Name: Efficiënte Differentiatie van pluripotente stamcellen tot NKX6-1 + Pancreatic Progenitors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer een viertrapsprotocol om pluripotente stamcellen te differentiëren naar NKX6-1+ pancreasprogenitorcellen. Deze methode genereert hoge percentages progenitorcellen voor diabetesonderzoek en geneesmiddelontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit manuscript werd ondersteund door financiering uit de Toronto General en West Foundation en de Banting en Best Diabetes Centre-University Health Network Graduate Award.

1. Voorbereiding van de Solutions en Media OPMERKING: Bereid alle media voor celkweek in een steriele omgeving. Media worden gemaakt en direct gebruikt. Reagens details vindt u in de Materials tabel. <ol><li> differentiatie Media <ol><li> Bereid Day 0 Differentiatie Media: RPMI Medium met 1% glutamine, 2 uM CHIR 99.021, 100 ng / ml activine A, 10 4 M MTG. </li><li> Bereid Dag 1-2 Differentiatie Media: RPMI medium met 1% glutamine, 100 ng / ml activine A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 ug / ml ascorbinezuur. </li><li> Bereid Dag 3-5 Differentiatie Media: RPMI Medium met 1% glutamine, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 uM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10. </li><li> Bereid Dag 6-7 Differentiatie Media: DMEM met 1% glutamine, 1% B27, 50 ug / ml ascorbinezuur, 50 ng / ml FGF10, 0,25 pM SANT-1, 2 uM retinoïnezuur, 50 ng / ml NOGGIN. LET OP: RetinoicAcid moet als laatste aan de media worden toegevoegd en de media moeten worden beschermd tegen het licht tot oxidatieve afbraak 15 te voorkomen. </li><li> Bereid Dag 8-12 Differentiatie Media: DMEM met 1% glutamine, 1% B27, 50 ug / ml ascorbinezuur, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml hEGF, 10 mM nicotinamide. </li></ol></li><li> Bereid FACS-buffer: 10% FBS in PBS, minus calcium en magnesium. </li></ol> 2. MES Differentiatie OPMERKING: MES ontdooid, doorgekweekt en breidde bestraalde muis embryonale fibroblasten in de aanwezigheid van een KOSR-gebaseerde media aangevuld met bFGF 16. HESCs zijn klaar voor differentiatie wanneer de cellen te bereiken 80-95% samenvloeiing. Op dit moment moet de kolonies groot met gedefinieerde randen en een &#39;koepelvormige&#39; structuur (Figuur 1A) zijn. Alle celkweek wordt uitgevoerd in vlakke bodem, met weefselkweek behandelde platen bekleed met 0,1% gelatine. Gewoonlijk worden de cellen gekweekt in 6 of12-well platen, in media volumina van 2 ml of 1 ml. <ol><li> Op dag 0, beginnen differentiatie door vervanging van de KOSR-gebaseerde media met dag 0 Differentiatie media. </li><li> Op dagen 1 en 2, schud de plaat dode cellen van de monolaag verwijderen voordat aspireren. Vervang de Dag 1-2 Differentiatie Media. </li><li> Op dag 3, oogst cellen voor flowcytometrie. Als de cellen brengen meer dan 90% CXCR4 + / CD117 +, ga dan naar stap 2.4. </li><li> Op dagen 3 en 5, schud de plaat dode cellen van de monolaag voorafgaand aan opzuigen verwijderen. Vervang de Dag 3-5 Differentiatie Media. </li><li> Op dagen 6 en 7 vervangen met dag 6-7 Differentiatie media. </li><li> Op dagen 8, 10 en 12, vervangen Dag 8-12 Differentiatie media. </li><li> Op dag 13, oogst cellen voor flowcytometrie te Pdx1 en NKX6-1 expressie te bepalen. </li></ol> 3. Oogsten Cellen voor Flowcytometrieanalyse <ol><li> Distantiëren cellen met1x commerciële trypsine oplossing volgens protocol van de fabrikant en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 min. </li><li> Verwijder commerciële trypsine-oplossing en resuspendeer enkele cellen in 1000 pi FACS buffer met 30 ul DNase I. </li><li> Filter cellen met behulp van een 35 um nylon mesh cel zeef en overbrengen in een microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer cellen bij 455 xg gedurende 5 minuten. Bereid je cellen voor live of vaste vlekken. </li></ol> 4. kleuring voor flowcytometrie <ol><li> Flow voorbereiding voor levende kleuring op dag 3 <ol><li> Resuspendeer cellen in 1000 pi FACS buffer. Transfer 200 pi (ongeveer 1-3 x 10 5 cellen) in twee putjes van een 96-well plaat (zowel ongekleurd en gekleurd monsters). </li><li> Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat. </li><li> Vlek met primaire-geconjugeerde antilichamen, CXCR4: APC en CD117: PE (zie M aterialen Table) voor 30 min bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat. </li><li> Resuspendeer monsters in 100 gl FACS buffer. