Name: Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer een aanpasbare methode om celmigratie te meten in reactie op chemotactische agentia met deze microkanaaltechniek. Deze eenvoudige aanpak helpt onderzoekers bij het bestuderen van wondgenezing en groeifactoreffecten in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen Clemson University&#39;s Creative Inquiry programma en NSF CBET1254609 voor het verstrekken van financiering voor dit project.

1. Het produceren van een Microchannel Kamer tot een concentratie Gradient Maak <ol><li> Cutting een acryl mal stuk <ol><li> Zorg voor een stukje van acryl van de gewenste breedte. Typisch gebruiken 16/01-inch dikke acrylplaten. Dikkere platen zijn moeilijk goed en zeer dunne platen gesneden niet de vereiste mechanische sterkte, waardoor ze kunnen barsten of kromtrekken tijdens het proces. </li><li> Maak een CAD-bestand met de gewenste vorm van de acrylstuk om een ​​holte in het polydimethylsiloxaan (PDMS) te produceren. Pas de breedte en lengte kanaal naar de gewenste gradiënt afzonderlijke experimentele protocollen relevant bereiken. <ol><li> Hier, gebruik een acrylstuk van de volgende afmetingen: twee velden (0,254 cm x 0,254 cm) die door een 0,127 cm breed kanaal (0,254 cm) (figuur 1). </li></ol></li><li> Importeer het CAD-bestand in het lasersnijden apparatuur en plaats de acryl stuk in een laser cutter volgens de manubrikant&#39;s protocol. OPMERKING: U 3D-print het stuk uit de CAD-ontwerp. Het voordeel van deze methode is dat alternatieve materialen kunnen worden gebruikt voor de matrijs; echter, kan de resolutie en reproduceerbaarheid worden verminderd met 3D-printen in vergelijking met lasersnijden. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" /> Figuur 1: Computer-Aided Design (CAD) Vertegenwoordiging van Microchannel Kamer. Dit beeld schildert de CAD-tekening van de acryl liner nodig is om de microkanaal kamer te creëren. 1 A) Bovenaanzicht van CAD-tekening, 1B) Zijaanzicht van de CAD-tekening met afmetingen in inches, 1C) Bovenaanzicht van CAD-tekening met afmetingen in inches <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="2"><li&gt; Het gieten van de polydimethylsiloxaan (PDMS) <ol><li> In een gewichtboot, meng 10 gewichtsdelen commercieel Elastomer Base (bv Sylgard 184) met 1 gewichtsdeel commercieel elastomeer verharder (bijvoorbeeld Sylgard 194). Kenmerkend Meng 10 g elastomeer Base 1 g elastomeer verharder. </li><li> Roer de basis en verharder combineren met een micropipet voor 5 min. </li><li> Het opzetten van een vacuüm bel en leg de wegen boot met PDMS in het vacuüm gedurende 30 minuten om ingesloten luchtbellen te verwijderen. </li><li> Schakel het vacuüm en verwijder de wegen boot. Giet de PDMS op de top van de acryl cut-out in een kleine petrischaal. Zorg ervoor dat het PDMS volledig bedekt de insert. </li><li> Laat de PDMS een nacht uitharden (minimaal 18 uur) bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Het verwijderen van het inzetstuk van PDMS <ol><li> Na het uitharden van de PDMS, verwijder het inzetstuk door het zorgvuldig snijden van de PDMS rond de acrylstuk met een scalpel. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Plating de cellen in een Microchannel Kamer <ol><li> Steriliseren van de kamer voor plating cellen. OPMERKING: Terwijl PDMS kunnen worden gesteriliseerd met ethyleenoxide of andere technieken, een snelle UV-behandeling is snel, goedkoop en voldoende celcultuuronderzoeken. De duur korte UV-behandeling geen afbreuk doen aan de structuur of de mechanische integriteit van het PDMS stuk. <ol><li> In een standaard celkweek kast, volledig bedekken de kamer met 70% ethanol. </li><li> Zet de petrischaal in laminaire stroming kap met de deksels af. </li><li> Sluit de kap en zet de UV-licht. Blootstellen aan UV-licht voor 1-2 uur. </li><li> Open de laminaire stroming kap en wacht 15 minuten om de stroom te herstellen. </li><li> Verwijder de 70% ethanol. </li><li> Was de kamers tweemaal met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Gebruik 1 ml PBS voor elke wasbeurt. Verwijder PBS en laat de kamers een nacht drogen met de deksels af. NB: In plaatsvan het gebruik van een laminaire stroming kap, gebruik maken van een UV-kamer box voor sterilisatie als die beschikbaar is. Wordt UV box door een UV-lichtbron in de rug van een kartonnen doos bekleed met aluminiumfolie. De aluminiumfolie reflecteert het licht zodat zelfs verlichting van het monster. </li></ol></li><li> Plating Cellen in Kamer <ol><li> Tellen cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer. <ol><li> Voeg 100 ul van de celsuspensie 400 pi van 0,4% trypan blauw en meng voorzichtig. Breng 100 pi van deze oplossing aan de hemocytometer door beide kamers voorzichtig vullen onder het dekglaasje. </li><li> Gebruik een microscoop met