Name: Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Leer de twin-spot MARCM-methode voor celstamlijn-analyses en genfunctiestudies in neuronen. Dit protocol labelt neuronen in twee kleuren om ontwikkeling en geboortedata te volgen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST 104-2311-B-001-034) en het Instituut voor Cellulaire en organismisch Biology, Academia Sinica, Taiwan.

1. Build tsMARCM-ready Vliegen met de juiste transgenen 11, 13 <ol><li> Genereer de originele versie van tsMARCM-ready vliegt van transgenen die worden gedragen door de individuele vliegen 11 (zie tabel 1). Gedrag standaard fly genetische kruising regelingen, die eerder zijn beschreven, door de invoering van meerdere transgenen in dezelfde fly voorraden 13. <ol><li> In één ouderlijn Monteer de transgenen van FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (de eerste reporter, mCD8 :: GFP, expressie van het transgen onder de controle van de stroomopwaartse activeringssequentie promoter, die een membraan-gebonden reporter produceert van muis CD-merker 8-eiwit gefuseerd met groen fluorescent eiwit) en UAS-rCD2RNAi (de suppressor dat de expressie van de tweede reporter afremt, RNAi tegen de expressie van rat cluster of differentiatie 2, rcd2) op de linkerarm van de 2e chromosoom. Plaats weefsel-specifieke -GAL4 driver op de X of 3e chromosoom, indien mogelijk. </li><li> In de andere ouderlijke lijn, vergadert de transgenen van FRT 40A, UAS-rCD2 :: RFP (de tweede verslaggever, rCD2 :: RFP, de andere membraan-tethered reporter bestaande uit rCD2 eiwit gefuseerd met rood fluorescerend eiwit), en UAS-GFPRNAi (de suppressor dat de expressie van mCD8 :: GFP afremt, RNAi tegen de expressie van GFP) op de linkerarm van de 2e chromosoom. Plaats heat-shock (hs) -FLP of weefsel-specificiteit FLP op de X of 3e chromosoom, indien mogelijk. </li></ol></li><li> Genereer de nieuwe versie van tsMARCM-ready vliegt van transgenen die worden gedragen door de individuele vliegen 14 (zie tabel 1). Gedrag standaard fly genetische kruising regelingen, die zijn beschreven previously, door de invoering van meerdere transgenen in dezelfde fly voorraden 13. <ol><li> In één ouderlijke lijn, vergadert de transgenen van een FRT-plaats en UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (een gecombineerde transgene van mCD8 :: GFP en de suppressor dat de expressie van rCD2 :: RFP remt) samen in dezelfde arm van de 2e of 3e chromosoom (passend paar van FRT transgenen en UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i zijn weergegeven in tabel 1). Plaats weefselspecifieke-GAL4 driver uitzondering het chromosoom van de gekozen FRT-plaats, indien mogelijk chromosomen. </li><li> In de andere ouderlijke lijn, vergadert de transgenen van een FRT-plaats en UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (de andere gecombineerde transgene van rCD2 :: RFP en de suppressor dat de expressie van mCD8 :: GFP remt) in dezelfde arm van de 2 e of 3 e chromosoom (passende paren van transgenen van FRT </em&gt; en UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi zijn aangegeven in tabel 1). Plaats hs-FLP of weefselspecifieke-FLP uitzondering van het chromosoom van de gekozen FRT-plaats, indien mogelijk chromosomen. </li></ol></li></ol> 2. Cross tsMARCM-ready Flies te genereren tsMARCM Clones in hun nageslacht <ol><li> Cross tsMARCM-ready vliegen elkaar (bv, zet 10-15 mannelijke vliegen vanaf stap 1.1.1 of 1.2.1 en 20-30 maagdelijke vrouwelijke vliegt vanaf stap 1.1.2 of 1.2.2 samen) in een fly-food flacon met verse Ambachtelijk gist plakken op de muur van de flacon. </li><li> Handhaaf de gekruiste tsMARCM ready vliegen bij 25 ° C gedurende 2 dagen om de kans op paring verbeteren voor het verzamelen van bevruchte eieren. </li><li> Vaak dragen de gekruiste tsMARCM-ready vliegen in vers gegist flesjes om te voorkomen dat verdringing (tik naar beneden de vliegen of gebruik maken van kooldioxide om de vliegen verdoven om de overdracht te vergemakkelijken, houden niet meer dan 80-100 bevruchte eieren in een 10 ml fly-food vial te veel larven te voorkomen). </li><li> Cultuur tsMARCM dieren (bijvoorbeeld bevruchte eieren, een voorbeeld van het genotype van tsMARCM dieren, zoals in figuur 3, is hs-FLP [22], w / w, UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT 40A GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A, +, +) die in de serieel overgedragen flesjes