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat. </li><li> Resuspendeer elk monster en in een totaal volume van 300-500 gl FACS buffer aan 1 ml micro reageerbuizen of 5 ml rondbodem buizen. </li><li> Run monsters op de flowcytometer 17. Indien monsters niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd, op te slaan bij 4 ° C beschermd tegen licht. </li></ol></li><li> Flow voorbereiding vaste kleuring op dag 13 <ol><li> Resuspendeer de celpellet in commerciële fixatie / permeabilisatie oplossing gedurende 24 uur bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer het monster bij 455 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer in 400 ul Perm / wasoplossing. </li><li> Transfer 200 ul van het monster (ongeveer 0,5-1 x 10 6 cellen) aan two putjes van een 96-well plaat (IgG controle en Pdx1 / NKX6-1 kleuring). Centrifugeer bij 931 xg gedurende 2 minuten. </li><li> Resuspendeer de celpellets in 100 gl Perm / Wash oplossing die anti-Pdx1 en anti-NKX6-1 primaire of isotype controle antilichamen (zie Materialen tabel). Incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat. Resuspendeer monsters in 100 ul Perm / wasoplossing. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat. </li><li> Resuspendeer de monsters in 100 ul Perm / Wash met secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur beschermd tegen licht. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat. </li><li> Resuspendeer monsters in 100 ul Perm / Wash Solution. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat. </li><li> Repeet stap 4.2.9 en 4.2.10. </li><li> Resuspendeer elk monster en in een totaal volume van 300-500 gl FACS buffer aan 1 ml micro reageerbuizen of 5 ml rondbodem buizen. </li><li> Run monsters op de flowcytometer 17. Indien monsters niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd, op te slaan bij 4 ° C beschermd tegen licht. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Canadian Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes">http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes</a> (2016).</li>
<li>Cogger, K., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cell+replacement+therapies+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes.</a> Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Functional+Human+Pancreatic+beta+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2014).</li>
<li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Gouon-Evans, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-4+is+required+for+hepatic+specification+of+mouse+embryonic+stem+cell-derived+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).</li>
<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Pan, F. C., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).</li>
<li>Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6+transcription+factors+and+Ptf1a+function+as+antagonistic+lineage+determinants+in+multipotent+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors.</a> Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met succes het genereren van NKX6-1 + alvleesklier voorlopers van hPSCs in vitro is gebaseerd op het gebruik van hoge kwaliteit culturen van hPSCs en regisseerde differentiatie met betrekking tot de nauwkeurige regeling van specifieke signaalwegen die sleutel ontwikkelingsstadia regeren tijdens de ontwikkeling van de alvleesklier. Hoewel dit protocol kan worden gebruikt om robuuste expressie van NKX6-1 induceren in een verscheidenheid van HPSC lijnen eerder aangetoond 3 voor e...