een 10X objectief te richten op het raster op de hemocytometer. Gebruik een hand telapparaat om de live ongekleurde cellen te tellen binnen een set van 16 vierkantjes op de hemocytometer. </li><li> Aantal cellen in alle 4 sets van 16 vakjes. Neem het gemiddelde celgetal van de 4 sets van 16 pleinen en vermenigvuldig dat met 5x10 4. Dit laatste nummer is de numbeR cellen / ml in de celsuspensie. </li></ol></li><li> Voeg 2500 cellen aan één putje in elke kamer. Dit vertaalt zich naar een bijna-confluente celdichtheid van ~ 30.000 / cm2. </li><li> Een cel in staat om in de kamer zitten 60 minuten voor het toevoegen van medium (Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium, 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine). </li></ol></li></ol> 3. Dextran Soaked Agarose Blocks <ol><li> Het creëren van een agarose blok <ol><li> Pour 3% agarose bij 3D geprint matrijs (2 mm x 2 mm x 2 mm). </li><li> Laat de agarose te stollen in een vacuümkamer gedurende 30 minuten om eventuele luchtbellen te verwijderen. </li><li> Verwijder de agarose blok van de mal. OPMERKING: U pour 3% agarose in kleine petrischaal bij een dikte van 2 mm. Snijd een 2 mm x 2 mm x 2 mm blok met behulp van een scalpel of een ander snijgereedschap. Dit is niet zo nauwkeurig als de mal systeem, maar het kan een beetje makkelijker om te doen. </li></ol></li><li> volledig submerge de agarose blok in een oplossing van de gewenste concentratie van de chemotactische factor. Om het verloop formatie concentratie te beoordelen, spoel de kamer eerst met fluorescerende dextran. De concentratie en het molecuulgewicht dextran moet overeenkomen met die van een oplosbare factor of geneesmiddel plaats. </li><li> Week de agarose blok &#39;s nachts. </li></ol> 4. Time-lapse van de dextran Diffusion de Oplosbare Factor concentratiegradiënt Assess <ol><li> Plaats de dextran gedrenkt agarose blok in een klein plein putje van de microkanaal kamer. </li><li> Plaats de microkanaal kamer in een cell imaging-systeem of gebruik een andere fluorescentiemicroscoop met een time-lapse vermogen. Begin de time-lapse volgens de instructies van de fabrikant. LET OP: De getoonde resultaten zijn genomen met GFP filter, 50% licht, 4/10 pH en 4X vergroting. </li></ol> 5. Time-lapse van de celgroei <ol><li> Plaat cellen in het microkanaal kamer aan één uiteinde van dekamer. Hier, gebruik 3T3 fibroblasten. Voeg 2500 cellen om een ​​goed in de microkanaal kamer. Aantal cellen zoals beschreven in 2.2.1. <ol><li> Een cel in staat om in de kamer zitten 60 minuten voor het toevoegen van medium (Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium, 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine). Houd de microkanaal kamer met geplateerde cellen bij 37 ° C in 5% CO2. Celmigratie door het kanaal kunnen worden bekeken met een microscoop. </li><li> Voeg een merker of een microscopische defect in de kamer als een marker om te dienen als een startpunt om de afstand kwantificeren cel voorzijde beweegt. </li></ol></li><li> Instelling van een gradiënt door het plaatsen van een agarosegel (8 mm 3 blokken) met de geconcentreerde groeifactor, chemo-attractant, drug of andere factor getest (hier, 40% FBS wordt als voorbeeld) aan één uiteinde van het microkanaal kamer. </li><li> Neem de time-lapse beelden van de bewegende cel front. Hier, de resultaten tonen beelden van de cel weernt die werden elke 12 h en een beeldvormingssysteem genomen. </li><li> Gebruik foto&#39;s van de cel voor naar cel groei te kwantificeren. Bereken de groei door eerst met behulp van de MATLAB polyfit functie (roipoly) om een ​​veelhoekige masker gedefinieerd door de cel front, het kanaal muren, en de referentie-marker te creëren. De afmetingen van dit masker op de migratie afstand van de voorste waaruit gemiddelde celgrootte voor snelheid wordt berekend. Andere studies hebben een soortgelijke methode 8 toegepast. Opmerking: Vergelijk de rand van de celgroei front op elk frame om de concentratie van de oplosbare factor op dezelfde afstand. De oplosbare factor concentratiegradiënt wordt berekend aan de hand van een 1D diffusie model benadering. </li><li> Neem fluorescerende beelden van de cellen met behulp Phalloidin en DAPI kleuring. <ol><li> Fix cellen vóór kleuring met Phalloidin. <ol><li> Warm 4% paraformaldehyde bij 37 ° C. </li><li> Voeg genoeg 4% paraformaldehyde aan cellen dekken. Houd cellen in deparaformaldehyde gedurende 10 min. </li><li> Spoel tweemaal met PBS gedurende 15 minuten elke keer. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten. </li></ol></li><li> PBS verwijderen van cellen en voeg genoeg permeabilisatie-oplossing (0,1% Triton X-100 in PBS) aan cellen dekken. Laat gedurende 10 min. </li><li> Was tweemaal met PBS gedurende 5 min per keer. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten. </li><li> PBS verwijderen van cellen en voeg blokkeeroplossing (1% runderserumalbumine in PBS) gedurende 20 min. </li><li> Verwijderen blokkerende oplossing en was 2x met PBS gedurende 5 min per keer. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten. </li><li> Vanaf dit punt, cellen beschermen tegen licht met aluminiumfolie wanneer niet in gebruik. PBS verwijderen van cellen en voeg Phalloidin 488 verdund 1:50 in PBS gedurende 1 uur. </li><li> Was 2 keer in PBS gedurende 5 min per wasbeurt. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten. Verwijder vervolgens PBS uit cellen. </li><li> Voeg DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool) verdund 1: 1000 in PBS cellen gedurende 15 min. </li><li> Verwijder DAPI enWas de cellen tweemaal met PBS gedurende 5 min per wasbeurt. </li><li> Verwijder laatste wasbeurt en voeg genoeg PBS aan cellen te dekken. Cellen kunnen nu worden afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+in+poly+%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).</li>
<li>Darby, I., Hewitson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Differentiation+in+Wound+Healing+and+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis.</a> Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).</li>
<li>Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+study+fibroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskel%22%5BJournal%5D)">A new approach to study fibroblast migration.</a> Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).</li>
<li>Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324, 1673-1677 (2009).</li>
<li>Zengel, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21592329">µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies.</a> BMC Cell Biol. , (2011).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576901">Boyden Chamber Assay.</a> Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).</li>
<li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+revised%3A+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models%5BTitle%5D)+AND+%22JCB%22%5BJournal%5D)">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models.</a> JCB. 203 (4), 691-709 (2013).</li>
<li>Saadi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+concentration+gradients+in+2D+and+3D+environments+using+a+microfluidic+ladder+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber.</a> Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).</li>
<li>Cammer, M., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+Responses+by+Macrophages+to+a+Directional+Source+of+a+Cytokine+Delivered+by+a+Micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette.</a> Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).</li>
<li>Wells, C. M., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration+using+the+Dunn+chemotaxis+chamber+and+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wright, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+open+microfluidic+devices+for+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies.</a> Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).</li>
<li>Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+with+arbitrary+shapes+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+devices%3A+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 013412(2011).</li>
<li>Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chambers+for+cell+migration+and+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Tech%3A+Rev+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research.</a> Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).</li>
<li>Tang, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTang%2C+SK+%22Basic+microfluidic+and+soft+lithographic+techniques.+Optofluidics%3A+Fundamentals%2C+Devices+and+Applications%22">Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications</a>. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research%29%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research).</a> Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).</li>
<li>Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Device+for+Studying+Multiple+Distinct+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains.</a> JoVE. (69), (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Onze microkanaal kamer kan worden gebruikt voor een veelheid aan toepassingen, inclusief het bepalen van de celmigratie als reactie op groeifactoren en chemoattractanten en het meten van de diffusiesnelheid van een geneesmiddel vanuit een polymere matrix. Het is mogelijk om onze microkanaal kamer gebruiken om cellen groeien en plaats een chemoattractant aan een einde van de kamer. De cellen groeien in respons op de chemoattractant en de celmigratie kan worden gekwantificeerd door middel van time-lapse beelden dat om de ...