gelegd bij 25 ° C totdat zij ontwikkelen om de gewenste fasen (bijvoorbeeld embryo&#39;s, larven, of poppen). </li><li> Plaats de overgedragen flacons die tsMARCM dieren in hetzelfde ontwikkelingsstadium bevatten een 37 ° C waterbad gedurende 10, 20, 30, 40 en 50 min naar het optimale tijdstip van warmte-schok die de expressie van FLP induceert het gegenereerd moet worden tsMARCM klonen van belang. Sla deze stap over als weefsel-specificiteit FLP wordt gebruikt in de tsMARCM experiment (hs-FLP heeft de voorkeur voor neurale lineage analyses; de redenen voor deze voorkeur zijn eerder beschreven 15). OPMERKING: Herhaal stap 2.5 met behulp van de optimale tijd van heat-shock in de toekomst tsMARCM experimenten als meer tsMARCM klonen van belang worden gezocht; over het algemeen is er meer FLP expressie geïnduceerd in hs-FLP [22] in vergelijking met hs-FLP [1] met dezelfde heat-shock tijd. </li><li> De cultuur van de warmte geschokt tsMARCM dieren bij 25 ° C totdat ze de juiste ontwikkelingsstadium bereikt, en ga dan naar stap 3. </li></ol> 3. Bereid, Vlek, en Mount Fly Brains bevattende tsMARCM Clones <ol><li> Bereid pincet-bescherming gerechten. Meng deel A (30 g) en deel B (3 g) van het Silicone Elastomer kit met geactiveerde kool (0,25 g). Giet het mengsel in de juiste gerechten. </li><li> Ontleden larven, popstadium of adulte hersenen van de tsMARCM dieren 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van pincet op een forceps-bescherming schotel gezien door een dissectie microscoop. LET OP: Een protocol voor vlieg hersenen dissectie is desc geweestribed eerder 16. </li><li> Bevestig de vlieg hersenen op een glazen plaat plek met 1x PBS met 4% formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Verwerk de vlieg hersenen in dit glas plek plaat voor de rest van de stappen. </li><li> Spoel de vlieg hersenen drie maal met 1% PBT (1x PBS bevattende 1% Triton X-100) en was ze drie keer gedurende 30 min elk in 1% PBT (spoelen: verwijder PBT en nieuw PBT snel toevoegen, wassen, verwijderen PBT, voeg nieuwe PBT en incubeer de vlieg hersenen in de nieuwe PBT met behulp van een rondschudapparaat). </li><li> Incubeer de vlieg hersenen met het mengsel van primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C of 4 uur bij kamertemperatuur geroerd. Een voorbeeld van het mengsel van primaire antilichamen rat anti-CD8 antilichaam (1: 100), konijn anti-DsRed antilichaam (1: 800) en muis anti-Bruchpilot (Brp) antilichaam (1:50) in 1% PBT met 5% normaal geit serum (NGS). </li><li> Spoel de vlieg hersenen drie keer met 1% PBT, en dan was ze drie keer voor 30 minuten elk met 1% PBT. </li><li&gt; Incubeer de vlieg hersenen met het mengsel van secundaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C of 4 uur bij kamertemperatuur geroerd. Een voorbeeld van het mengsel van secundaire antilichamen geit anti-rat IgG antilichaam geconjugeerd met groene fluorescerende kleurstof (1: 800), geit anti-konijn IgG antilichaam geconjugeerd met geel-fluorescerende kleurstof (1: 800) en geit anti-muis IgG antilichaam geconjugeerd met ver-rood-fluorescerende kleurstof (1: 800) in 1% PBT met 5% NGS. </li><li> Spoel de vlieg hersenen drie keer met 1% PBT, en dan was ze drie keer voor 30 minuten elk met 1% PBT. Brengen ze op een micro dia met een anti-quenching reagens. Zet een micro dekglas op de micro dia te dekken en de bescherming van de vlieg hersenen. Sluit de randen van de micro dekglas en micro dia met behulp van duidelijke nagellak. Bewaar deze gemonteerd en afgedicht hersenen exemplaren vliegen bij 4 ° C. </li></ol> 4. Neem, Process, en analyseren Fluorescent Beelden van tsMARCM Clones <ol><li> Capture fluorescerende beelden van tsMARCM klonen frOM de monsters gemaakt in stap 3.8 met behulp van de confocale microscopie systeem van uw keuze. </li><li> Project stapels tsMARCM confocale fluorescente afbeeldingen in tweedimensionale afgevlakte beelden gebruiken met confocale microscopie gekozen systeem geleverd beeldverwerkingssoftware (zie figuur 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O en 3Q - 3T voorbeelden van afgeplatte confocale fluorescente beelden). </li><li> Tel het aantal cellen van meercellige-NB zijden van de tsMARCM klonen met een geschikte beeldverwerking software (bijvoorbeeld de functie &quot;Cell Counter&quot; in ImageJ 17, zie figuur 3E, 3J, 3O en 3T voorbeelden van de cel organen van neuronen). </li></ol>

