Name: Ontwikkeling Metarhizium anisopliae Als een mycoinsecticide: van isolatie tot veldprestatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Leer de ontwikkeling van een mycoinsecticide op basis van Metarhizium anisopliae voor biologische plaagbestrijding in de landbouw. Deze methode toont effectiviteit tegen Helicoverpa armigera en ondersteunt duurzame landbouwpraktijken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de bijdrage van medewerkers van het programma Biomedische Biologie (ISCB) van het Departement Biotechnologie, New Delhi en het Zwitserse Agentschap voor Ontwikkeling en Samenwerking, Berne, Zwitserland. De bijdragen van projectstudenten en medewerkers betrokken bij de ontwikkeling van het mycoinsecticide, waaronder Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane en Abhijeet Lande, worden erkend. EKP en SGT bedanken de universitaire subsidiecommissie, India en de Raad van Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek (CSIR), India, respectievelijk voor onderzoeksbeurzen. MVD erkent de steun van de Raad van Industrieel en Wetenschappelijk Onderzoek, New Delhi voor het Emeritus Scientist Scheme. De auteurs zijn dankbaar aan de afdeling Biotechnologie, New Delhi, India voor de financiële ondersteuning onder de ISCB en SBIRI programma&#39;s. Wij zijn dankbaar voorBeoordelaars voor hun input.