Om essentiële processen zoals wondgenezing, immuunreacties en embryonale ontwikkeling te laten plaatsvinden, moet celmigratie plaatsvinden. Celmigratie omvat de interactie tussen cellen en aangrenzende cellen, de extracellulaire matrix en oplosbare chemische signalen (aantrekkingskracht of afstoting). Als voorbeeld spelen fibroblasten bij het genezingsproces van wonden een integrale rol in fibrogenese en wondcontractie, waarbij de cellen worden aangetrokken naar de plaats van verwonding om collageen te synthetiseren om de extracellulaire matrix te vormen3. Er zijn talrijke mechanismen bestudeerd die ten grondslag liggen aan de migratie van fibroblasten naar een wondplaats, en ze omvatten verschillende mechanische, fysische, elektrische en chemotactische factoren4. Fibroblasten reageren vooral goed op verschillende concentratiegradiënten van groeifactoren. Deze verschillende groeifactoren werken samen om weefselregeneratie te optimaliseren5. Door de chemotactische reactie van fibroblasten op groeifactorconcentraties te observeren, kan men het patroon van directionele migratie van fibroblasten bestuderen en hoe ze zich oriënteren rond fysieke obstakels om hun bestemming te bereiken. Daarom waren de doelen van dit onderzoek om eerst een systeem te ontwikkelen waarin fibroblastengroei onder leiding van fysieke barrières kon worden bijgehouden en ten tweede om de groei van fibroblasten te modelleren terwijl ze door het systeem navigeren.
Momenteel is de Boyden-kamermethode het meest gebruikte systeem om de migratie van cellen te meten6. De Boyden-kamer bestaat uit een meervoudige plaat met twee kamers waarbij elke put medium met of zonder chemo-attractanten kan bevatten7. Een filtermembraan biedt een poreuze interface tussen de twee kamers in elke put; dit creëert een barrière zodat cellen niet kunnen passeren, tenzij het door actieve migratie is. Typisch wordt voor de Boyden-kamer een chemo-attractant toegevoegd aan de onderste kamer, en het systeem wordt toegestaan om in evenwicht te komen om een gradiënt tussen de bovenste en onderste putten te vormen4. Een probleem met de Boyden-kamermethode is dat steile gradiënten langs een enkele as loodrecht op het oppervlak van het membraan worden gevormd. Dit zorgt ervoor dat het verschil in chemo-attractantconcentratie tussen de bovenste en onderste putten lager is dan oorspronkelijk werd verwacht. Vanwege deze beperking maakt de Boyden-kamermethode het moeilijk om specifieke celreacties te correleren met specifieke gradiëntkenmerken, zoals de helling en het concentratieverschil. Zonder deze metingen is het moeilijk om multi-gradiënt signaalintegratie te bestuderen.
Om enkele van de beperkingen van de traditionele Boyden-kamermethode aan te pakken, zijn microfluïdische methoden ontwikkeld om aanpasbare concentratiegradiënten te vormen1. Standaardmethoden voor het creëren van microfluïdische systemen vereisen schone ruimtes voor lithographische technieken. Deze technieken kunnen moeilijk te leren zijn, vooral in een standaard klasomgeving. Daarom hebben we een kamersysteem ontworpen voor het meten van celmigratie dat kan worden gemaakt zonder gebruik te maken van een schone ruimte. Met ons systeem kunnen de putten van de assay worden aangepast aan een gewenste grootte, en een lineair concentratiegradiënt van aangepaste helling kan worden geproduceerd. Dit maakt nauwkeurige meting van chemotaxis mogelijk van willekeurige beweging. Het ontwerp is een goedkoop en eenvoudig te gebruiken systeem om celgroei te modelleren als reactie op verschillende chemische stimuli.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>poly(dimethylsiloxane) 2-delig pakket inclusief siliconen elastomeer basis en siliconen elastomeer hardingsmiddel</td></tr><tr><td>Acrylic Sheets</td><td>US Plastic</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Petri Dishes&nbsp;</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate&ndash;dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20s-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Type I, Low EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Cel media componenten</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Fisher Scientific</td><td>16000036</td><td>Cel media componenten</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td>Cel media componenten</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AME3300</td><td>Instrument gebruikt voor het maken van time-lapse beelden</td></tr><tr><td>Versa Laser</td><td>Universal Laser Systems, Inc.&nbsp;</td><td>Modelnummer VLS2.30</td><td>Lasersnijder gebruikt voor het snijden van plastic</td></tr></tbody></table>

