Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige manier te bieden om de effecten van chemotactische en chemorepulsieve agentia op celmigratie te bestuderen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de vakgebieden van celinteractie te beantwoorden, zoals de effecten van verschillende groeifactoren op wondgenezing. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze gemakkelijk aanpasbaar is voor verschillende toepassingen en eenvoudig te gebruiken is voor onderzoekers van alle vaardigheidsniveaus.

De procedure wordt gedemonstreerd door Aniqa Chowdhury, een studente in de bachelorfase, en Tyler Harvey, een student in de masterfase uit mijn laboratorium. Om te beginnen, maak een CAD-bestand met de gewenste vorm van de microkanaal. Pas de breedte en lengte van het kanaal aan om de vereiste gradiënt te bereiken.

Hier zijn vierkanten van 2,254 centimeter verbonden door een kanaal van 0,127 centimeter breed. Vervolgens verkrijgt u een stuk acryl van de gewenste dikte om de juiste diepte van het microkanaal te creëren. Een acrylplaat van ongeveer een zestiende van een inch breed is ideaal, omdat dikkere platen moeilijk te snijden zijn en zeer dunne platen kunnen breken of kromtrekken tijdens het proces.

Importeer het CAD-bestand in een laser snijapparaat en plaats het acrylstuk op het snijoppervlak. Snijd vervolgens de kamer uit volgens het protocol van de fabrikant. Plaats de vers gesneden spiervormige acryluitsnijding in een kleine petrischaal en dek deze af totdat deze nodig is.

Voeg in een weegboot tien delen van een elastomere basis toe, met één deel van het uithardingsmiddel en roer gedurende vijf minuten met een micropipet. Breng het mengsel over in een vacuümkamer en trek 30 minuten lang een vacuüm om eventuele luchtbellen uit het PDMS te verwijderen. Wanneer u klaar bent, zet de vacuüm uit en verwijder de weegboot.

Plaats het ontgaste PDMS op een spiervormige acryluitsnijding in een kleine petrischaal. Zorg ervoor dat het PDMS de invoegsel volledig bedekt. Laat het PDMS minimaal 18 uur bij kamertemperatuur uitharden en snijd vervolgens het PDMS rond het acrylstuk met een scalpel en verwijder het invoegsel.

Plaats de microkanaalkamer in een petrischaal in een standaard celcultuurkast, met de functiezijde naar boven en bedek deze volledig met 70% ethanol. Sluit vervolgens de kap en zet het UV-licht aan. Stel de kamer gedurende één tot twee uur bloot aan UV-licht.

Na de blootstelling opent u de laminaire flowkap en wacht u 15 minuten tot de flowkap de stroom opnieuw tot stand heeft gebracht. Vervolgens verwijdert u de 70% ethanol en spoelt u de kamers twee keer met steriel PBS. Gebruik voor elke wasbeurt een milliliter PBS.

Na de laatste wasbeurt verwijdert u het PBS en laat u de kamers met de deksels open 's nachts drogen. Verzamel het celtype dat moet worden getest en voeg 100 microliter van de celsuspensie toe aan 400 microliter van de 0,4% trypanblauw en meng voorzichtig. Breng 100 microliter van deze oplossing aan op de hemocytometer door voorzichtig beide kamers onder de glazen deksel te vullen.

Gebruik een microscoop met een 10x objectief om te focussen op het raster op de hemocytometer. Gebruik vervolgens een handtellingteller om het aantal levende, ononderbroken cellen te tellen in alle vier sets van 16 vierkantjes op de hemocytometer. Verdeel het totaal aantal cellen door vier en vermenigvuldig dit getal met 50.000 om het aantal cellen per milliliter celsuspensie te krijgen.

Op basis van deze berekening, voegt u 2500 cellen en 100 microliter media toe aan één putje in elke kamer. Laat de cellen 60 minuten in de kamer zitten en voeg vervolgens aanvullend media toe. Om te beginnen, voegt u agarose toe aan water en verwarmt u de oplossing in een magnetron gedurende één minuut, of totdat de agarose volledig is opgelost en de oplossing helder is.

Laat de oplossing 15 tot 30 seconden afkoelen voordat u deze in een petrischaal giet. Om eventuele luchtbellen te verwijderen, plaatst u de petrischaal in een vacuümkamer en laat u de agarose gedurende 30 minuten onder vacuüm stollen. Eenmaal gestold, snijdt u een kubus van twee millimeter bij twee millimeter bij twee millimeter agarose met een scalpel uit de petrischaal.

Dompel de kubus volledig onder in een oplossing met de gewenste concentratie van de chemotactische factor en laat de agaroseblok met de chemotactische factor 's nachts bij kamertemperatuur weken. Plaats vervolgens de agaroseblok met de chemotactische factor aan het verre uiteinde van de microkanaalkamer. Gebruik een marker, zoals polystyreen microbeads of een microscopisch defect in de kamer.

Om de relatieve startlocatie van de cellen te identificeren. Gebruik de beeldvormingssoftware om tijdsverloopbeelden van de bewegende celfront elke uur gedurende 12 uur te maken. De reeks afbeeldingen die hier wordt getoond, documenteert de beweging van een celfront door het kanaal in reactie op een gradiënt van foetaal bovien serum geplaatst aan de andere kant van het kanaal.

De migratieafstand werd gemeten op basis van de afstand van het groeifront van een microscopisch defect in het apparaat. Uit deze metingen bleek de gemiddelde celfrontsnelheid 13,4 micrometer per uur te zijn. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vier uur worden voltooid, met een extra 18 uur wachttijd voor het uitharden van PDMS en een extra 12 uur voor de tijdsverloopbeeldvorming.

Na de ontwikkeling van deze techniek, heeft deze de weg geëffend voor onderzoekers van verschillende vaardigheidsniveaus, inclusief bachelorstudenten met weinig laboratoriumervaring om wondgenezing en celmigratie in vitro gemakkelijk te verkennen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de acrylinvoegsel voorzichtig uit de PDMS-mal te verwijderen om een ​​succesvolle productie van een microkanaalkamer te garanderen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een eenvoudige microkanaalkamer kunt