In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen
16 maart 2017
Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.
Het algemene doel van dit protocol is om humane pluripotente stamcellen te differentiëren in humane trofoblastische cellen met behulp van botmorfogenetisch 4 en remmers van de actieve en nodale signaalroutes om de vroege gebeurtenissen van de vorming en functie van de menselijke placenta te bestuderen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in de studie van trofoblastische celfuncties en hoe deze cellen worden gevormd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het overvloedige trofoblastische cellen kan produceren voor een grote verscheidenheid aan toepassingen, inclusief genetica en celfunctie-assays.
Om het experiment te beginnen, ontdooi een aliquot van extracellulair matrix op ijs gedurende drie tot vier uur. Gebruik ijskoude pipetten, een koude 50 milliliter kegelbuis en Dulbecco's gemodificeerd medium, of DMEM F12 medium, om twee milligram extracellulair matrix over te brengen naar 24 milliliter ijskoud DMEM F12. Plaats onmiddellijk de 50 milliliter kegelbuis op ijs en bewaar deze bij vier graden Celsius.
Om de weefselkweekplaten te coaten, voegt u één milliliter van het verdunde extracellulair matrix toe per putje van een zes-putjesplaat. Draai de plaat om het putje te coaten en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende minstens één uur. Aspeer het extracellulair matrix uit de nieuwe plaat en voeg muis embryonaal fibroblast-geconditioneerd medium of MEFCM toe met bFGF.
Gebruik een pipet om de afgeschraapte cellulaire klemmen van de MEF-plaat over te brengen naar de met extracellulair matrix gecoate plaat. Bewaar de plaat vervolgens. Schrob afgescheiden cellen af met een Pasteur-pipet voordat u het MEFCM met bFGF-medium dagelijks vervangt met twee milliliter medium voor één putje.
Wanneer kolonies groot en helder zijn onder de microscoop, pas hESCs elke zes tot zeven dagen. Wanneer de feeder-vrije cellen klaar zijn om te passen, verwijdert u het medium en wast u de cellen door één milliliter PBS toe te voegen met een pipet. Aspeer de PBS en vervang deze door 0,5 milligram per milliliter voorgewarmde dispase met een pipet.
Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Na incubatie, was de cellen met PBS door twee milliliter PBS per putje toe te voegen en aspeer de PBS. Voeg één milliliter CM per putje toe en schraap de cellen handmatig in kleine klontjes met de punt van een vijf milliliter pipet.
Plaat vervolgens de gesuspendeerde cellulaire klontjes in nieuwe met extracellulair matrix gecoate platen. Bereid het differentiatiemedium voor. Gebruik CM zonder bFGF en voeg verse remmers toe voor gebruik.
Gebruik feeder-vrije hESCs die groeien op met extracellulair matrix gecoate platen voor één passage gekweekt in een incubator ingesteld op 5% zuurstof. Laat de cellen na de eerste passage op de met extracellulair matrix gecoate platen 24 uur aanhechten. De volgende dag, initieer differentiatie door het CM met bFGF te verwijderen en te vervangen door CM met BMP4/A/P met twee milliliter per putje in een zes-putjesplaat.
Blijf de cellen kweken met 4% zuurstofniveaus. Vervang het CM met BMP4/A/P om de twee dagen door het oude medium te aspeeren en nieuw medium met BMP4/A/P toe te voegen. Verzamel cellen op gewenste tijdstippen.
Kweek hESCs gedurende twee passages op extracellulair matrix na het overbrengen van de MEFs met hESC-medium met bFGF. Hoge cellulaire confluency is belangrijk, dus verdeel de hESCs een-op-een op een nieuwe plaat, wat zorgt voor minstens 50% confluency de volgende dag. Incubeer de cellen een nacht in de laag zuurstof incubator.
De volgende dag, vervang het medium met twee milliliter per putje van differentiatiemedium. Plaats de cellen een nacht in een laag zuurstof incubator. Voor transfectie, bekleed een schaal met gelatine door 0,1% gelatine aan een schaal toe te voegen.