een aanpasbare kamer voor het meten van de cel migratie

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cel migratie is een essentieel onderdeel van het immuunsysteem, groei en wondgenezing. Celmigratie is een complex proces dat interacties tussen cellen, de extracellulaire matrix en oplosbare en niet oplosbare chemische factoren (bv chemoattractanten) omvat. Standaardwerkwijzen voor het meten van de migratie van cellen, zoals de Boyden kamer assay, werken door het tellen van cellen aan weerszijden van een scheidingswand. Deze technieken zijn gemakkelijk te gebruiken; echter, bieden ze weinig geometrische aanpassing voor verschillende toepassingen. Daarentegen kan microfluïdische inrichtingen worden gebruikt om celmigratie met aanpasbare concentratiegradiënten van oplosbare factoren 1, 2 nemen. Echter, methoden voor het maken van microfluidics gebaseerde testen moeilijk om te leren. We beschrijven hier een eenvoudige methode om celkweek kamers om celmigratie te meten in respons op chemische concentratiegradiënten. Onze cel migratie kamermethode kunnen verschillende lineaire concentratiegradiënt te creëren om celmigratie te bestuderen voor verschillende toepassingen. Deze methode is relatief eenvoudig te gebruiken en wordt typisch uitgevoerd door studenten. Het microkanaal kamer werd gecreëerd door het plaatsen van een acryl inzetstuk in de vorm van de uiteindelijke microkanaal kamer tot in een petrischaal. Hierna werd poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) bovenop het inzetstuk gegoten. De PDMS werd uitharden en vervolgens werd het inzetstuk verwijderd. Dit liet de creatie van putjes in elke gewenste vorm of grootte. De cellen kunnen vervolgens worden toegevoegd aan de microkanaal kamer en oplosbare middelen kan op een van de putjes toegevoegd door weken een agarose blok in de gewenste stof. De agarose blok wordt toegevoegd aan één van de putjes, en time-lapse beelden kunnen houden met het microkanaal kamer om celmigratie te kwantificeren. Variaties van deze methode kan worden gemaakt voor een bepaalde toepassing, waardoor deze methode higHLY aanpasbaar.

Figuur 2 toont de beweging van de voorste cel over het kanaal in reactie op een gradiënt van foetaal runderserum geplaatst aan het andere uiteinde van het kanaal waar de cellen worden uitgeplaat. De cel voorzijde is getoond bij 48 uur (Figuur 2A), 72 h (figuur 2B), 96 h (figuur 2C) en 120 uur (Figuur 2D) na plating. De beweging van de cel voorzijde werd gevolgd met deze time-lapse beelden, en de migratie...

Dit protocol Gegevens een aanpasbare werkwijze celmigratie als reactie op chemoattractanten die ook kunnen worden gebruikt om de diffusiesnelheid van een geneesmiddel te bepalen uit een polymeermatrix meten.

Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige manier te bieden om de effecten van chemotactische en chemorepulsieve agentia op celmigratie te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de velden van celinteractie, zoals de effecten van verschillende groeifactoren op wondgenezing. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig aanpasbaar is voor verschillende toepassingen en gemakkelijk te gebruiken is voor onderzoekers van alle ervaringsniveaus.De procedure zal worden gedemonstreerd door Aniqa Chowdhury, een bachelorstudent, en Tyler Harvey, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin met het maken van een CAD-bestand met de gewenste vorm van het microkanaal. Pas de breedte en lengte van het kanaal aan om de vereiste gradiënt te bereiken.Hier zijn vierkanten van 2,254 centimeter met elkaar verbonden via een kanaal van 0,127 centimeter breed. Neem vervolgens een stuk acrylaat met de gewenste dikte om de juiste diepte van het microkanaal te creëren. Een acrylaatplaat met een breedte van ongeveer een zestiende inch is ideaal, aangezien dikkere platen moeilijk te snijden zijn en zeer dunne platen tijdens het proces kunnen breken of kromtrekken.Importeer het CAD-bestand in een lasersnijapparaat en plaats het acrylaatstuk op het snijvlak. Snijd vervolgens de kamer uit, volgens het protocol van de fabrikant. Plaats de vers uitgesneden haltervormige acrylaatuitsparing in een kleine Petrischaal en dek deze af totdat deze nodig is.Voeg in een weegbakje tien delen van een elastomeerbasis toe aan één deel van het uithardingsmiddel en roer dit vijf minuten lang met een micropipet. Breng het mengsel over naar een vacuümkamer en trek gedurende 30 minuten vacuüm om eventuele ingesloten luchtbellen uit de PDMS te verwijderen. Schakel na afloop het vacuüm uit en verwijder het weegbakje.Giet het ontluchte PDMS bovenop een haltervormige acryluitsparing in een kleine Petrischaal. Zorg ervoor dat het PDMS de inzet volledig bedekt. Laat het PDMS minstens 18 uur uitharden bij kamertemperatuur, snijd vervolgens voorzichtig met een scalpel het PDMS rondom het acrylaatstuk en verwijder de inzet.Plaats de microkanaalkamer in een Petrischaal in een standaard celkweekkast, met de functionele zijde naar boven, en bedek deze volledig met 70% ethanol. Sluit vervolgens de kast en schakel het UV-licht in. Stel de kamer één tot twee uur lang bloot aan het UV-licht.Open na de blootstelling de laminaire flowkast en wacht 15 minuten tot de luchtstroom in de kast is hersteld. Verwijder vervolgens de 70% ethanol en was de kamers twee keer met steriele PBS. Gebruik één milliliter PBS voor elke wasbeurt.Verwijder na de laatste wasbeurt de PBS en laat de kamers gedurende de nacht drogen met de deksels eraf. Oogst het te testen celtype en voeg 100 µL van de celsuspensie toe aan 400 µL van de 0,4% trypaanblauw en meng dit voorzichtig. Breng 100 µL van deze oplossing aan op de hemocytometer door beide kamers onder het glazen dekglas voorzichtig te vullen.Gebruik een microscoop met een 10x objectief om scherp te stellen op het raster van de hemocytometer. Gebruik vervolgens een handmatige teller om de levende, niet-geklonterde cellen in alle vier de sets van 16 vakjes op de hemocytometer te tellen. Deel het totale aantal cellen door vier en vermenigvuldig dit getal met 50.000 om het aantal cellen per milliliter van de celsuspensie te bepalen.Voeg op basis van deze berekening 2500 cellen en 100 µL medium toe aan één putje in elke kamer. Laat de cellen 60 minuten in de kamer rusten en voeg vervolgens extra medium toe. Begin met het toevoegen van agarose aan water en verhit de oplossing een minuut in een magnetron, of totdat de agarose volledig is opgelost en de oplossing helder is.Laat de oplossing 15 tot 30 seconden afkoelen voordat deze in een Petri-schaal wordt gegoten. Om eventuele bellen te verwijderen, plaatst u de Petri-schaal in een vacuümkamer en laat u de agarose 30 minuten onder vacuüm stollen. Snijd, zodra de agarose gestold is, met een scalpel een kubus agarose van 2 mm bij 2 mm bij 2 mm uit de Petri-schaal.Dompel de kubus volledig onder in een oplossing met de gewenste concentratie van de chemotactische factor en laat het agaroseblok een nacht weken bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens het agaroseblok met de chemotactische factor aan het uiteinde van de microkanaalkamer. Gebruik een markering, zoals polystyreen microbeads of een microscopisch defect in de kamer.Om de relatieve startpositie van de cellen te bepalen. Gebruik de imaging-software om gedurende 12 uur elk uur time-lapsebeelden te maken van het bewegende cellfront. De hier getoonde reeks beelden documenteert de verplaatsing van een cellfront door het kanaal als reactie op een gradiënt van foetaal kalfsserum dat aan het tegenovergestelde uiteinde van het kanaal is geplaatst.De migratieafstand werd gemeten op basis van de afstand van het groeifront tot een microscopisch defect in het apparaat. Uit deze metingen bleek dat de gemiddelde snelheid van het cellenfront 13,4 micrometers per uur was. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vier uur worden voltooid, met een extra wachttijd van 18 uur voor de uitharding van PDMS en een extra 12 uur voor de time-lapse imaging.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers van verschillende ervaringsniveaus, waaronder bachelorstudenten met weinig laboratoriumervaring, om eenvoudig wondgenezing en celmigratie in vitro te bestuderen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de acrylinsert voorzichtig uit de PDMS-mal te verwijderen om een succesvolle productie van een microkanaalkamer te garanderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een eenvoudige microkanaalkamer produceert voor het bestuderen van celmigratie in reactie op verschillende chemische signalen.Na deze procedure kunnen andere signalen worden bestudeerd, zoals meerdere oplosbare chemische gradiënten, substraten, vloeistofschuifspanning en elektrische velden, om het effect hiervan op celmigratie te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met lasersnijders uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het volgen van een juiste training en het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, altijd moeten worden getroffen bij het uitvoeren van deze procedure.

