Intracellulaire kleuring en flowcytometrie om lymfocyten in muizen Aorta, nieren en lymfeklieren te identificeren in een Model of Hypertension
28 januari 2017
Dit artikel bevat gedetailleerde methodologie voor het identificeren en kwantificeren van functionele T-lymfocyten subsets in muizen nieren, aorta en de lymfeklieren aanwezig door intracellulaire kleuring en flowcytometrie. Het model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie werd gekozen uitleggen, stap voor stap, de procedures en de grondbeginselen van flowcytometrie en intracellulaire kleuring.
Het algemene doel van dit protocol is om single-cell suspensies te verkrijgen van de muis aorta, nier en lymfeklieren om immuuncellen te kwantificeren en te karakteriseren in een model van angiotensine II-geïnduceerde hypertensie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van hart- en vaatziekten, zoals welke twee lymfocytsubsets de ontwikkeling van hypertensie bevorderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de identificatie en kwantificering van immuuncelsubsets in vaste organen op single-celniveau mogelijk maakt.
Voordat u met de procedure begint, desinfecteert u de borstkas van de muis met 70%ethanol. Gebruik vervolgens een schaar om voorzichtig de huid en borstwand open te snijden om het hart bloot te leggen. Om het vaatstelsel te perfunderen, maakt u een kleine incisie in het rechter atrium en injecteert u gestaag ten minste 10 milliliter koude PBS met een snelheid van ongeveer één milliliter per seconde in de top van het linker ventrikel.
Wanneer alle organen zijn gebleekt, gebruikt u fijne dissecteertangen om de aan de abdominale aorta aftakkende lymfeklieren te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat de capsules niet scheuren. Verwijder onder een dissectiemicroscoop de twee nieren met fijne schaar. Gebruik vervolgens fijne gebogen schaar om de hele thoracale en abdominale aorta te dissecteren, beginnend bij het hart en eindigend bij de iliacale bifurcatie, waarbij u ervoor zorgt dat het omliggende perivasculare vet aan de aorta blijft gehecht.
Breng vervolgens de nieren over in een dissociatiebuis met 10 milliliter nierdigestieoplossing en gebruik een semi-automatische dissociator om het nierweefsel mechanisch te desintegreren volgens de instructies van de fabrikant. Aan het einde van de dissociatie, incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius onder continue rotatie. Na 20 minuten stopt u onmiddellijk de enzymatische vertering met koud RPMI 1640-medium gesupplementeerd met 5%FBS en filtert u de resulterende weefselslurry door een 40-micron zeef in een 50-milliliter kegelbuis.
Gebruik de zuiger van een een-milliliter spuit om het resterende weefsel los te maken. Bepaal vervolgens de cellen door centrifugatie. Resuspendeer het pellet in drie milliliter 36%dichtheidsgradiëntmedium en breng de cellen over in een 15-milliliter kegelbuis.
Leg voorzichtig drie milliliter 72%dichtheidsgradiëntmedium onder de cellen, zorg ervoor dat de lagen niet worden verstoord, en scheid de cellen door centrifugatie. De immuuncellen zullen zich op het grensvlak bevinden. Verwijder de bovenste gelige laag met cellulaire resten en breng het volume vervolgens op 15 milliliter met behulp van koude PBS.
Schud goed om de gradiënt te breken en was vervolgens de cellen door centrifugatie. Om de aortische immuuncellen te isoleren, brengt u de aorta over in een twee-milliliter buis met één milliliter vers bereide aorta-digestieoplossing op ijs en gebruikt u fijne schaar om de hele aorta in fijne stukjes te snijden. Incubeer vervolgens de fragmenten gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met continue rotatie.
Aan het einde van de vertering, voegt u koud RPMI toe dat is gesupplementeerd met 5%FBS bij vijf keer het volume van de verteringoplossing en filtert u de resulterende weefselslurry door een 40-micron zeef. Verzamel vervolgens de single-cell suspensie door centrifugatie en resuspendeer het pellet in vers RPMI met FBS. Om een single-cell suspensie te genereren uit de aan de aorta aftakkende lymfeklieren, brengt u de lymfeklieren over op een 40-micron zeef in een 60-bij-15 millimeter weefselkweekschaal en gebruikt u de zuiger van een een-milliliter spuit om het weefsel los te maken.