1. Isolatie van Entomopathogene Fungi <ol><li> Grondverdunning methode <ol><li> Verzamel de bodemmonsters en mycosed insecten uit verschillende gewasvelden ( tabel 1 ). Isolate de entomopathogene schimmels uit bodemmonsters met behulp van de grondverdunningingsplating methode 8 . Opmerking: In deze studie werden monsters verzameld uit de Pune (18 ° 31&#39;13&#39;N, 73 ° 51&#39;24&#39;&#39;E) en Buldhana (19 ° 58&#39;36&#39;&#39;N 76 ° 30&#39;30&#39;&#39;E ) Districten, Maharashtra, India. </li><li> Weeg 10 g van elk bodemmonster en voeg ze afzonderlijk toe aan 90 ml steriele 0,1% (w / v) Tween-80. </li><li> Meng de monsters grondig met behulp van een magnetische roerder gedurende 60 minuten om de sporen vast te houden die aan bodemdeeltjes worden gehecht. </li><li> Na het mengen, verspreid 100- tot 200 μl aliquots van elk monster op selectief medium dat (g / L) bevat: pepton, 10; Glucose, 20; Agar, 18; Streptomycine, 0,6; Tetracycline, 0,05; cycLohexamide, 0,05; En dodine, 0,1 ml; PH 7,0 9 . Incubeer de platen bij 28 ° C gedurende 3-7 dagen. </li><li> Selecteer en subcultuur de individuele sporulerende kolonies op hetzelfde medium om pure culturen te verkrijgen. </li></ol></li><li> Van mycosed insecten <ol><li> Verzamel de gemaalde insecten uit het veld. Opmerking: een harde larve lichaam is waarschijnlijk geïnfecteerd met entomopathogene schimmel. Met bacteriële of virale infectie is het dode insectenlichaam zacht. </li><li> Verzamel levende insecten met abnormaal gedrag, slechte coördinatie en ruige bewegingen. </li><li> Bewaar de insecten tot de dood en laat ze dan naar vochtige kamers voor verdere mycosis en sporulatie, indien aanwezig, bij 28 ° C en 70-80% RV. </li><li> Streep de sporen van de sporulerende kadavers op het bovengenoemde selectieve medium en verkry pure culturen door verder subculturen 2-3 keer op hetzelfde medium. </li></ol></li><li> Aasmethode <ol><li> In eenInjectieflacon (3,85 x 6,0 cm) met 60 g bodemmonster, voeg 4 rijstmotlarven ( Corcyra cephalonica ) toe en houd de flacons gedurende een periode van 14 dagen bij 25 ± 2 ° C. </li><li> Draai de flesjes elke dag op zijn kop. Na 14 dagen scherm de bodemmonsters voor de aanwezigheid van gemaalde rijstmotlarven. Isolate de entomopathogene schimmel door streepende sporen uit sporulerende kadavers op selectief medium. </li><li> Na het verkrijgen van zuivere culturen, overdragen de isolaten naar de aartappeldextrose agar (PDA) slang en incuberen bij 28 ° C en 70-80% RH gedurende 7 dagen om sporulatie mogelijk te maken. Volg na sporulatie de moederculturen bij 8 ° C tot gebruik. </li></ol></li></ol> 2. Identificatie van Entomopathogene Fungi <ol><li> Entomopathogene schimmels identificeren door morfologische eigenschappen te observeren ( dwz ongeslaglijke sporengrootte en vorm en de ordening van de sporen op conidioforen); Isolaten van 3 hoofdgenera, Metarhizium , Beauv<html> Eria, en Nomuraea , kunnen worden geïdentificeerd. </li><li> Voor de moleculaire identificatie van Metarhizium stammen, extract het genomisch DNA uit de myceliale biomassa met behulp van een DNA isolatie kit; Volg de instructies van de fabrikant (zie de tabel ). Controleer de kwaliteit van genomisch DNA door elektroforese op een 0,8% agarosegel uit te voeren. <ol><li> PCR-amplificeer het ITS1-5.8S-ITS2 en 26S rDNA gebied. Gebruik genomisch DNA als een sjabloon, met ITS1 forward (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) en ITS4 reverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) primers 10 . </li><li> Gel-elueren en zuiveren de amplitonen met een verwachte grootte, met behulp van een gel-extractie kit; Volg de instructies van de fabrikant (zie de tabel ). Kwantificeer het gezuiverde amplicon en de sequentie. </li><li> Lees en bewerk de sequenties met behulp van de software en voer een BLAST-zoekopdracht uit van de nucleotide sequenties in de NCBI GenBank databibliotheek om de close homology te analyseren= &quot;Xref&quot;&gt; 11. </li><li> Plaats de sequenties van geïdentificeerde entamopathogene isolaten in de NCBI GenBank-database om de toetredingsnummers op te halen. </li></ol></li></ol> 3. Het screenen van Metarhizium Isolates tegen H. Armigera <ol><li> Insectopvang <ol><li> Bepaal de initiële cultuur van H. armigera door het verzamelen van gezonde larven en poppen van het insect uit het veld. </li><li> Voor het opgroeien, groei de larven individueel in steriele polypropyleenflessen (3,85 x 6,0 cm, 50 ml capaciteit) die stukken okra desinfecteren met 0,5% (v / v) natriumhypochloriet gedurende 10 minuten 12 . </li><li> Verzamel de insecten eieren die tijdens het opvoeden worden gelegd en ze-steriliseren met 0,5% (v / v) natriumhypochloriet. </li><li> Behoud de larven bij 25 ± 2 ° C en 65 ± 5% RH. </li></ol></li><li> Insect bioassay Opmerking: Voor de bio bioassay is de productie van sporen,En veldprestaties, werden de eerste subculturen van Metarhizium stammen van mycosed H. armigera larven gebruikt, tenzij anders vermeld. <ol><li> Voor de bio bioassays gebruikt u III-instarlarven van H. armigera . </li><li> Dip een reeks van 30 larven in triplicaat individueel in een 10 ml spore suspensie van Metarhizium isolaten (1 x 10 7 sporen / ml, tenzij anders vermeld, levensvatbaarheid&gt; 90%) gedurende 5 s. </li><li> Na de behandeling, overbrengen elke larve individueel naar een aparte steriele injectieflacon om kannibalisme te vermijden. Voeg bij elke injectieflacon vochtig Whatmann filterpapier nr. 1 en een stuk desinfecteerde okra toe als voer. Verander het papier en voer op alternatieve dagen. </li><li> Houd de larven bij 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% RH en 16: 8 licht: donker gedurende 14 dagen of tot ze doodgaan. </li><li> Breng de dode larven over op steriele Petri-platen die vochtige katoenwatten bevatten en houd ze bij 28 ° C en 70-80% RV gedurende 3-7 dagen om mycelia en sporen te latenVorming over de kadavers. </li><li> Voor een controle, behandel een set van 30 larven in triplicaat met 0,1% (w / v) Tween-80 in steriel gedistilleerd water. </li><li> Doe alle experimenten in triplicaat met behulp van vers bereide sporen suspensies. Verzamel en pool de gegevens over percenten sterfte uit drie experimenten om gemiddelde waarden te krijgen. Bereken de gecorrigeerde percent mortaliteit met behulp van Abbott&#39;s formule 13 . </li><li> Voer de experimenten uit via een gerandomiseerde volledige blokontwerp (RCBD), met elke behandeling die een set van 30 larven bevat in drievoud. Gebaseerd op percent mortaliteit tegen H. armigera , selecteert Metarhizium isolaten voor verdere screening van het beste isolaat voor commerciële productie. </li><li> Selecteer de isolaten die&gt; 90% sterfte tonen tegen H. armigera III-instar larven. Opmerking: hier werden 12 isolaten geselecteerd. </li><li> Bepaal de LT 50 van deze isolaten en selecteer de isolaten demBeoordeling van de snelste moord (in minder tijd). Opmerking: hier werden 5 isolaten geselecteerd uit de 12 meest krachtige isolaten. </li><li> Bepaal de LC 50- waarden van de geselecteerde isolaten met behulp van vier verschillende concentraties (dwz 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 en 1 × 10 9 sporen / ml) spore suspensie. </li><li> Bepaal de LC 50 van de Metarhizium- isolaten tegen III-instarlarven van H. armigera om de kans op