De prevalentie van diabetes neemt toe en volgens de Canadese Diabetes Association, wordt geschat dat meer dan 11 miljoen mensen in Canada zijn diabetes of prediabetes, met 5-10% van deze individuen met type 1 diabetes (type 1 diabetes) 1. T1D een auto-immuunziekte die wordt veroorzaakt door de vernietiging van de insulineproducerende β cellen die zich binnen de eilandjes van Langerhans. Op dit moment, mensen die leven met T1D vereisen exogene bronnen van insuline 2. Ondanks de vooruitgang in insulinetherapie, T1D patiënten nog steeds een moeilijke tijd reguleren van hun bloedsuikerspiegel en blijven zowel hypo- en hyperglycemie lijden. Een veelbelovende vorm van behandeling te herstellen normoglycemia in T1D is het gebruik van menselijke embryonale stamcellen (hESCs), die kan worden gebruikt voor een onbeperkte hoeveelheid insulineproducerende β-cellen zowel in vivo als in vitro genereren 3, 4, 5, 6, 7. Differentiatie hESCs aan P-achtige cellen kan het mogelijk maken om diabetes te bestuderen in vitro, waardoor de identificatie van nieuwe therapeutische doelen voor type 2 diabetes en zorgen cellen voor transplantatie in patiënten T1D. De meest succesvolle poging tot het genereren insulineproducerende cellen van hESCs in vitro is de embryonale events tijdens ontwikkeling van de alvleesklier 4, 5 recapituleren. Dit omvat de manipulatie van verschillende signaalwegen nauwkeurig modelleren belangrijke fasen van de ontwikkeling van de alvleesklier. Pancreatische ontwikkeling begint bij de inductie van de definitieve endoderm, die wordt gekenmerkt door de expressie van CXCR4 en CD117 (c-KIT) 8, 9. Nauwkeurige regeling van Definitive endoderm organisatie is nodig voor de vorming van de darm buis, die vervolgens ondergaat anterior naar posterior en ventrale patroonvorming dorsale. De dorsale en ventrale alvleesklier knoppen komen uit het gebied van de achterste voordarm dat de pancreas en duodenale homeobox gen (Pdx1), die noodzakelijk zijn voor ontwikkeling van de alvleesklier 10 is uitdrukt. De dorsale en ventrale knoppen zekering aan de alvleesklier, die vervolgens ondergaat uitgebreide epitheliale verbouwing en uitbreiding 11 te vormen. Betrokkenheid bij de endocriene en exocriene lineage vergezeld door het genereren van multipotente progenitorcellen (MPL) dat expressie onder meer de transcriptiefactoren Pdx1, Nkx6.1 en Ptf1a 12, 13. Mediterrane partnerlanden die endocriene en ductale cellen zullen worden blijven Nkx6-1 te drukken terwijl het verminderen van Ptf1a expressie. In tegenstelling tot deze, zal exocriene lineage cellen verliezen expression van Nkx6-1 en Ptf1a expressie 12 te handhaven. De transcriptiefactor Nkx6-1 een sleutelrol in pancreatische ontwikkeling, met name tijdens de differentiatie van endocriene voorlopercellen cellen P. Zoals eerder beschreven, deletie van Nkx6-1 leidt tot verminderde vorming van β cellen gedurende ontwikkeling van de alvleesklier 14. Derhalve genereren insulineproducerende β-cellen zowel in vitro en in vivo is een efficiënte inductie van Nkx6-1. We hebben onlangs een protocol om efficiënt te genereren Pdx1 + / NKX6-1 + alvleesklier voorlopercellen uit hPSCs ontwikkeld. Deze HPSC-afgeleide pancreas voorlopercellen te genereren rijpe β cellen na transplantatie in immunodeficiënte muizen 3. De differentiatie protocol kan worden verdeeld in 4 fasen karakteristiek: 1) definitieve endoderm inductie, 2) achterste voordarm patroonvorming 3) pancreas specificatie en 4) NKX6-1 inductie. Hier hebben wij een gedetailleerde beschrijving van elke stap van de gerichte differentiatie.