<ol><li>Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+neural+projections+reveals+clonal+composition+of+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).</li>
<li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+development+and+organization+of+the+adult+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).</li>
<li>Goodman, C. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodman%2C+CS+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li>
<li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+requirement+of+the+USP%2FEcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li>
<li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).</li>
<li>Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+neuron+prespecification+in+the+olfactory+map+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila.</a> Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).</li>
<li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+the+Drosophila+Chinmo+BTB-zinc+finger+protein+govern+neuronal+temporal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity.</a> Cell. 127 (2), 409-422 (2006).</li>
<li>Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin-spot+MARCM+to+reveal+the+developmental+origin+and+identity+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).</li>
<li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+developmental+sequence+of+a+Drosophila+neuronal+lineage+as+revealed+by+twin-spot+MARCM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM.</a> PLoS Biol. 8 (8), (2010).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing+%3A+the+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Awasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+Drosophila+lineage-restricted+drivers+via+patterned+recombination+in+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts.</a> Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).</li>
<li>Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mosaics+for+lineage+analysis+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generating mosaics for lineage analysis in flies.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+Drosophila+lateral+antennal+lobe+neurons+reveals+notch-dependent+binary+temporal+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions.</a> PLoS Biol. 10 (11), e1001425(2012).</li>
<li>Zhan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Dscam+diversity+in+regulating+axon+guidance+in+Drosophila+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).</li>
<li>Griffin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+twin+spot+generator+for+differential+Drosophila+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis.</a> Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deployment+of+factors+regulating+temporal+fate+in+a+diverse+neuronal+lineage+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain.</a> Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Kritische stappen in het protocol Stappen 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 en 3.2 zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van goede tsMARCM resultaten. Weefsel-specifieke -GAL4 drivers die niet GAL4 in neurale voorlopers tot expressie brengen hebben de voorkeur voor de stappen 1.1.1 en 1.2.1. Vermijd overbevolking van de dieren gekweekt in de fly-food flesjes in stap 2.3. Omdat de inductie latentie, het expressieniveau van FLP upon heat-shock en de gemiddelde verdelen tijdstip van neurale v...