het verschil in de virulentie van isolaten met hoge sterftewaarden te bepalen die onopgemerkt kunnen zijn als alleen een enkele dosis wordt gebruikt. </li></ol></li></ol> 4. Productie van Sporen van een Metarhizium Isolaat voor Field Performance Studies <ol><li> Productie van Metarhizium sporen door SSF <ol><li> Voor SSF, berei het inoculum voor door 2 x 10 7 sporen van de Metarhizium isolaten toe te voegen aan200 ml YPG (0,3% gist extract, 0,5% pepton en 1,0% glucose) medium. Incubeer de flesjes bij 28 ° C bij schudden (180 rpm) gedurende 48 uur. </li><li> Voor de massaproductie van sporen door SSF, gebruik rijst als substraat, tenzij anders vermeld. </li><li> Voor SSF, vul autoclaafzakken (type / 14 met een enkele microventief filter van 0,5 μm, 2 kg capaciteit, 64 × 36 cm) met 2 kg rijst. Voeg 1000 ml gedistilleerd water toe aan de rijst in de zakjes en week overnacht 14 . Autoklaaf de zakjes met de geweekte rijst bij 121 ° C gedurende 45 minuten 15 . </li><li> Inoculeer de zakjes met 48-h-oude mycel inoculum (10% inoculum, 200 ml voor 2 kg rijst) en incubeer bij 28 ° C en 70-80% RH gedurende 14 dagen. </li><li> Oog de sporen door vloeibare extractie met 0,1% Tween-80. Voeg hiervoor de inhoud van de zak toe aan 0,1% Tween-80 (3 L per 1 kg rijst), meng het grondig, verdeel de sporen uit de vloeistof door centrifugeren en droog gedurende 2 dagen bij 37 ° C. &lt;<html> / Li&gt; <li> Als alternatief droog de tassen die rijst bevatten met de sporen en wat mycelia bij 2 ° C bij 37 ° C om het vochtgehalte (&lt;20%) te verminderen. Oog de sporen met een myco-harvester of vibro-sifter. </li></ol></li><li> Levensvatbaarheidsstudies <ol><li> Bepaal de percentage levensvatbaarheid van de geoogste sporen met behulp van verschillende methoden 15 . Bereid hiervoor de spore suspensies in 0,1% (w / v) Tween-80 en stel de telling aan op 1 × 10 3 sporen / ml. </li><li> Spread suspensions (0.1 mL) op PDA platen in triplicaat en incubeer bij 28 ° C en 70-80% RV gedurende 72 uur. </li><li> Tel de geïsoleerde kolonies handmatig en bepaal de totale levensvatbare telling voor het respectievelijke monster. </li></ol></li><li> Spore sedimentatie snelheid <ol><li> Voor een uniforme dosering is de homogene spore suspensie vereist; Bepaal de sporen sedimentatie tarieven voor Metarhizium isolaten zoals beschreven&quot;Xref&quot;&gt; 16. Controleer de sedimentatiegraden van sporen in 0,2 M ammoniumsulfaat en 0,1% Tween-80. </li><li> Pas de telling van de sporensuspensie tot ~ 7 x 7 10 sporen / ml tot een aanvankelijke absorptie van 0,6 bij 540 nm te verkrijgen. Laat de cuvetten gedurende 6 uur ongehinderd staan ​​om de sporen te regelen. </li><li> Noteer de absorptie gedurende maximaal 6 uur. Druk de sedimentatie in procent uit en bereken de tijd die nodig is voor 50% sedimentatie (ST 50 ). Herhaal het experiment driemaal met behulp van vers bereide sporen suspensies. </li></ol></li></ol> 5. Veldprestaties Studies van de mogelijkheid van de geselecteerde M. anisopliae Isoleren om H. armigera in Duivenweiden te controleren <ol><li> Wettable poederformulering van M. anisopliae M 34412 sporen <ol><li> Bereid de 2,5-5% bevochtigde poedervorming door de sporen met talk te mengen. </li><li> Stel de uiteindelijke levensvatbare telling (TVC) in op 1 x 10 12 spoRes per kg formulering. </li></ol></li><li> Veldprestaties van M. anisopliae M 34412 sporen <ol><li> Voor veldprestatie studies van het vermogen van het geselecteerde M. anisopliae isolaat om H. armigera infestatie in duivenwten te regelen, gebruik een RCBD met vier replicaties. Opmerking: hier uitgevoerd op Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E). </li><li> Gebruik twee verschillende spuitformuleringen, een olieformulering van sporen (5 x 10 12 sporen / 3 liter diesel: zonnebloemolie, 7: 3) en een waterige formulering in Tween-80 (0,1%). Spuit de olieformulering met een ultra-lage volume (ULV) spuit (70 min, 3 L / ha) de waterige formulering met een rugsakspuit (5 x 10 12 sporen, 500 L / ha). Opmerking: Hier werden de larvepopulaties één dag voor de spray en 3 en 7 dagen na de toediening van elke spray opgenomen op 5 willekeurig geselecteerde planten. De totale bevolking was tRansformed naar de vierkantswortel van n + 1 voor de statistische analyse. <ol><li> Volgens de landbouwpraktijken voor het duivenweefsel, voer de eerste spuiten tussen 10 en 15 d na het leggen van eieren en 2 keer met een interval van 14 dagen. Doe de spuiten tussen 16:00 en 18:00 uur IST. Bewaar de windrichting en gebruik indien nodig doekgordijnen om de sporen van naburige percelen te voorkomen. </li></ol></li><li> Ter vergelijking, spray de chemische insecticiden met een handcompressie knapsack spuit. </li><li> Bepaal de persistentie van het inoculum in het veld door H. armigera larven 0, 3, 5, 7 en 14 dagen na het spuiten te verzamelen. </li><li> Bewaar deze larven gedurende een periode van 14 dagen en na de dood gedurende een periode van 14 dagen, overbrengen naar een plastic flesje met vochtig filterpapier. Incubeer bij 25 ± 2 ° C en 70 ± 10% RH om mycose te waarnemen. </li><li> Bepaal de persistentie van het inoculum op de larvalpopulatie op basis van de p<html> Stijgende sterftegegevens van de larven die uit het veld zijn verzameld na het spuiten. </li><li> Evalueer de veldstudies op basis van de procentuele werkzaamheid 17 , procent podschade en procentuele opbrengst 18 . Opmerking: hier worden de data voor de parameters, zoals temperatuur, vochtigheid, windsnelheid (km / h), zonneschijn (h), regenval (mm), regenachtige dagen en verdamping (mm) Landbouwuniversiteit (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E). </li></ol></li><li> Boeren deelnemende programma <ol><li> Selecteer het aantal boeren voor de demonstratieproeven. Breng de duivenzaadzaden (BSMR - 736) samen met kunstmest aan de boeren. Opmerking: in deze studie waren er 20 boeren betrokken. Dorp: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). </li><li> Gebruik dezelfde sprayformuleringen en aantal sprays zoals in stap 5.2. </li></ol></li></ol>Tle &quot;&gt; 6. Effect op non-target organismen <ol><li> Let op het effect van mycoinsecticide spray, indien aanwezig, op de duivenweefselblaadjes. </li><li> 1 dag na elke behandeling in de onbehandelde percelen en in de percelen die behandeld worden met M. anisopliae, verzamelen de geleiderpotigen en bladbewoners . </li><li> Verzamel de geleedpotigen in de bodem binnen 24 uur na de behandeling en haal de inplantende insecten in de ochtend na het behandelen ( bijv. Ongeveer 15-18 uur na de behandeling) in de ochtend na de behandeling. </li><li> Bewaar ze individueel in cilindrische plastic dozen met een diameter van 3,5 cm en een hoogte van 4,0 cm. Controleer de insecten dagelijks voor infectie en voed ze met geschikt voedsel. </li><li> Noteer de aanwezigheid van M. anisopliae , indien helemaal, en isoleer de paddestoel. </li></ol> 7. Identificatie van kwaliteitscontroleparameters <ol><li> Controleer de levensvatbaarheid van de spore door de spore ontkieming op de PDA bij 28 ° te meten; C. </li><li> Maatregel cuticle degraderende enzymactiviteiten, zoals chitinase, chitine-deacetylase, chitosanase, protease en lipase, geproduceerd in de YPG en chitine media, zoals eerder beschreven 15 . </li><li> Bepaal de procentuele sterfte van H. armigera in