<table><tbody><tr><td>Media en cytokines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Activine A</td><td>R&amp;D</td><td>338-AC/CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinezuur</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash buffer, 1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>Tocris</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphine</td><td>Sigma</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovien serum (FBS)</td><td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R&amp;D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine uit varkenshuid</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R&amp;D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Retinoïnezuur</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), fenolrood</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Antilichamen voor stromcytometrie (werkconcentraties)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp; Bioscience</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647-conjugaat (1:400)</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>Isotype controle muis IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.&nbsp;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Isotype controle geiten IgG</td><td>R&amp;D&nbsp;&nbsp;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2.000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R&amp;D</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

efficiënte differentiatie van pluripotente stamcellen tot nkx6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancreatic progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotente stamcellen hebben het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren naar meerdere lijnen, waardoor ze een aantrekkelijk bron voor het genereren van pancreatische voorlopercellen die kunnen worden gebruikt voor de studie en de verwachte behandeling van diabetes. Dit artikel schetst een viertraps differentiatie protocol ontwikkeld om pancreas stamcellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) te genereren. Dit protocol kan worden toegepast op verschillende humane pluripotente stamcellen (HPSC) lijnen. De aanpak van de pancreas voorlopercellen te genereren is om hESCs om nauwkeurig te modelleren belangrijke stadia van ontwikkeling van de alvleesklier te onderscheiden. Dit begint met de inductie van de definitieve endoderm, hetgeen wordt bereikt door de cellen te kweken in aanwezigheid van activine A, basische fibroblastgroeifactor (bFGF) en CHIR990210. Verdere differentiatie en patroonvorming met fibroblast groeifactor 10 (FGF10) en Dorsomorphin genereert cellen die lijkt op de achterste voordarm. De toevoeging van Retinzuur, NOGGIN, SANT-1 en FGF10 onderscheidt achterste voordarm cellen in cellen kenmerk van de alvleesklier endoderm. Tenslotte is de combinatie van epidermale groeifactor (EGF), nicotinamide en NOGGIN leidt tot efficiënte productie van Pdx1 + / + cellen NKX6-1. Flowcytometrie wordt uitgevoerd om de expressie van specifieke markers te bevestigen op cruciale fasen van ontwikkeling van de alvleesklier. De Pdx1 + / + NKX6-1 pancreatische voorlopercellen aan het einde van trap 4 kunnen genereren rijpe β cellen na transplantatie in immunodeficiënte muizen en kunnen verder worden gedifferentieerd tot insuline producerende cellen in vitro te genereren. Zo is de efficiënte productie van Pdx1 + / + NKX6-1 pancreatische voorlopercellen, zoals aangetoond in dit protocol, is van groot belang omdat het een platform voor humane pancreatische ontwikkeling worden bestudeerd in vitro en een bron van cellen met de potentie om te differentiëren β cellen die kunnen eventually worden gebruikt voor de behandeling van diabetes.

Efficiënte productie van pancreatische voorlopercellen berust op de juiste groei en behoud van gedifferentieerde cellen, gevolgd door de juiste toevoeging van bepaalde signaalmoleculen tijdens de differentiatie protocol, zoals in het schema in figuur 1A. Op dag 0, moet ongedifferentieerde cellen 80-95% confluent en kolonies moeten gedefinieerde randen (figuur 1A) hebben. Tijdens fase 1, zullen de media waarschijnlijk verschijnen bewolkt sinds celdood is ...

Hier beschrijven we een 4-traps protocol om menselijke embryonale stamcellen te differentiëren naar NKX6-1 + alvleesklier voorlopercellen in vitro. Dit protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van humane pluripotente stamcellijnen.