De hersenen, bestaande uit een groot aantal en verschillende soorten neuronen, begiftigt dieren de mogelijkheid om waar te nemen, te verwerken en te reageren op de uitdagingen van de buitenwereld. Neuronen van de volwassen Drosophila centrale hersenen zijn afgeleid van een beperkt aantal neurale stamcellen, genaamd neuroblasts (AI), tijdens de ontwikkeling 1, 2. Het grootste deel van de AI&#39;s die deelnemen aan de hersenen neurogenese in Drosophila ondergaan asymmetrische divisie zelf-vernieuwing NBs en ganglion moeder cellen (GMC&#39;s) te genereren, en de GMC ga dan via een andere ronde van de divisie twee dochter cellen die differentiëren tot neuronen 3 te produceren (Figuur 1A ). Vanwege de complexiteit van neuronale morfologie en de uitdagingen in verband met het identificeren van specifieke neuronen, een positieve mozaïek labeling technologie, mozaïek analyse met een onderdrukbare cel marker (MARCM), werd uitgevonden om het mogelijk te maken visualization van een enkel neuron of een klein deel van neuronen uit van de bevolking van de omgeving, niet-gemerkte neuronen 4. MARCM gebruikt de flippase (FLP) / FLP beeldherkenning (FRT) systeem plaatsspecifieke recombinatie tussen homologe chromosomen bemiddelen bij een scheidslijn voorlopercel die een heterozygote allel van een repressor gen, waarvan de expressie normaal remt de expressie van een reportergen 4. Na de mitotische deling, worden de recombinante chromosomen gescheiden in twee cellen, zodanig dat één cel homozygote allelen van het repressor-gen en de andere cel geen repressor gen de expressie van het in die cel (en de nakomelingen) niet langer 4 geblokkeerd. Drie klonen patronen zijn meestal te vinden in een MARCM experiment wanneer FLP stochastisch wordt geïnduceerd in NBs of GMC&#39;s: single-cell en twee-cell-GMC-klonen, die neuronale morfologie bij single-cell resolutio verbeeldenn en meercellige NB-klonen, die volledige morfologische patronen van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke NB (Figuur 1B) tonen. De MARCM techniek is op grote schaal toegepast in Drosophila neurobiologische studies, waaronder in neuronale typeaanduiding voor het reconstrueren van brain-breed bedrading netwerken, neurale afkomst analyses voor de openbaarmaking van de ontwikkelingsgeschiedenis van neuronen, fenotypische karakterisatie van genfuncties betrokken bij het lot van de cel specificatie en neuronale morfogenese en differentiatie studies 5, 6, 7, 8, 9, 10. Omdat conventionele MARCM alleen etiketten één van de twee dochtercellen (en lijnen) na de geïnduceerde mitotische recombinatie evenement wordt mogelijk nuttige informatie uit de vrijstaande kant verloren. Deze beperking verzet tegen de toepassing van de fundamentele MARCM systeem om hoge-resolutie analyse van de vele neurale geslachten die cel lot te schakelen in snel tempo of precisie analyses van gen functies in dezelfde neuronen van verschillende dieren 11, 12. Twin-spot MARCM (tsMARCM) is een geavanceerd systeem dat neuronen afkomstig uit een gemeenschappelijke voorouder met twee verschillende kleuren etiketten, waarbij de terugwinning van nuttige informatie uit beide zijden van de twee cellen mogelijk maakt, waardoor de beperking van het oorspronkelijke MARCM systeem 11 (overwinnen Figuur 2A - 2C). In het tsMARCM systeem, twee RNA interferentie (RNAi) gebaseerde dempers liggen op trans-plaatsen van homologe chromosomen in een voorlopercel en de expressie van de suppressors de expressie van hun respectieve reporters (figuur 2B) onafhankelijk remmen. Naar aanleiding van site-specific mitotische recombinatie gemedieerd door de FLP / FRT-systeem, de two RNAi-gebaseerde suppressors worden gescheiden in twee cellen om de expressie van verschillende reporters (figuur 2B) toe. Twee klonale patronen, eencellige geassocieerd met eencellige klonen en twee cel-GMC geassocieerd met meercellige NB-klonen, worden typisch gezien in een tsMARCM experiment (figuur 2C). Informatie afkomstig van de ene kant van de twee cellen kan worden gebruikt als referentie voor de andere zijde, waardoor een hoge-resolutie neurale stam analyses, zoals geboorte uit het gemerkte neuronen en fenotypische analyses van dezelfde neuronen verschillende dieren nauwkeurig onderzoek van neurale genfunctie 11, 12. Hier presenteren we een stap-voor-stap protocol beschrijft hoe een tsMARCM experiment, dat door andere laboratoria kunnen worden gebruikt om hun onderzoek van neurale ontwikkeling verbreden voeren (alsook de ontwikkeling van andere weefsels, indien van toepassing) in Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Koolstofdioxide (CO2)</td><td>Lokale leverancier</td><td>n.v.t.