Draai de schaal om het plate te coaten, laat de plaat vervolgens op kamertemperatuur. Verwijder na 20 minuten de gelatine. Differentieer de cellen tot het gewenste tijdstip.
De dag voor transfectie, trypsiniseren de cellen met 0,05% trypsine gedurende vijf minuten. Plaat de cellen op de gewenste confluency op de gelatine-gecoate plaat. Voeg CM toe met BMP4/A/P zonder bFGF en incubeer de cultuur een nacht.
De volgende dag, voeg vers differentiatiemedium toe aan de cellen. Transfecteer siRNA's met behulp van een siRNA-transfectiereagens. Gebruik voor plasma-DNA een geschikt lipofectamine-reagens.
Volg het productprotocol zoals beschreven voor elk transfectiereagens. Breng de siRNA-lipofectaminecomplexen over naar elke putje of plaat met cellen en meng voorzichtig. Cultiveer vervolgens de cellen een nacht in een laag zuurstof incubator.
De volgende dag, vervang het medium door vers differentiatiemedium. Oogst de cellen op gewenste tijdstippen om de gendisruptie-efficiëntie te controleren met behulp van kwantitatieve RT-PCR. Tot slot, om cellen te oogsten, voeg één milliliter van 0,05% trypsine per putje toe en incubeer de cellen.
Voeg vijf milliliter MEF-medium per putje toe om de trypsine te neutraliseren. Spin de cellen neer bij 200 keer g gedurende vijf minuten en gebruik de cellenpellet voor RNA-isolatie. Met deze techniek zijn morfologische veranderingen duidelijk zichtbaar.
Cellen op differentiatiedag één zijn groter dan de cellen van dag nul. Naarmate differentiatie vordert, delen de cellen zich en breiden uit vanuit het centrum van de kolonie, groeiend in een uitwaartse richting. De individuele kolonies smelten samen tegen differentiatiedag vijf met cellen die boven elkaar groeien.
QRT-PCR-analyse onthult dat de relatieve expressieniveaus van de pluripotente C-marker NANOG met 75% worden verminderd na één dag differentiatie wanneer cellen worden gekweekt met BMP4 en verminderd met 90% in de aanwezigheid van BMP4/A/P. Tegen differentiatiedag twee zijn de niveaus van NANOG erg laag voor cellen die worden gekweekt in BMP4 alleen of in BMP4/A/P in vergelijking met die in h
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar humane trofoblastcellen met behulp van bone morphogenic protein 4 en remmers van de Activine/Nodal-signaalpaden. Deze methode maakt een efficiënte generatie van trofoblastcellen mogelijk die geschikt zijn voor diverse toepassingen, waaronder genetische manipulatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
- Placentabiologie
Achtergrond
- Menselijke trofoblastcellen spelen een cruciale rol bij de vorming en functie van de placenta.
- Inzicht in de differentiatie van trofoblastcellen kan inzichten verschaft in de vroege menselijke ontwikkeling.
- Huidige methoden voor het genereren van deze cellen zijn vaak inefficiënt.
- Dit protocol heeft tot doel de opbrengst van trofoblastcellen voor onderzoeksdoeleinden te verbeteren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het genereren van trofoblastcellen uit pluripotente stamcellen.
- Het faciliteren van de studie naar de functies van trofoblastcellen.
- Het mogelijk maken van genetische manipulatie van trofoblastcellen voor diverse toepassingen.
Gebruikte methoden
- Het ontdooien van de extracellulaire matrix op ijs.
- Het bereiden van DMEM F12-medium voor celkweek.
- Het gebruik van bone morphogenic protein 4 en remmers van de signaleringsroute.
- Het overbrengen van cellen naar kweekcondities die geschikt zijn voor differentiatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie van humane pluripotente stamcellen tot trofoblastische cellen.
- Overvloedige productie van trofoblastische cellen voor experimenteel gebruik.
- Potentieel voor genetische manipulatie van de gegenereerde cellen.
- Inzichten in de vroege gebeurtenissen van de menselijke placentale ontwikkeling.
Conclusies
- Dit protocol biedt een efficiënte methode voor het genereren van trofoblastcellen.
- Deze aanpak kan het onderzoek naar placentabiologie aanzienlijk bevorderen.