Efficiënte Differentiatie van pluripotente stamcellen tot NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Het algemene doel van deze procedure is om in vitro efficiënt NKX6.1-expresserende pancreatische progenitorcellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen door de cellen te differentiëren via vier cruciale stadia van de pancreatische ontwikkeling. Door humane pluripotente stamcellen via vier cruciale stadia van de pancreatische ontwikkeling te differentiëren, biedt dit protocol een model om de menselijke pancreasontwikkeling in vitro te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande protocollen is dat wij in staat zijn om hoge percentages NKX6.1-positieve pancreatische progenitorcellen te genereren met behulp van diverse humane pluripotente stamcellijnen.Aangezien pancreatische progenitorcellen het potentieel hebben om insuline-producerende bèta-achtige cellen te genereren, biedt deze techniek ons de mogelijkheid om cellen te ontwikkelen voor de behandeling van diabetes, voor geneesmiddelenonderzoek en voor ziektemodellering. Begin op dag nul de differentiatie door het KnockOut serumvervangingsmedium te vervangen door het differentiatiemedium voor dag nul. Schud vervolgens op dag één en twee de plaat voorzichtig om dode cellen uit de monolayer te verwijderen voordat het medium wordt afgezogen.Vervang dit vervolgens door differentiatiemedium voor dag één tot twee. Oogst op dag drie de cellen voor flowcytometrie. Als de cellen meer dan 90% CXCR4 en CD117 tot expressie brengen, is de efficiëntie bereikt.Schud de plaat vervolgens voorzichtig om eventuele dode cellen uit de monocultuur te verwijderen vóór aspiratie en vervang het medium door differentiatiedium voor dag drie tot vijf. Het is belangrijk om via flowcytometrie te bevestigen dat de inductie van het definitieve endoderm tegen dag drie efficiënt is verlopen. Als het percentage cellen dat zowel CXCR4 als CD117 tot expressie brengt lager is dan 90%, zal de differentiatie naar pancreatische progenitorcellen waarschijnlijk belemmerd worden.Vervang op dag zes en zeven het medium door differentiatiemedium voor dag zes tot zeven. Vervang op dag acht, 10 en 12 het medium door differentiatiemedium voor dag acht tot 12. Oogst vervolgens op dag 13 de cellen voor flowcytometrie om de expressie van PDX1 en NKX6.1 te bepalen.Om de cellen te oogsten voor flowcytometrie-analyse, worden de cellen gedissocieerd met een commerciële Trypsine-oplossing volgens het protocol van de fabrikant en worden de cellen gedurende drie minuten geïncubeerd bij 37 °C. Na drie minuten wordt de Trypsine-oplossing verwijderd en worden de enkelvoudige cellen opnieuw gesuspendeerd in 1 000 µL fax-buffer met 30 µL DNA One. Filter de cellen vervolgens met een nylon mesh cellstrainer van 35 µm en breng ze over naar een microcentrifugebuis.Centrifugeer de cellen bij 455 ×g gedurende vijf minuten voordat de cellen worden voorbereid voor levende of gefixeerde kleuring. Resuspendeer de cellen vervolgens in 1.000 µL fax-buffer. Breng 200 µL over naar twee wells van een 96-wells plaat voor zowel de ongekleurde als de gekleurde monsters.Centrifugeer de plaat vervolgens 2 minuten bij 931 ×g, verwijder daarna het supernatant door de plaat om te keren, kleur de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met de primaire geconjugeerde antilichaam in een eindvolume van 100 µL en bescherm ze tegen licht. Centrifugeer de plaat vervolgens opnieuw 2 minuten bij 931 ×g en verwijder na die twee minuten het supernatant door de plaat om te keren. Resuspendeer de monsters daarna in 100 µL FACS-buffer.Centrifugeer de plaat vervolgens 2 minuten bij 931 ×g. Verwijder het supernatant door de plaat om te keren. Resuspendeer de monsters vervolgens in 300 tot 500 µL FACS-buffer, breng ze over naar 1 mL micro-testbuisjes of 5 mL ronde bodembuisjes en analyseer de