Spuit vervolgens de zeef door met twee milliliter RPMI plus FBS en brengt u de bevrijde cellen over in een 15-milliliter kegelbuis. Om de cellen te stimuleren, stelt u eerst elke celsuspensie in op een concentratie van een maal 10 tot de zesde cellen per milliliter in celkweekmedium. Voeg vervolgens twee microliter van het celactivatiecocktail toe aan elke groep cellen voor elke één milliliter medium.
Breng vervolgens één tot twee maal 10 tot de zesde aorta of niercellen per put over in een 12-well plate en één tot twee maal 10 tot de zesde lymfeknopcellen per put in een 24-well plate. Plaats de platen in een 37 graden Celsius bevochtigde koolstofdioxide incubator gedurende drie uur. Breng vervolgens de cellen over in de juiste corresponderende polystyreen FACS-buizen en bepaal de cellen door centrifugatie.
Nadat u de cellen twee keer hebt gewassen met vers FACS-buffer onder dezelfde centrifugatievoorwaarden, blokkeert u en niet-specifieke oppervlaktebinding met FC-blok en wast u de cellen in PBS. Resuspendeer de pellets in één milliliter vers PBS en kleurt u de cellen met één microliter van een cel-impermeable amine-reactieve vitaliteitskleuring gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, wast u de cellen twee keer meer in één tot twee milliliter FACS-buffer en resuspendeer de pellets in 100 microliter van de geschikte celoppervlaktekleuring antilichaam cocktail.
Na 30 minuten bij vier graden Celsius en beschermd tegen licht, wast u de cellen nogmaals twee keer in twee milliliter vers FACS-buffer en fixeert en permeabiliseert u de cellen met een fixatie en permeabilisatie kit volgens de instructies van de fabrikant. Label vervolgens de cellen met de intracellulaire antilichaam cocktail van belang en was de cellen in FACS-buffer opnieuw. Voor flow cytometrische analyse van de gestimuleerde intracellulaire cytokine productie, voert u eerst de ongekleurde en enkelgekleurde controlebuizen uit om te corrigeren voor de spectrale overlap, gevolgd door de fluorescens-minus-één controles voor elke fluorofoor in het paneel.
Wanneer de basisfluorescentieanalyseparameters zijn ingesteld, gebruikt u een voorwaarts-naast-elkaar verstrooiingsgebiedsplot om de primaire poort voor de detectie van de leukocytenpopulatie in te stellen, gevolgd door poorting om de dode cellen uit te sluiten op basis van hun gebrek aan vitaliteitskleuringsuitdrukking. Plot de voorwaartse verstrooiingsgebied te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie om functionele T-lymfocytsubsets in de muizenier, aorta en lymfeklieren te identificeren en te kwantificeren middels intracellulaire kleuring en flowcytometrie. Het protocol richt zich op een model van door angiotensine II geïnduceerde hypertensie om de procedures en principes van flowcytometrie te illustreren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Cardiovasculaire ziekten
- Flowcytometrie
Achtergrond
- Het begrijpen van immuuncel-subsets is cruciaal in cardiovasculair onderzoek.
- Angiotensine II-geïnduceerde hypertensie dient als model voor het bestuderen van immuunresponsen.
- Flowcytometrie maakt gedetailleerde analyse op single-cell niveau mogelijk.
- Karakterisering van T-lymfocyt-subsets kan hun rol bij hypertensie onthullen.
Doel van de studie
- Om immuuncellen in muismodellen te kwantificeren en te karakteriseren.
- Om lymfocyten-subsets te identificeren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van hypertensie.
- Om een stapsgewijze handleiding te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Bereiding van enkelcel-suspensies uit muizenweefsels.
- Intracellulaire kleuring voor de identificatie van T-lymfocyten-subsets.
- Flowcytometrie voor kwantificering en analyse.
- Gebruik van angiotensine II om hypertensie bij muizen te induceren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van T-lymfocyten-subsets in solide organen.
- Kwantificering van immuuncellen als reactie op hypertensie.
- Inzichten in de rol van specifieke lymfocyten-subsets bij cardiovasculaire aandoeningen.
- Demonstratie van de effectiviteit van flowcytometrie in immunologische studies.
Conclusies
- De methodologie biedt een betrouwbare aanpak voor het bestuderen van immuunreacties bij cardiovasculaire aandoeningen.
- Flowcytometrie is een krachtig instrument voor het karakteriseren van immuuncelpopulaties.