een laboratorium bioassay 15 . </li><li> Gebruik moleculaire markers, zoals een PCR-RFLP patroon van chitinases ( Chit 1 , 2 en 4 ) en protease ( Pr1A ) genen, als virulentie attributen voor M. anisopliae . <ol><li> Extract het genomische DNA uit de mycelia biomassa met behulp van een DNA isolatie kit 15 . PCR-amplificeer de Chit1- en Chit2- genfragmenten met behulp van genomisch DNA als template, met primerparen Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) en Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). Voor Chit4 , gebruik het primerpaarje Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG). </li><li> Voor de amplificatie van het Pr1A-gen, gebruik het METPR2- en METPR5-primerpaar (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG). </li><li> Voer de restrictie vertering 19 van het Chit1 gen met BsaJI , BstUI en ScrFI ; Van het Chit2 gen met AluI , HpyCH4IV en HpyCH4V en van het Chit4 gen met BstUI , HaeIII en MboI . Voor de digestie van de Pr1A gen gebruikt RsaI, DdeI en Mspl 20. </li><li> Houd rekening met het limietfragmentlengte polymorfisme (RFLP) patroon op 1,5% agarosegel door elektroforese voor elk gen voor de meeste virulente stammen (&gt; 90% mortaliteit); Dit kan gebruikt worden als een virulentie marker voor de selectie van M. anisopliae . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pesticides+use+in+agriculture%3A+their+benefits+and+hazards%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards.</a> Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).</li>
<li>Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. <a target="_blank" href="http://www.indianjournals.com/ijor.aspx?target=ijor:ije&volume=77&issue=2&article=012">Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario.</a> Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).</li>
<li>Popp, J., Peto, K., Nagy, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13593-012-0105-x">Pesticide productivity and food security. A review.</a> Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).</li>
<li>van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Lenteren%2C+JC+%22Integrated+pest+and+disease+management+in+greenhouse+crops%22">Integrated pest and disease management in greenhouse crops</a>. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).</li>
<li>Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharnley%2C+AK+%22The+Mycota+IV%3A+Environmental+and+Microbial+Relationships%22">The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships</a>. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).</li>
<li>Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. <a target="_blank" href="null">Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests</a>. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).</li>
<li>Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoberts%2C+DW+%22Frontiers+in+industrial+mycology%22">Frontiers in industrial mycology</a>. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).</li>
<li>Goettel, M., Inglis, G. D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/book/9780124325555">Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology</a>. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).</li>
<li>Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1023646207455">Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae.</a> BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+TJ+%22PCR-Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR-Protocols: A guide to methods and applications</a>. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).</li>
<li>Basic Local Alignment Search Tool. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST </a> (2017).</li>
<li>Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022201175902943">Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans.</a> J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).</li>
<li>Abbott, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+computing+the+effectiveness+of+an+insecticide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Econ+Entomol%22%5BJournal%5D)">A method for computing the effectiveness of an insecticide.</a> J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).</li>
<li>Nahar, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+of+biocontrol+agents+for+the+control+of+pests+in+agriculture+using+chitin+metabolism+as+target%22">Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target</a>. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137(2004).</li>
<li>Kulkarni, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09583150802366475?journalCode=cbst20">Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea.</a> Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).</li>
<li>Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/m97-004#.WNVDdDvyuUk">Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation.</a> Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).</li>
<li>Henderson, C. F., Tilton, E. W. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/48/2/157/2205826/Tests-with-Acaricides-against-the-Brown-Wheat-Mite?redirectedFrom=fulltext">Tests with acaricides against the brow wheat mite.</a> J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).</li>
<li>Hassani, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+and+proving+of+biocontrol+methods+based+on+Bacillus+thuringiensis+and+entamopathogenic+fungi+against+the+cotton+pests+Spodoptera+littoralis%2C+Helicoverpa+armigera+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+and+Aphis+gossypii+%28Homoptera%3A+Aphididae%29%22">Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae)</a>. , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).</li>
<li>Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19682457">PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae.</a> J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).</li>
<li>Bidochka, M. J., Melzer, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11142404">Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains.</a> Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).</li>
<li>McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCoy%2C+CW+%22Handbook+of+natural+pesticides%2C+Microbial+insecticides%2C+Part+A.+Entomogenous+protozoa+and+fungi%22">Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi</a>. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).</li>
<li>Nahar, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09583150801935650">Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae).</a> Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).</li>
<li>Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).</li>
<li>Deshpande, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycopesticide+Production+by+Fermentation%3A+Potential+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges.</a> Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Tijdens de 1880&#39;s werd de eerste poging gedaan om Metarhizium te gebruiken om de scarabeker , Anisoplia austriaca, en de suikerbietcurculio, Cleonis punctiventris 21 , te beheersen . In dit protocol was een van de voor- waarden om een ​​virulente stam te isoleren, van de grond of van geïnfecteerde insecten. Inderdaad hebben andere parameters, zoals LC 50 , LT 50 en ST 50 , aanzienlijk bijgedragen aan ...