monsters met een flowcytometer.Als de monsters niet onmiddellijk kunnen worden geanalyseerd, bewaar ze dan bij vier graden Celsius en bescherm ze tegen licht. Resuspendeer in deze procedure de celpellet in een commerciële fixatie- en permeabilisatieoplossing gedurende 24 uur bij vier graden Celsius. Centrifugeer het monster na 24 uur bij 455 ×g gedurende vijf minuten en resuspendeer het vervolgens in 400 µL commerciële perm-wasoplossing.Breng vervolgens 200 µL van het monster over in twee putjes van een 96-wells plaat voor de IgG-controle en PDX1- en NKX6.1-kleuring, en centrifugeer de plaat bij 931 ×g gedurende twee minuten. Resuspendeer de celpellets daarna in 100 µL commerciële perm-wasoplossing met anti-PDX1- en anti-NKX6.1-primaire antilichamen of isotype-controleantilichamen. Incubeer deze gedurende de nacht bij 4 °C.Centrifugeer de plaat de volgende dag gedurende twee minuten bij 931 ×g, verwijder het supernatant door de plaat om te keren en resuspendeer de monsters in 100 µL van de commerciële perm-wasoplossing. Centrifugeer de plaat vervolgens gedurende twee minuten bij 931 ×g. Verwijder het supernatant door de plaat om te keren.Resuspendeer de monsters vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur in 100 µL perm wash-oplossing met secundair antilichaam en bescherm deze tegen licht. Centrifugeer de plaat na een uur 2 minuten bij 931 ×g en verwijder het supernatant door de plaat om te keren; resuspendeer de monsters daarna in 100 µL commerciële perm wash-oplossing, centrifugeer de plaat 2 minuten bij 931 ×g en verwijder het supernatant door de plaat om te keren. Resuspendeer het monster vervolgens opnieuw in 100 µL commerciële perm wash-oplossing en centrifugeer de plaat nogmaals 2 minuten bij 931 ×g voordat het supernatant wordt verwijderd.Resuspend de monsters vervolgens in 300 tot 500 µL fax-buffer en breng ze over naar afzonderlijke testbuisjes van 1 mL of ronde bodembuisjes van 5 mL voor flowcytometrie. Hier wordt een schema getoond van de inductie van pancreasprogenitoren uit humane embryonale stamcellen, waarin de dag van differentiatie, het ontwikkelingsstadium, het basismedium en de toegevoegde cytokinen in elke fase zijn aangegeven. En hier zijn de fasecontrastbeelden van de belangrijkste stadia van pancreasdifferentiatie.H1-cellen werden gedifferentieerd volgens het afgebeelde vierfasige differentiatieprotocol. Met ongedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen op dag nul, definitief endoderm in fase één, posterior voor Darm in fase twee, pancreatisch endoderm in fase drie en NKX6.1-positieve endodermale pancreatische progenitorcellen in fase vier. Deze figuur toont de representatieve flowcytometrie-plots van dag drie voor CXCR4 PE- en CD117 APC-antilichaamkleuring.Hier is het ongekleurde monster en hier is het gekleurde monster. En deze figuur toont representatieve flowcytometrie-plots van dag 13 voor pancreas-progenitorcellen afgeleid van stadium vier die NKX61 en PDX1 tot expressie brengen. Dit is de IGG-controle en dit is het gekleurde monster.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 13 dagen worden uitgevoerd. Dit kan echter variëren afhankelijk van de gebruikte cellijn. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle reagentia te testen vanwege variabiliteit tussen verschillende batches.Na het volgen van deze procedure kunnen de NKX6.1-positieve pancreatische progenitorcellen verder worden gedifferentieerd tot insulineproducerende bèta-achtige cellen met behulp van andere gepubliceerde protocollen. Dit biedt een platform voor het bestuderen van de rijping en ontwikkeling van bèta-cellen in vitro. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe menselijke pluripotente stamcellen efficiënt kunnen worden gedifferentieerd tot pancreatische progenitors door de cellen door vier belangrijke ontwikkelingsstadia te leiden.