- Verder onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische doelwitten te verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol stelt biofarmaceutische onderzoekers in staat om T-lymfocyten-subsets in solide organen die relevant zijn voor hypertensie te kwantificeren en te karakteriseren, waardoor mechanistische inzichten in immuun-gemedieerde cardiovasculaire pathologie worden verkregen. Door cytokine-producerende T-cellen in de muis-aorta, nieren en lymfeklieren te identificeren, ondersteunt deze methode de targetvalidatie en het verminderen van risico's bij immunomodulerende strategieën in de preklinische ontwikkeling. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen bij het koppelen van immuuncel-fenotypes aan ziektemechanismen, wat bijdraagt aan portfoliobeslissingen op het gebied van inflammatoire en cardiovasculaire aandoeningen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar T-cel-subsets die IL-17A, IL-17F, IFN-γ en T-bet produceren om pathogene mechanismen bij hypertensie te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare kwantificering van immuuncelinfiltratie in weefsels, wat een hypothese-gestuurde selectie van targets ondersteunt.
- Voorspellende waarde: Faciliteert biologische risicoreductie door specifieke lymfocytenfenotypes te koppelen aan vasculaire en renale dysfunctie in preklinische modellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde single-cell suspensies uit muizenweefsels voor een consistente immuunprofilering over experimentele groepen heen.
- Operationele waarde: Vestigt een schaalbare workflow voor ex vivo stimulatie, fixatie, permeabilisatie en multi-parameter kleuring die geschikt is voor assay-optimalisatie.
- Assay-gereedheid: Produceert kwantitatieve flowcytometrie-outputs die vergelijking van immuuncelfrequenties en functionele toestanden onder hypertensieve omstandigheden mogelijk maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door het identificeren van weefselresidente T-celsubsets waarvan de activering correleert met de ernst van de hypertensie.
- Operationele waarde: Waarborgt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het leveren van een gestandaardiseerde methode voor longitudinale immuunmonitoring.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door immuun-gemedieerde mechanismen van weefselschade in angiotensin II-geïnduceerde hypertensiemodellen te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot preklinisch onderzoek, wat immuunprofilering mogelijk maakt op cruciale overgangspunten in de modellering van hart- en vaatziekten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door te identificeren welke lymfocyten-subsets zich ophopen in hypertensieve weefsels en wat hun functionele cytokinprofielen zijn.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare single-cell suspensies met kwantitatieve read-outs voor de frequenties van immuuncel-subsets en activatiestanden.
- Analytiek: Maakt multiparametrische flowcytometrie-analyse mogelijk om de intracellulaire expressie van cytokinen en transcriptiefactoren tussen verschillende experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt immuuncel-fenotypes in muisweefsels met potentiële biomarker-pathways die relevant zijn voor menselijke hypertensie.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor immuunprofilering over cardiovasculaire, renale en inflammatoire ziektemodellen.
Operationele impact & impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in immuun-cardiovasculaire interacties te verminderen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare protocollen voor weefseldissociatie en kleuring die geschikt zijn voor preklinische studies op meerdere locaties.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie van immunomodulerende targets mogelijk te maken via kwantitatieve immuunfenotypering.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten door data te verschaffen over immuun-gemedieerde mechanismen van hypertensieprogressie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in muisweefseldissectie, single-cell preparatie en het ontwerp van multi-color flowcytometrie-panels.
- Afhankelijk van toegang tot flowcytometers, centrifugatieapparatuur en reagentia voor weefseldigestie, stimulatie en antilichaamskleuring.
- Vereist standaardisatie van gating-strategieën en fluorescence-minus-one controles tussen laboratoria voor een reproduceerbare interpretatie van de data.
- Vereist aanpassing van dissociatie-enzymen en mechanische disruptietechnieken voor verschillende weefseltypen (nier, aorta, lymfeklieren).
- Beperkt door de verwerkingstijd van monsters en beperkingen in celviabiliteit, wat een efficiënte uitvoering van de workflow vereist om ex vivo artefacten te minimaliseren.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Kidney, Aorta, and Lymph Node Isolation and Single Cell Suspension Generation
4:29
Ex Vivo Stimulation and Intracellular Cytokine Detection
7:07
Results: Representative Analyses of Kidney, Aorta, and Aortic Lymph Node T Cell Activation
8:23
Conclusion