<html> Van de introductie van organische chloorpesticiden in de jaren 1940 in India, is het gebruik van pesticiden veel vouw 1 toegenomen, met gewaspestjes die jaarlijks miljarden rupees 2 kosten in termen van opbrengstverlies in de landbouwproductie. Het wijdverspreide en niet-oordeelkundige gebruik van synthetische pesticiden is een voortdurende bedreiging voor het milieu en de menselijke gezondheid 1 . Het onoordeelkundige gebruik van pesticiden leidt tot residuen in de bodem en de uitputting van natuurlijke roofdieren. Het dient ook als een krachtige selectie druk om de genetische make-up van een plaagpopulatie te veranderen, wat leidt tot de ontwikkeling van weerstand 1 . Ondanks de enorme voordelen van de groene revolutie, die hoge inputs vereiste, zoals meststoffen en pesticiden, blijven ongedierte een belangrijke biotische beperking. Een algemene schatting van de jaarlijkse gewasverliezen in India en wereldwijd bedraagt ​​USD 12 miljardEf &quot;&gt; 2 en USD 2.000 miljard 3 respectievelijk. Wanneer chemische bestrijdingsmiddelen schadelijke effecten hebben wanneer ze insectenbestrijdingen bestrijden, wordt het belangrijk om te zoeken naar alternatieve methoden die ecologisch geluid, betrouwbaarheid, economisch en duurzaam zijn. Biologische controle biedt een geschikt alternatief en omvat het gebruik van parasieten, roofdieren en microbiële pathogenen 4 . Zo zijn bijvoorbeeld schimmels een breed scala aan insectenbestrijding, waaronder lepidopteranen, hymenopteranen, coleopteranen en dipteranen, die vaak leiden tot natuurlijke epizootica. Bovendien, in tegenstelling tot andere bacteriële en virale insecten controle middelen, is de werking van insecten pathogene schimmels via contact 5 . Deze schimmels bestaan ​​uit een heterogene groep van meer dan 100 genera, waarbij ongeveer 750 soorten onder verschillende insecten worden gerapporteerd. De belangrijke schimmelpathogenen zijn: Metarhizium sp., Beauveria sp., Nomuraea rileyi, Lecanicillium lecanii en Hirsutella sp., een paar te noemen 6. M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin is de tweede meest gebruikte entomopathogene schimmel bij biocontrole. Het is bekend om meer dan 200 soorten insecten aan te vallen 7 . In deze studie worden verschillende stadia betrokken bij de kennisgebaseerde ontwikkeling van een mycopesticide met behulp van M. anisopliae gepresenteerd. Dit omvat: 1) de identificatie van een bron ( dwz bodem of mycosed insecten) voor virulente entomopathogenen, 2) entomopathogene identificatie en selectie, 3) strategieën om hun virulente natuur en effectiviteit in het laboratorium bio-analyse en in het veld te handhaven, 4 ) De kosteneffectieve formulering van infectieve propagules, 5) de ontwikkeling van unieke kwaliteitscontroleparameters voor virulente bereiding, en 6) bioprospectie en waardetoevoeging.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Hi-Media</td><td>RM666</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Ammonium sulphate&nbsp;</td><td>Thomas Baker</td><td>11645</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>DNA analyzer&nbsp;</td><td>Applied biosystem</td><td>ABI prism 3730&nbsp;&nbsp;</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>DNA islatie kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Dodine</td><td>Sigma</td><td>45466</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Gel extractie kit</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Hi-Media</td><td>GRM077</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Knapsac spuit</td><td>Kaypee</td><td>HY-16L (1004)</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Hi-Media</td><td>RM006-500G</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Polypropyleen vials&nbsp;</td><td>Laxbro</td><td>SV-50</td><td>Kunststof</td></tr><tr><td>Aardappel dextrose agar (PDA)&nbsp;</td><td>Hi-Media</td><td>M096-500G</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>SRL</td><td>28940</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Ultra lage volume spuit</td><td>Matabi</td><td>INSECDISK</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Unicorn-zakken&nbsp;</td><td>Unicorn</td><td>UP-140024-SMB</td><td>Autoclaveerbare zak voor SSF</td></tr><tr><td>Gist extract</td><td>Hi-Media</td><td>RM027-500G</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Chromas 2.1</td><td></td><td></td><td>software</td></tr></tbody></table>