efficient-differentiation-pluripotent-stem-cells-to-nkx6-1-pancreatic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video demonstrates the generation of neural progenitor cells from non-transgenic and transgenic human pluripotent stem cells (hPSCs). hPSCs are differentiated into neural progenitor cells using a neuronal differentiation medium. While differentiation is induced in non-transgenic cells using small molecules, the transgenic hPSCs are differentiated by adding an antibiotic that induces the promoter for a neuronal differentiation-specific transcription factor.

Differentiating Non-Transgenic and Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells

Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen die zijn toegewijd aan de definitieve endoderm ter verbetering van downstreamtoepassingen en verdere onderverdelingen.

Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen

Protocollen bij HPSC mutant lijnen met behulp van de iCRISPR platform te genereren en om hPSCs in glucose-responsief β-achtige cellen te onderscheiden zijn beschreven. De combinatie van genoom editing-technologie met HPSC gerichte differentiatie biedt een krachtig platform voor de systematische analyse van de rol van de lijn determinanten in de menselijke ontwikkeling en de progressie van de ziekte.

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in de alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1+ (PDX1+) cellen voor de generatie van de alvleesklier lineages op basis van de niet-kolonie type enkelgelaagde groei van afzonderlijke cellen los. Deze methode is geschikt voor het produceren van homogene hPSC-afgeleide cellen, genetische manipulatie en screening.

Efficiënte generatie van alvleesklier/twaalfvingerige darm Homeobox eiwit 1+ Posterior voordarm/Pancreatic voorlopercellen van hPSCs in hechting culturen

Dit protocol Details een monolayer, serum-vrije methode voor het efficiënt genereren van hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in 18 dagen. Dit omvat zes stappen als hpscs sequentieel differentiëren in tussenliggende celtypen zoals de primitieve streak, definitieve endoderm, posterieure foregut en lever Bud voor ouders voor het vormen van hepatocyte-achtige cellen.

Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

In dit protocol beschrijven we een stabiele, zeer efficiënte differentiatiestrategie voor het genereren van postganglionische sympathische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Dit model zal neuronen beschikbaar stellen voor het gebruik van studies van meerdere autonome aandoeningen.

Efficiënte differentiatie van postganglionic Sympathische neuronen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen onder Feeder-vrije en chemisch gedefinieerde cultuurvoorwaarden

Het doel van dit artikel is om een gestandaardiseerde aanpak te bieden om menselijke hepatische voorloperdifferentiatie van pluripotente stamcellen te induceren. De ontwikkeling van deze procedure met kant-en-klare mediaformuleringen biedt de gebruiker een gemakkelijk systeem om menselijke levercellen te genereren voor biomedisch onderzoek en vertaling.

Hepatische voorloperspecificatie van pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd differentiatiesysteem

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methode om de co-expressie van PDX1- en NKX6.1-transcriptiefactoren in pancreasvoorlopercellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in planaire monolagen te verhogen. Dit wordt bereikt door de verse matrix aan te vullen, de celdichtheid te manipuleren en de endodermale cellen te dissociëren.

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in pancreas bètacelvoorlopers in een 2D-kweeksysteem

De differentiatie van stamcellen in eilandjescellen biedt een alternatieve oplossing voor conventionele diabetesbehandeling en ziektemodellering. We beschrijven een gedetailleerd stamcelkweekprotocol dat een commerciële differentiatiekit combineert met een eerder gevalideerde methode om te helpen bij het produceren van insuline-afscheidende, van stamcellen afgeleide eilandjes in een schaaltje.

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in insulineproducerende eilandjesclusters

Dit artikel presenteert een protocol voor gerichte differentiatie en functionele analyse van β-celachtige cellen. We beschrijven optimale kweekomstandigheden en doorgangen voor menselijke pluripotente stamcellen voordat insulineproducerende pancreascellen worden gegenereerd. De differentiatie in zes fasen vordert van definitieve endodermvorming naar functionele β-celachtige cellen die insuline afscheiden als reactie op glucose.

Geoptimaliseerd protocol voor het genereren van functionele insuline-afscheidende cellen van de alvleesklier uit menselijke pluripotente stamcellen

Leer een viertrapsprotocol om pluripotente stamcellen te differentiëren naar NKX6-1+ pancreasprogenitorcellen. Deze methode genereert hoge percentages progenitorcellen voor diabetesonderzoek en geneesmiddelontwikkeling.

Efficiënte Differentiatie van pluripotente stamcellen tot NKX6-1

Meer video's verkennen