</td><td>Verdoven vliegen</td></tr><tr><td>CO2-pad</td><td>Lokale leverancier</td><td>n.v.t.</td><td>Sorteer, kruis en zet vliegen over</td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Uniregion Bio-Tech (of andere leveranciers)</td><td>PBS001</td><td>Dissect, spoel, was en immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Fixeer vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Spoel, was en immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Normaal geit</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>005-000-121</td><td>Immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratten anti-muis CD8-antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>MCD0800</td><td>Immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Konijn anti-DsRed-antilichaam</td><td>Clonetech</td><td>632496</td><td>Immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Muis anti-Brp-antilichaam</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Geit anti-ratten IgG-antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Geit anti-konijn IgG-antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG-antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>SlowFade gold antifade-reagens</td><td>Molecular Probes</td><td>S36936</td><td>Monteer vliegenhersenen en bescherm tegen fluorescerende quenching&nbsp;</td></tr><tr><td>PYREX 9 depressieglas stipjesplaat</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>Dissect, spoel, was en immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Sylgard 184 siliconenelastomeerkit</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Maak zwarte Sylgard-schalen om de pincetten tijdens hersendissectie te beschermen</td></tr><tr><td>Geactiveerde houtskool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-250G</td><td>Maak zwarte Sylgard-schalen</td></tr><tr><td>Dumont #5 pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>Dissect en monteer vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Micro-glijplaat</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td>Monteer vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Micro dekglas nr. 1.5</td><td>VWR International</td><td>48366-205</td><td>Monteer vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Nailpolish</td><td>Lokale leverancier</td><td>niet beschikbaar</td><td>Versiegel micro dekglas op micro glijplaten</td></tr><tr><td>Incubator&nbsp;</td><td>Kansin Instruments</td><td>LTI603</td><td>Kweek vliegen bij 25 & deg; C</td></tr><tr><td>(of andere leveranciers)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Kansin Instruments</td><td>WB212-B2</td><td>Induceer hitteschok bij vliegen bij 37 & deg; C</td></tr><tr><td>(of andere leveranciers)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitaal schudder</td><td>Kansin Instruments</td><td>OS701</td><td>Was en immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>(of andere leveranciers)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>EZ4</td><td>Sorteer, kruis en zet vliegen over; Dissect, spoel, was en immunokleuring van vliegenhersenen</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Zeiss (of andere leveranciers)</td><td>LSM 700 (of andere modellen)</td><td>Beeld tsMARCM-klonen</td></tr><tr><td>beeldverwerkingssoftware 1 (bijv., Zeiss LSM image browser)&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>niet beschikbaar</td><td>Projecteer stacks van confocale beelden</td></tr><tr><td>beeldverwerkingssoftware 2 (bijv., ImageJ)&nbsp;</td><td>niet beschikbaar</td><td>niet beschikbaar</td><td>Tel het aantal cellen van tsMARCM-klonen</td></tr></tbody></table>