ontwikkeling<em&gt; metarhizium anisopliae</em&gt; als een mycoinsecticide: van isolatie tot veldprestatie

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Een grote zorg bij het ontwikkelen van commerciële mycoinsecticiden is de vermogenssnelheid in vergelijking met die van chemische insecticiden. Daarom zijn isolatie en screening voor de selectie van een snelwerkende, zeer virulente entomopathogene schimmel belangrijke stappen. Entomopathogene schimmels, zoals Metarhizium, Beauveria en Nomurea , die optreden via contact, zijn beter geschikt dan Bacillus thuringiensis of nucleopolyhedrosisvirus (NPV), die door het insectenpest ingeënt moet worden. In het huidige werk hebben we 68 Metarhizium stammen van geïnfecteerde insecten geïsoleerd met behulp van een bodemverdunning en aas methode. De isolaten werden geïdentificeerd door de amplificatie en sequentiebepaling van het ITS1-5.8S-ITS2 en 26S rDNA gebied. De meest virulente stam van Metarhizium anisopliae werd geselecteerd op basis van de mediane dodelijke concentratie (LC 50 ) en de tijd (LT 50 ) verkregen in insecten bioassays tegen III-instar larven van Helicoverpa armigera.De massaproductie van sporen door de geselecteerde stam werd uitgevoerd met vaste-fermentatie (SSF) met gebruikmaking van rijst als substraat gedurende 14 dagen. Sporen werden geëxtraheerd uit de sporulated biomassa onder gebruikmaking van 0,1% tween-80, en verschillende formuleringen van de sporen werden bereid. Veldproeven van de formuleringen voor de controle van een H. armigera- besmetting in duivenwten werden uitgevoerd door gerandomiseerd blokontwerp. De infectie controle niveaus verkregen met olie en waterige formuleringen (respectievelijk 78,0% en 70,9%) waren beter dan de 63,4% verkregen met chemisch pesticide.

Tijdens het onderzoek werden verschillende stammen van Metarhizium, Beauveria en Nomuraea geïsoleerd door verschillende isolatiemethoden (data niet getoond) 6 , 14 Aangezien Metarhizium- stammen effectiever waren bij het beheersen van H. armigera , een vreselijke plaag in pulsen 6 , 14 , Werden verdere isolaties gericht op het isoleren van Metarhizium stammen ...

Hierbij rapporteren we de verschillende fasen die betrokken zijn bij de kennisgebaseerde ontwikkeling van een effectief mycoinsecticide, waaronder de isolatie, identificatie, screening en selectie van de &quot;best fit&quot; entomopathogene schimmel, Metarhizium anisopliae , voor de bestrijding van insectenpest in de landbouw .

