuleerd door Single-Strand Gloeien in Saccharomyces cerevisiae</em

Source: Bennett, S. A., et al., Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the procedure of assessing histone modifications in yeast cells overexpressing neurodegenerative proteins. The steps include cell lysis, centrifugation, electrophoresis, membrane transfer, and antibody-based detection of modified histones.

Detecting Histone Modifications in Yeast Cells with Neurodegenerative Protein Overexpression

Genetisch gecodeerde histon-miniSOG induceert genoom-brede erfelijke mutaties in een blauw licht-afhankelijke manier. Dit mutagenese methode is eenvoudig, snel, vrij van giftige chemicaliën, en zeer geschikt voor forward genetische screening en transgene integratie.

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Hier beschrijven we een protocol voor het chromatine immunoprecipitation van gemodificeerde histonen uit de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wordt vervolgens gebruikt voor kwantitatieve PCR te ondervragen de overvloed en lokalisatie van Histon posttranslationele modificaties in het genoom.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) van Histone modificaties van Saccharomyces cerevisiae

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor willekeurige mutagenese van een target-gen in kernsplijting gist. Als voorbeeld, wij de doelstelling van rpt4 +, die codeert een subeenheid van de 19S proteasoom, en het scherm voor mutaties die heterochromatin te destabiliseren.

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Ribonucleotides behoren tot de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom opgenomen tijdens de eukaryote nucleair DNA-replicatie. Als het niet correct is verwijderd, kan ribonucleotides DNA-beschadiging en mutagenese veroorzaken. Hier presenteren we twee experimentele benaderingen die worden gebruikt voor het beoordelen van de overvloed van ribonucleotide opneming in DNA en zijn mutagene effecten.

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

Hier zijn vier protocollen voor het construeren en exploiteren van gist Saccharomyces cerevisiae reporter stammen te bestuderen van menselijke P53 trans activatie potentieel, effecten van de verschillende kanker-geassocieerde mutaties, co-uitgedrukt interactie eiwitten, en de effecten van specifieke kleine moleculen.

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

Time-lapse microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van meiose in ontluikende gist. Dit protocol beschrijft een methode die celcyclussynchronisatie, time-lapse-microscopie en voorwaardelijke uitputting van een doeleiwit combineert om aan te tonen hoe de functie van een specifiek eiwit tijdens meiotische chromosoomsegregatie kan worden bestudeerd.

Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen

Verrijking en sequentiebepaling van proteïne-geassocieerd nieuwvormings-DNA (eSPAN) is ontwikkeld om de relatieve abundantie van een chromatine-geassocieerd eiwit op twee replicerende DNA-strengen te detecteren, waardoor moleculaire inzichten in chromatine-replicatie en de gekoppelde processen worden onthuld. Dit protocol beschrijft eSPAN-procedures in gist- en muis embryonale stamcellen (ES).

Strandspecifieke analyse van eiwitten bij replicatie van DNA-strengen door verrijking en sequentiebepaling van eiwit-geassocieerd naissant DNA-methode

Leer gerichte in situ mutagenese van histon genen in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode maakt precieze mutaties op endogene chromosomale locaties mogelijk om de rol van specifieke histon residuen in chromatine processen te onderzoeken.

gerichte

Meer video's verkennen