a-customizable-chamber-for-measuring-cell-migration

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een compartimentering microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van kanker stamcellen migratie wordt beschreven. Deze roman platform creëert een levensvatbare cellulaire micro-omgeving en maakt microscopische visualisatie van levende cellen voortbewegen. Zeer beweeglijke kankercellen worden geïsoleerd om moleculaire mechanismen van agressieve infiltratie, wat kan leiden tot een meer doeltreffende toekomstige therapieën te bestuderen.

Evaluatie van kankerstamcel Migratie Met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten en live cell imaging

De phagokinetic motiliteit spoor assay is een methode om de beweging van cellen te beoordelen. Met name de test meet chemokinesis (random celmotiliteit) in de tijd op een kwantitatieve wijze. De assay maakt gebruik van het vermogen van cellen om een ​​meetbare spoor van de beweging van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes maken.

Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay

Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Een kwantitatief spontane migratie van cellen te bestuderen in een eendimensionale beperkte micro beschreven. Deze methode maakt gebruik van microfabricated kanalen en kan worden gebruikt om de migratie van grote aantallen cellen te bestuderen onder verschillende omstandigheden in enkele experimenten.

Studie van cel-migratie in Microfabricated Kanalen

Onderzoek naar vroege migratie van endotheelcellen (EEC) is belangrijk om de pathofysiologie van bepaalde ziekten te begrijpen en om mogelijk nieuwe strategieën voor therapeutische interventie te identificeren. Het volgende protocol beschrijft technieken om celmigratie te beoordelen die zijn aangepast voor het onderzoek van EEC.

Beoordeling van endotheelcelmigratie na blootstelling aan giftige chemische stoffen

Deze studie meldt twee verschillende methoden voor de analyse van de invasie van de cel en migratie: de bepaling van Boyden kamer en de in vitro video Microscoop gebaseerde wondgenezing bepaling. De protocollen voor deze twee experimenten worden beschreven, en hun voor- en nadelen worden vergeleken.

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Een protocol voor de kwantitatieve evaluatie van 3D-celmigratie binnen en in het grensvlak van granulaire hydrogels wordt hier gepresenteerd.

Kwantificering van driedimensionale celmigratie binnen en in granulaire hydrogel biomaterialen

De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes gelabeld met de rode fluorescente kleurstof FM 4-64 om de snelheid van presynaptische blaasje release in hippocampale neuronale culturen te meten.

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

Leer een aanpasbare methode om celmigratie te meten in reactie op chemotactische agentia met deze microkanaaltechniek. Deze eenvoudige aanpak helpt onderzoekers bij het bestuderen van wondgenezing en groeifactoreffecten in vitro.

Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie

Meer video's verkennen