Ontwikkeling<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Als een mycoinsecticide: van isolatie tot veldprestatie

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

Het ondoordachte gebruik van synthetische pesticiden vormt een voortdurende bedreiging voor het milieu en de menselijke gezondheid. Biologische bestrijding met behulp van bacteriën, virussen en schimmels is een geschikt alternatief voor de bestrijding van verschillende insectenplagen in de landbouw. In tegenstelling tot bacteriën en virussen zijn entomopathogene schimmels effectief door contact.Metarhizium-soorten behoren tot de meest effectieve insectopathogene schimmels. Het staat erom bekend meer dan 200 soorten insectenplagen aan te vallen. Wij hebben een mycoinsecticide ontwikkeld op basis van sporen van inheemse Metarhizium-isolaten.Deze video laat u de protocollen zien voor de isolatie en identificatie van lokale schimmelisolaten, een insectenbioassay om potentere stammen te screenen en te selecteren, de productie van sporen van geselecteerde Metarhizium-stammen en het protocol voor het maken van een kostenefficiënte formulering van het mycoinsecticide voor veldtoepassingen. Ook zullen de kwaliteitscontrollemaatregelen die tijdens de commerciële productie moeten worden genomen, worden toegelicht. De isolatie van entomopathogene schimmels kan via drie methoden worden uitgevoerd.Ten eerste, uit bodems. Metarhizium is een natuurlijk voorkomende schimmel in de meeste bodems. Om een grote variëteit aan isolaten te verkrijgen, worden bodems verzameld uit velden met verschillende soorten gewassen en uit geografisch sterk gescheiden regio's.Het bodemmonster wordt genomen op een diepte van vier tot zes inch onder het oppervlak. De monsters uit het veld worden verzameld in gelabelde zakken en later in het laboratorium worden 10 gram van elk monster overgebracht naar vials. Metarhizium wordt geïsoleerd via de bodemverdunningsplaatmethode.10 gram van het bodemmonster wordt overgebracht naar 90 ml steriele 0,1% Tween 80. De slurry wordt 60 minuten lang geroerd met een magnetische roerder. Ondertussen worden aliquots van 900 microliter Tween 80 klaargemaakt voor seriële verdunning.Het supernatant van de slurry wordt nu in serie verdund in de Tween 80-aliquots. Een aliquot van honderd µL van elk monster wordt uitgeplaat op het medium zoals beschreven door Keller en anderen. De platen worden drie tot zeven dagen geïncubeerd bij 28 °C.De individuele sporulerende kolonies worden later gesubcultiveerd op hetzelfde medium om zuivere culturen te verkrijgen. Om insectopathogene schimmels te isoleren, worden dode insecten uit het veld verzameld. De sporen van de gemyceliseerde karkassen worden gescheiden door deze over te brengen naar Tween 80 en vervolgens door middel van vortexen.De sporenсусpensie wordt vervolgens uitgestreken op een agarplaat. Zuivere culturen worden verkregen door verdere subcultivatie op hetzelfde medium. Om entomopathogene schimmels uit de bodem te lokken, worden rijstmoutlarven gebruikt.Vier rijstmoutlarven worden toegevoegd aan een vial met een bodemmonster van 60 gram. De vials worden geïncubeerd bij 28 graden. Deze larven trekken normaal gesproken diep de bodem in, dus de vials worden elke dag gedurende maximaal 14 dagen omgekeerd om het contact tussen de larven en de schimmelsporen in de bodem te vergemakkelijken.De dode larven worden van tijd tot tijd verwijderd en bewaard voor sporulatie in een bevochtigingsincubator. Het proces voor de isolatie van de schimmel is hetzelfde als het proces dat wordt gebruikt voor insectenkadavers. Na het verkrijgen van zuivere culturen worden de isolaten onderhouden op PDA-schuine agarplaten, en worden de moederculturen bewaard bij acht graden Celsius tot aan gebruik.Voor de identificatie van de schimmels wordt genomisch DNA geëxtraheerd uit de myceliale biomassa. Voor de identificatie van Metarhizium-isolaten worden de primers five prime, three prime, ITS1 en ITS4 gebruikt. De amplicons van de verwachte grootte worden uit de gel geëlueerd, gekwantificeerd en gesequenced.De sequenties werden vervolgens gecontroleerd met de NCBI GenBank-database voor identificatie van de isolaten op soortniveau. Bodemmonsters en dode insecten verzameld uit de districten Pune en Buldana, Maharashtra, India, leverden 68 verschillende isolaten van Metarhizium op. Hiervan werden er 58 geïsoleerd uit bodems en 10 uit insecten.55 waren Metarhizium anisopliae, acht waren Metarhizium flavoviridae en vijf waren Metarhizium robertsii. De sporen van de agarhellingen worden toegevoegd aan 10 ml Tween 80 en gevortexd. Voor de insectenbioassay wordt de sporentelling gemeten met een hemocytometer.Vervolgens wordt de concentratie aangepast naar 10⁷ sporen per ml. Sets van 30 larven in drievoud worden individueel gedurende vijf seconden gedoopt in een sporensuspensie van 10 ml van elk Metarhizium-isolaat. Voor de insectenbioassays worden larven van Helicoverpa armigera in het late tweede of vroege derde stadium gebruikt.Na de behandeling wordt elke larve overgebracht naar een steriel flesje met vochtig Whatman filterpapier nummer één en een stukje gedesinfecteerde okra als voeding. Een set van 30 larven in drievoud, behandeld met 0,1% Tween 80 in steriel gedestilleerd water, dient als controle. De larven worden bewaard tot ze dood zijn en worden tot 14 dagen gemonitord.Deze stappen werden herhaald voor alle 68 isolaten. Het sterftepercentage wordt berekend door het aantal dode en levende larven te tellen. De dode larven worden overgebracht naar steriele Petrischalen, die vochtige wattenstaafjes bevatten, en gedurende drie tot zeven dagen bewaard bij 28 °C en een relatieve vochtigheid van 70 tot 80% voor mycose en sporulatie.De gegevens over het sterftepercentage van drie experimenten zijn samengevoegd om gemiddelde waarden te verkrijgen, die vervolgens zijn gecorrigeerd met de formule van Abbott. 12 Metarhizium-isolaten die een sterfte van meer dan 90% vertoonden, werden geselecteerd om de mediane letale tijd tegen derdestadiumlarven van Helicoverpa armigera te bepalen. Op basis van de LT 50-waarden werden vijf isolaten geïdentificeerd die insecten sneller doden.De mediane letale concentraties voor de vijf geïdentificeerde isolaten werden bepaald met behulp van vier verschillende concentraties van de sporenсусpensie. Op basis van de LC 50-waarden werden drie Metarhizium-isolaten geselecteerd voor sporenproductie via fermentatie in vaste fase. Het YPD-medium wordt bereid en gesteriliseerd door autoclaveren bij 121 °C gedurende 20 minuten.Sporen van de schuinstrepen worden overgebracht naar 0,1% Tween 80. De sporensuspensies van de drie geselecteerde Metarhizium-isolaten worden toegevoegd aan YPD-medium. De kolven worden vervolgens geïncubeerd op een schudmachine.Autoclaveerbare Unicorn-zakken gevuld met twee kilogram rijst worden gedurende één nacht geweekt in één liter gedestilleerd water en vervolgens gedurende 45 minuten geautoclaveerd bij 121 graden centigrade. Solid-state fermentatie werd getest op substraten zoals rijst, sorghum, maïs en tarwe. Van de geteste substraten ondersteunde rijst de maximale sporulatie van Metarhizium-isolaten.De zakken worden geënt met 48 uur oude 10% myceliumbiomassa. Dit wordt goed gemengd en gedurende 14 dagen geïncubeerd. De sporen kunnen met verschillende methoden worden geoogst.Voor isolatie met behulp van de Mycoharvester en Vibrosifter worden de zakken met gesporeerd mycelium twee dagen gedroogd bij 37 °C om het vochtgehalte te verlagen tot minder dan 20%. Vloeistofextractie is een efficiëntere methode. De rijst met sporen wordt in grote vaten geplaatst. Er wordt 0,1% Tween 80 in de vaten gegoten en het mengsel wordt goed geroerd.Het supernatant wordt gefilterd om eventuele rijstdeeltjes te verwijderen. De sporen worden geconcentreerd en gescheiden door middel van centrifugatie. Vervolgens worden de sporen twee dagen gedroogd bij 37 °C.Deze sporen kunnen tot aan het gebruik worden bewaard bij minus 80 graden centigrade. Om de houdbaarheid tijdens de opslag te verlengen, wordt er talkum toegevoegd en met de sporen gemengd. Om effectief te zijn, moeten de sporen levensvatbaar zijn, waardoor het isolaat dat het maximale aantal levensvatbare sporen oplevert, geïdentificeerd moet worden.De sporensuspensies worden bereid in 0,1% Tween 80 en de concentratie wordt aangepast naar 10⁷ sporen per ml. 10 µL sporensuspensie wordt in drievoud op PDA-plaatjes verspreid en vervolgens geïncubeerd. Binnen 12 uur beginnen de levensvatbare sporen te kiemen.Na 12 uur worden de sporen die een kiembuis vormen microscopisch geteld. De hydrofiliteit van de sporen is belangrijk voor de hechting van de schimmel aan de insectencuticula. Een sporensuspensie in ammoniumsulfaat en Tween 80 wordt met een curette opgenomen.De andere, zonder sporen, dient als controle. De concentratie van de sporenсусpensie wordt aangepast naar ongeveer 7 tot 10^7 sporen per ml om een initiële absorbentie van 0,6 bij 540 nanometer te verkrijgen. De cuvetten worden ongeveer zes uur ongestoord gelaten zodat de sporen kunnen bezinken.De absorbentie wordt geregistreerd en de tijd die nodig is voor 50% voeding wordt berekend. Op basis van de resultaten werd één stam geselecteerd voor veldtoepassingen. De andere twee dienden als reservestammen.De veldprestaties van sporen van het geselecteerde Metarhizium-isolaat M34412 voor de bestrijding van een infestatie van Helicoverpa armigera in een kaperplantage werden onderzocht in een gerandomiseerd blokontwerp met vier herhalingen. Er zijn twee verschillende spuitformuleringen gebruikt. De formulering in 0,1% Tween 80 is gespoten met een rugspuit.Een olieformulering van sporen wordt gespoten met een ultra-laag volume spuitmachine. Het spuiten vindt plaats in de ochtend of in de avond. De eerste bespuiting wordt uitgevoerd tijdens de bloeifase en wordt nog twee keer herhaald met een interval van 14 dagen.Helicoverpa armigera worden verzameld op nul, drie, vijf, zeven en 14 dagen na het spuiten en worden bewaard in een vochtigheidskamer voor mycose. Tijdens de veldproeven voor de bestrijding van Helicoverpa armigera in kapererwten werd een effectiviteit van meer dan 70% behaald met Metarhizium anisopliae M34412. De peulschade in de met Metarhizium anisopliae behandelde percelen bleek het laagst in vergelijking met de percelen die behandeld waren met chemische pesticiden en de onbehandelde controlepercelen.De bladeren van de kapokerwt worden onderzocht op eventuele effecten van de diesel-zonnebloemolieformulering van het mycoinsecticide. Bodembewonende arthropoden en bladbewonende insecten werden verzameld uit de percelen die behandeld waren met Metarhizium anisopliae. Er werd geen schadelijk effect waargenomen bij enige niet-doelwit arthropode.De demonstratieproeven werden uitgevoerd in een dorp, doo-lally-pra-va-da, met deelname van 20 boeren. De formulering is effectief tegen andere insectenplagen zoals de vette snijworm, de gevlekte peulboorder, wolluizen, wollige bladluizen en muggen. De experimenten hebben het mogelijk gemaakt om de essentiële kwaliteitscontroleparameters bij de productie van mycoinsecticiden te identificeren.De levensvatbaarheid van sporen, gemeten als sporengerminatie, moet meer dan 90% zijn op PDA na 16 uur bij 28 °C en een relatieve vochtigheid van 70 tot 80%. De mortaliteit van Helicoverpa armigera moet meer dan 90% zijn met 10⁷ sporen in een laboratorium-bioassay. Door herhaaldelijk te subcultiveren op kunstmatig laboratoriummedium, verliest het organisme zijn virulentie.Na het kweken van de schimmel in chitine-medium gedurende 72 uur worden de activiteiten van cuticula-afbrekende enzymen zoals chitinase, chitinedeacetylase, chitosanase, protease en lipase gemeten. Deze dienen als biochemische markers voor virulentie. Vier verschillende sets van drie restrictie-enzymen werden gebruikt voor de digestie van chitinase-genen.De isolaten met een mortaliteit van meer dan 90% vertoonden het specifieke patroon voor alle drie de genen. Deze patronen vertonen een significante correlatie met de profielen van cuticula-afbrekende enzymen die extracellulair worden geproduceerd door Metarhizium-isolaten. Voor het eerst stellen wij chitinase-enzymactiviteit en het PCR-patroon van het chitinase-gen voor als virulentiemarkers.Dit kan dienen als kwaliteitsindicatoren voor productie op commerciële schaal. Om het product kosteneffectiever te maken, kunnen we myceliumbiomassa gebruiken voor de stimulatie van plantenwortels. Het kan ook worden gebruikt voor de isolatie van chitosanase voor toepassingen in de gezondheidszorg.Deze producten met toegevoegde waarde zullen dit op Metarhizium gebaseerde mycoinsecticide rendabeler maken.

