Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Dit protocol demonstreert hoe de iCRISPR-platform voor snelle genoombewerking in hPSC's wordt gevestigd en hoe genome-bewerkte lijnen met hPSC-gerichte pancreasdifferentiatie kunnen worden geïntegreerd om menselijke pancreasontwikkeling en -ziekte te bestuderen. Deze methoden kunnen helpen om belangrijke vragen in het gebied van menselijke pancreasontwikkeling te beantwoorden, zoals genetische controle van normale pancreasontwikkeling en de moleculaire basis van diabetes. Het grote voordeel van deze technieken is dat ze ons in staat stellen om op efficiënte wijze genen van belang in hPSC's te wijzigen en deze gemodificeerde cellijnen te gebruiken voor studies van menselijke pancreasontwikkeling en -ziekte in vitro.

Kweek hPSC's in chemisch gedefinieerde en feeder-vrije omstandigheden op geamputeerde menselijke vitronectin-gecoate schotels. Voeg de dag voor elektroporatie 10 micromolar ROCK-remmer toe tijdens de mediawissel. Op de dag van elektroporatie, bereid vitronectin-gecoate 10-centimeter schotels van tevoren voor.

Vervolgens verwijdert u het kweekmedium uit de cellen, wast u eenmaal met PBS zonder calcium en magnesium en behandel de cellen dan met 1X dissociatiereagens bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer drie minuten. Aspirier vervolgens het dissociatiereagens voordat de cellen loskomen en voeg 10,5 milliliter volledig medium toe. Gebruik voorzichtig pipetteren om een enkele celsuspensie te vormen voordat u overbreekt naar centrifugeerbuisjes.

Voer een celtelling uit op 500 microliter celsuspensie met behulp van een geautomatiseerde celteller. Pel de hPSC's vervolgens bij 200 keer G gedurende vijf minuten. Resuspendeer de cellen in koud PBS bij 12,5 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter en verdeel in volumes van 800 microliter.

Voeg de plasmiden toe aan elke 800 microliter hPSC-suspensie en meng goed. Breng het mengsel over in een 0,4 centimeter elektroporatie cuvette en houd het ongeveer vijf minuten op ijs. Elektroporeer de cellen met behulp van een elektroporatiesysteem bij 250 volt en 500 microfarad.

Het is van cruciaal belang om gezonde en proliferende hPSC's te gebruiken voor genoombewerking. Na elektroporatie, breng de cellen over naar een 15 milliliter conische buis met vijf milliliter voorverwarmd, compleet medium en pellet de cellen. Resuspendeer de cellen in 10 milliliter compleet medium met 10 micromolar ROCK-remmer en plateer eenmaal 10 tot de zesde, 2,5 keer 10 tot de zesde en vijf keer 10 tot de zesde cellen van elke elektroporatie op vitronectin-gecoate schotels, zodat ten minste één van de platen voldoende enkele celkolonies heeft voor plukken.

Kweek de cellen bij 37 graden Celsius. Op dag twee, start de neomycine selectie door medium toe te voegen dat 500 microgram per milliliter G418 sulfaat bevat. Op dag zes, start de puromycine selectie door medium toe te voegen dat één microgram per milliliter puromycine dihydrochloride bevat.

Op dagen 10 tot 12 zullen de hPSC enkele celkolonies één tot twee millimeter in diameter bereiken. Op dit punt, pluk 12 tot 24 kolonies onder een stereo microscoop. Disgregeer mechanisch de hPSC kolonies in kleine stukken met behulp van een 200-microliter pipette tip en breng de cellen direct over in vitronectin-gecoate 24-well platen.

24 uur voor guide RNA transfectie, behandel iCas9 hPSC's met twee microgram per milliliter doxycycline. Op de dag van transfectie, bereid vitronectin-gecoate 24-well platen voor en dissocieert de iCas9 cellen in enkele cellen met behulp van 1X dissociatiereagens zoals eerder. Pel vervolgens de cellen bij 200 keer G gedurende vijf minuten en resuspendeer de cellen bij 0,5 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter in compleet medium aangevuld met twee microgram per milliliter doxycycline en 10 micromolar ROCK-remmer.

Plateer 500 microliter van de resuspendeerde cellen in individuele wells van de 24-well plate. Voor elke guide RNA, maakt u de volgende transfectie mengsels. Mengsel A, 50 microliter geredukeerd serum medium plus één microliter guide RNA.

Mengsel B, 50 microliter geredukeerd serum medium plus drie microliter transfectiereagens. Combineer mengsel A en B om een 100-microliter mengsel te maken en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg 50 microliter van het mengsel toe aan cellen in de dubbele wells van de 24-well plate en meng goed.

Na vier dagen, extraheert u genomisch DNA, PCR versterkt u de doelregio's flankerend de guide RNA targetsequenties en schat u de bewerkingsefficiëntie in met behulp van T7E1 digestie. Begin met differentiatie van hPSC lijnen wanneer cellen 80% confluency hebben bereikt twee dagen na het zaaien. Voeg differentiatie dag nul medium toe en verander vervolgens het medium dagelijks met behulp van de formules die hier worden getoond.

Op dag 10, onderzoekt u de latere pancreas voorloperp2 markeren, PDX1 en NKX6.1 door immunofluorescente kleuring van een subset van de cellen. Ga vervolgens over naar lucht-vloeistof interface kweek door eerst de PP2 cellen te behandelen met 10 micromolar ROCK-remmer gedurende vier uur. Zodra de incubatietijd is verstreken, dissocieer de cellen zoals eerder.

Minimaliseer de duur van dissociatiereagens behandeling om de celoverleving voor zaaien in de lucht-vloeistof interface fase van differentiatie te maximaliseren. Aspirier het dissociatiereagens voordat de cellen loskomen. Voeg vervolgens 10 milliliter boo-lah medium toe aan de plaat en verspreid de PP2 cellen in enkele cellen door voorzichtig up en down te pipetteren.

Verzamel de enkele celsuspensie. Tel het aantal cellen en pellet de cellen. Na resuspendering van het cellenpellet in S5 differentiatie medium, zet vijf tot 10 microliter cellen per spot op een transwell inzetfilter.

Voeg S5 medium toe aan de bodem van elke transwell inzet en incubeer met media veranderingen totdat pancreas endocrine markeren detecteerbaar zijn door immunofluorescente kleuring. Deze figuur toont iCRISPR-gemedieerde niet-homologe end joining in hPSC's. Gen knockout is zeer efficiënt, aangezien er geen selectieproc