- Toekomstige studies kunnen deze cellen benutten om trofoblastfuncties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt de schaalbare generatie van menselijke trofoblastaire cellen uit pluripotente stamcellen mogelijk, waardoor ethische beperkingen van primair embryo-onderzoek worden omzeild. Het biedt een hernieuwbaar, genetisch hanteerbaar systeem voor het bestuderen van de placenta-ontwikkeling en -functie, wat targetvalidatie in de reproductieve toxicologie en bij vroege zwangerschapsstoornissen ondersteunt. De methode faciliteert mechanistische risicoreductie door loss-of-function- en gain-of-function-studies mogelijk te maken in een ziekte-relevant menselijk celmodel.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar trofoblast-specifieke genfuncties mogelijk via siRNA-transfectie en plasmid-gebaseerde overexpressie.
- Operationele waarde: Produceert overvloedige, homogene trofoblastpopulaties die geschikt zijn voor high-content fenotypische screening.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de beoordeling van effecten van verbindingen op placentaceldifferentiatie, fusie en hormoonsecretie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Gedifferentieerde cellen brengen stadiumspecifieke markers tot expressie (bijv. CGB, HLA-G), wat kwantitatieve read-outs mogelijk maakt voor de standaardisatie van de assay.
- Schaalbaarheid: Het protocol ondersteunt expansie in 6-wells en grotere formaten voor toepassingen met een middel tot hoge doorvoer.
- Reproduceerbaarheid: Gedefinieerde BMP4/A/P-inhibitiecondities leveren een consistente trofoblastdifferentiatie op over verschillende passages.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert vroege placentaire insufficiëntie en paden gerelateerd aan pre-eclampsie via trofoblastdysfunctie.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen stamcelbiologie en de preklinische evaluatie van placenta-gerichte therapeutica.
- Afstemming van biomarkers: Secretie van hCG en PLGF maakt monitoring van de rijping en functionele staat van de trofoblast mogelijk.
Integratie van Pipeline & Workflow
Positioneert de generatie van trofoblasten als een fundamenteel instrument voor ontdekkingen tussen het onderhoud van pluripotente stamcellen en de inzet van functionele assays in programma's voor reproductieve toxicologie en materno-fetale gezondheid.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten over trofoblastinvasie, syncytialisatie en mechanismen van immuuntolerantie.
- Screening: Maakt compound-screening mogelijk voor modulatoren van trofoblastdifferentiatie en pathogeniteitsgevoeligheid.
- Analytiek: QRT-PCR en metrieken voor transfectie-efficiëntie bieden kwantitatieve eindpunten voor target engagement en pathway-modulatie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro differentiatie met ex vivo placentaire explantaten en in vivo modelvalidatie.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vestigt een schaalbare, opslagbare trofoblastbron voor herhaaldelijk gebruik in verschillende projecten en indicaties.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in de placentabiologie door middel van gecontroleerde genetische perturbatie.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerd differentiatieprotocol waarborgt de consistentie tussen batches over verschillende cellijnen en laboratoria.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in go/no-go-beslissingen door placentaire risico's vroegtijdig in de ontdekkingsfase te identificeren.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van trophoblast-veiligheidsprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, incubatie onder zuurstofarme omstandigheden en transfectietechnieken.
- Afhankelijk van coating met extracellulaire matrix, suppletie van BMP4/A/P en hypoxische (4–5%) kweekcondities.
- Vereist standaardisatie van transfectiereagentia en timing voor een consistente afgifte van siRNA of plasmiden.
- Aanpassing aan alternatieve hPSC-lijnen kan optimalisatie van de differentiatie-efficiëntie en markerexpressie vereisen.
- Beperkt door trofoblastheterogeniteit en spontane syncytialisatie gedurende langere kweekperioden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:49
Transitioning hESCs to Feeder-free Conditions
2:59
hESC Differentiation Using BMP4/A/P
4:02
Trophoblastic Cell Transfection Preparation
4:41
Transfection Using siRNAs
6:33
Results: Rapid Differentiation for Visualization and Analysis
7:51
Conclusion