development-metarhizium-anisopliae-as-mycoinsecticide-from-isolation

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Dit protocol laat twee inoculatie methoden om de schimmel entomopathogen...

Tot oprichting van Schimmel Entomopathogens als endofyten: Op weg naar Endofytische Biologische bestrijding

Hier presenteren we een protocol op basis van het meelworm (Tenebrio molitor)-aassysteem dat werd gebruikt voor het isoleren en selecteren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. Een effectieve conidia-getalformule (ECN) wordt gebruikt om een hoge stresstolerante EPF te selecteren op basis van fysiologische kenmerken voor microbiële bestrijding van plagen in het veld.

Isolatie en selectie van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters en evaluatie van schimmelvirulentie tegen insectenplagen

Entomopathogene schimmels hebben aan belang gewonnen als de biologische bestrijders van landbouwinsectenplagen. In deze studie werd de massaproductie van een voldoende aantal veerkrachtige infectieuze propagules van Zuid-Afrikaanse isolaten van zowel Metarhizium robertsii als M. pinghaense voor commerciële toepassing tegen insectenplagen met succes uitgevoerd met behulp van landbouwproducten.

Massaproductie van entomopathogene schimmels, Metarhizium robertsii en Metarhizium pinghaense, voor commerciële toepassing tegen insectenplagen

Entomopathogene schimmelkolonies worden geïsoleerd uit tropische bodemmonsters met tenebrio-aas , Galleria-aas en selectief kunstmatig medium, d.w.z. aardappeldextrose-agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide (CTC-medium).

Vergelijking van methoden voor het isoleren van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerd vrijstaand bioassaysysteem voor het evalueren van de effectiviteit van entomopathogene schimmels (EPF) tegen de mosterdluis (Lipaphis erysimi (Kalt.)), een parthenogenetisch insect. De methode schetst het gegevensverzamelingsproces tijdens experimenten met petrischaaltjes, waardoor onderzoekers consequent de virulentie van EPF kunnen meten tegen mosterdbladluizen en andere parthenogenetische insecten.

Beoordeling van bladluis effect van entomopathogene schimmels tegen parthenogenetisch insect, mosterdluis, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder en een vervangende manier om hun entomopathogene activiteiten te evalueren met behulp van een Coleoptera-modelinsect. Deze methode is efficiënt en handig voor het verkennen van entomopathogene schimmelbronnen van houtborende insectenplagen in natuurlijke bossen.

Isolatie, gedragsidentificatie en pathogeniteitsbeoordeling van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder

Lake eutrofiëring is een kwaliteit van het water kwestie wereldwijd, waardoor de noodzaak om bronnen van voedingsstoffen te identificeren en te beheersen kritisch. Laboratorium bepaling van fosfor vrijlating tarieven van boorkernen is een waardevolle aanpak voor het bepalen van de rol van interne fosfor laden en begeleiden van beslissingen van het management.

-Laboratorium bepaald Fosfor Flux van het meer van sedimenten als een interne maatregel Fosfor Laden

Hier presenteren we een uitgebreid protocol om de beschikbaarheid van organische en anorganische voedingsstoffen en de abundantie en structuur van microbiële en virale gemeenschappen in afgelegen mariene omgevingen te beoordelen.

Het ontrafelen van de Unseen Spelers in de Oceaan - A Field Guide to Water chemie en Mariene Microbiologie

Methoden worden voor de productie van biodiesel, samen met de co-isolatie van alkenones waardevolle coproducten van commerciële Isochrysis microalgen.

Experimenteel protocol voor de productie van biodiesel met Isolatie van Alkenones als coproducten van Commercial<em&gt; Isochrysis</em&gt; Algenbiomassa

Beoordeling van de geleedpotige overvloed in gewassen is van cruciaal belang voor het onderzoek naar de populatiedynamiek en de soorten interacties. Hier beschrijven we de modificatie en toepassing van een bladblazer-vac voor afzuiging bemonstering van geleedpotigen in rijst.

Wijziging en toepassing van een bladblazer-vac voor Field Sampling geleedpotigen

Leer de ontwikkeling van een mycoinsecticide op basis van Metarhizium anisopliae voor biologische plaagbestrijding in de landbouw. Deze methode toont effectiviteit tegen Helicoverpa armigera en ondersteunt duurzame landbouwpraktijken.

Ontwikkeling

Meer video's verkennen