cell lineage analyses en gene function studies met twin-spot marcm

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

M osaic bestudeert de analyse met een r epressible c ell m Arker (MARCM) is een positief mozaïek etikettering systeem dat op grote schaal in Drosophila neurobiologische studies heeft toegepast op ingewikkelde morfologie verbeelden en om de functie van genen in subsets van neuronen in anderszins ongemarkeerde en onverstoorbaar te manipuleren organismen. Genetische mozaïeken gegenereerd in het systeem MARCM uitgeoefend via plaatsspecifieke recombinatie tussen homologe chromosomen in delende voorlopercellen zowel gemerkt (MARCM klonen) en ongemarkeerde dochter cellen tijdens mitose. Een uitbreiding van de MARCM methode, genaamd tweeling ter plaatse MARCM (tsMARCM), label beide twee cellen afkomstig van een gemeenschappelijke voorouder met twee verschillende kleuren. Deze techniek werd ontwikkeld voor het opvragen van nuttige informatie van beide hemi-lineages inschakelen. Door uitvoerig analyseren van verschillende paren tsMARCM klonen, het tsMARCM systeem maakt hoge-resolutie neurale afkomst mapping om de exacte geboorte-orde van de gelabelde neuronen geproduceerd uit gemeenschappelijke voorlopercellen te onthullen. Bovendien is het systeem tsMARCM zich ook genfunctie studies door toe de fenotypische analyse van identieke neuronen van verschillende dieren. Hier beschrijven we hoe u de tsMARCM systeem om studies van de ontwikkeling van het zenuwstelsel in Drosophila bevorderen toe te passen.

Het tsMARCM systeem is gebruikt om neurale lineage analyses en genfunctie studies vergemakkelijkt door het ophalen van belangrijke informatie over neuronen afgeleid van gemeenschappelijke NBs. Het systeem is gebruikt om de meeste (zo niet alle) neurontypen zijn en stelt het aantal cellen per neuronale typen en gaat na geboorte-volgorde van deze neuronen 11, 12, 18 (zie de bespreking voor...

Hier presenteren we een protocol voor een mozaïek labeling techniek die de visualisatie van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke voorlopercel in twee verschillende kleuren mogelijk maakt. Dit vergemakkelijkt neurale stam analyse met de mogelijkheid van geboorte uit individuele neuronen en studeren genfunctie in dezelfde neuronen verschillende individuen.

Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Het algemene doel van dit twin-spot MARCM-protocol is het uitvoeren van celstamboomanalyses met een hoge resolutie en verbeterde studies naar genfuncties. Omdat hersenweefsel uit een groot aantal uiteenlopende neuronen bestaat, is het een uitdaging om het mechanisme te bestuderen dat ten grondslag ligt aan de manier waarop neuronen zich tijdens de ontwikkeling samenvoegen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat neuronen afkomstig van gemeenschappelijke neuronvoorlopers in twee verschillende kleuren kunnen worden gelabeld.Hiermee kan informatie over het ontstaan van individuele neuronen worden teruggehaald. Daarom kan deze techniek onderzoekers helpen om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de neurale ontwikkeling. De procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Pei-Chi Chung.Een technicus uit het laboratorium van Professor Yu. Begin met het samenbrengen van twin-spot MARCM-klare mannetjes en vrouwtjes in een vliegvoedselbuisje met verse gist in het buisje. Houd de gekruiste twin-spot MARCM-klare vliegen twee dagen lang op 25 graden Celsius om de kans op paring te vergroten voordat de bevruchte eieren worden verzameld.

cell-lineage-analyses-and-gene-function-studies-using-twin-spot-marcm

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Galaxy en David hebben zich ontwikkeld tot populaire tools die het mogelijk maken de onderzoekers zonder bioinformatica training te analyseren en RNA-Seq gegevens te interpreteren. We beschrijven een protocol voor C. elegans onderzoekers RNA-Seq experimenten toegang voeren en verwerken dataset behulp Galaxy en zinvolle biologische informatie uit het gen lijsten met behulp DAVID verkrijgen.

Transcriptoom analyse<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing gegevens via de Tuxedo Suite op de Galaxy Project

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig voor gezonde volwassen één zoogdiercellen voorbereiden druppel gebaseerde, hoge doorvoer eencellige RNA-Seq preparaten. Sequencing parameters, worden Lees uitlijning en downstream eencellige bioinformatic analyse ook geleverd.

Druppel Barcoding gebaseerde eencellige Transcriptomics van volwassen zoogdieren weefsels

Een protocol voor het uitvoeren van lijntracering en functionele genetische analyse van kandidaat-genen op een celniveau met behulp van mozaïekanalyse met dubbele markers (MADM) wordt gepresenteerd. MADM kloonanalyse biedt een kwantitatief kader om het proliferative gedrag, cellulaire output en afstammingsrelatie van individuele voorlopers en hun dochtercellen te meten.

Lineage Tracing en klonnale analyse in het ontwikkelen van cerebrale cortex met behulp van Mozaïek Analyse met dubbele markers (MADM)

Hier tonen de auteurs het nut van MULTI-seq voor fenotypering en daaropvolgende gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq bij het karakteriseren van de transcriptomische en chromatinetoegankelijkheidsprofielen in retina.

Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq

CUT&amp;RUN en zijn varianten kunnen worden gebruikt om de eiwitbezetting op chromatine te bepalen. Dit protocol beschrijft hoe de eiwitlokalisatie op chromatine kan worden bepaald met behulp van eencellige uliCUT &amp; RUN.

Single-Cell Factor Lokalisatie op Chromatine met behulp van Ultra-Low Input Cleavage Under Targets en Release met Nuclease

We hebben een soortoverschrijdende vergelijkende oncogenomics-benadering ontwikkeld met behulp van genomische analyses en functionele genomische screenings om therapeutische doelen te identificeren en te vergelijken in tumoren die ontstaan in genetisch gemanipuleerde muismodellen en het overeenkomstige menselijke tumortype.

Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren

Nauwkeurige analyse van multidimensionale microscopiegegevens vereist complexe workflows. In dit artikel wordt gedemonstreerd hoe u de software Cell-ACDC kunt gebruiken. Het maakt gebruik van state-of-the-art AI-gestuurde modellen voor segmentatie, tracking, celstamboomanalyse en kwantificering van microscopiegegevens. Cruciaal is dat het deze modellen aanvult met een innovatief raamwerk voor semi-geautomatiseerde correctie van de output van de modellen.

Analyse van multidimensionale microscopiegegevens met behulp van Cell-ACDC

Deze studie presenteert een ruimtelijk Trekker–CUT&amp;Tag multioomprotocol dat directe ruimtelijke streepjescoding van een weefselsectie combineert met enkelcel-multioomanalyse. Deze aanpak maakt ruimtelijk opgeloste enkelcelprofilering van genexpressie en de histon H3K27ac-modificatie mogelijk gelijktijdig, wat mechanistische inzichten biedt in genregulatie in de context van weefselmicroanatomie.

Ruimtelijk opgeloste, geïntegreerde single-cell multiomic profilering van het transcriptoom en epigenomische doelen in bevroren weefselsecties

Leer de twin-spot MARCM-methode voor celstamlijn-analyses en genfunctiestudies in neuronen. Dit protocol labelt neuronen in twee kleuren om ontwikkeling en geboortedata te volgen.

Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM

Meer video's verkennen