Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM
2 maart 2017
Hier presenteren we een protocol voor een mozaïek labeling techniek die de visualisatie van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke voorlopercel in twee verschillende kleuren mogelijk maakt. Dit vergemakkelijkt neurale stam analyse met de mogelijkheid van geboorte uit individuele neuronen en studeren genfunctie in dezelfde neuronen verschillende individuen.
Het algemene doel van dit twin-spot MARCM-protocol is om cel-afstammingsanalyses met hoge resolutie uit te voeren en betere studies naar genfunctie mogelijk te maken. Hersenweefsel bestaat uit een groot aantal verschillende neuronen, het is uitdagend om het mechanisme te bestuderen dat ten grondslag ligt aan hoe neuronen zich tijdens de ontwikkeling samenstellen. Het grote voordeel van deze techniek is het labelen van neuronen afkomstig van gemeenschappelijke neuronvoorlopers in twee verschillende kleuren.
Dit maakt de opname van de geboorte-informatie van individuele neuronen mogelijk. Daarom kan deze techniek onderzoekers helpen om de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan neurale ontwikkeling te onderzoeken. Het demonstreren van de procedure zal vandaag Pei-Chi Chung zijn.
Een technicus uit het laboratorium van Professor Yu. Begin met het combineren van twin-spot MARCM-klare mannetjes en vrouwtjes in een vliegvoedingsfles met verse gist in de fles. Houd de gekruiste twin-spot MARCM-klare vliegen gedurende twee dagen op 25 graden Celsius om de kans op paring te verhogen voordat je bevruchte eieren verzamelt.
Om overbevolking te voorkomen wanneer de larven uitkomen, laat de gekruiste twin-spot MARCM-klare vliegen zakken en breng ze over naar vers gegiste flesjes. Kweek de twin-spot MARCM-nakomelingen totdat ze het gewenste ontwikkelingsstadium bereiken. Hier zullen vliegen in het larvale stadium hitteschok ondergaan om flippase-expressie te induceren.
Breng de vliegflesjes gedurende 10, 20, 30, 40 en 50 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius om de optimale hitteschok voor flippase-expressie te bepalen. Om de twin-spot MARCM-klonen van belang te genereren. De timing van de hitteschok bepaalt het stadium van opruimingsgeneratie, terwijl de duur van de hitteschok bepaalt hoeveel opruimingen worden gegenereerd.
Kweek de hitte geschokte twin-spot MARCM-dieren bij 25 graden Celsius tot het gewenste ontwikkelingsstadium. Ga dan verder met kleuring en montage. Voeg PBS toe aan de beschermende schotels voor de pincetten.
En breng vervolgens de twin-spot MARCM-dieren over naar de schotels. Gebruik pincetten terwijl je door een dissectiemicroscoop kijkt om de hersenen uit de twin-spot MARCM-dieren te dissecteren. Verwijder eerst het hoofd van het lichaam van de vlieg.
Verwijder vervolgens voorzichtig de cuticula zonder de hersenen te beschadigen. Verwijder vervolgens voorzichtig de tracheeën die witte vezels lijken te zijn. Breng de hersenen over naar een glazen vlekplaat met 4% formaldehyde en PBS.
En laat het 20 minuten op kamertemperatuur staan. Begin de kleuringsprocedure door de vlieghersen drie keer met 1%PBT te spoelen. En was vervolgens drie keer met 1%PBT.
Met schudden gedurende 30 minuten elke keer. Incubeer de vlieghersen met een mengsel van primaire antilichamen gedurende de nacht bij vier graden Celsius of gedurende vier uur op kamertemperatuur. Spoel en was de vlieghersen elke keer drie keer met 1%PBT, met schudden zoals eerder.
Bewerk vervolgens de vlieghersen met een mengsel van secundaire antilichamen gedurende vier uur op kamertemperatuur of gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Na het spoelen en wassen van de hersenen zoals eerder, monteer de hersenen op een microslide met een anti-kwetsuurreagens. Plaats vervolgens een dekglaasje om de vlieghersen te bedekken en te beschermen.
Verzegeld de randen van het microdekglas en de microslide met heldere nagellak. Vang ten slotte fluorescente beelden van twin-spot MARCM-klonen van de monsters met behulp van het confocale microscopiesysteem naar keuze. Deze figuur toont resultaten van de twin-spot MARCM-klon, een VL2p antero dorsale olfactorische projectieneuronen afgeleid door de inductie van flippase.
Om mitotische recombinatie in de adPN neuro blast in het embryonale stadium te mediëren. Deze eerste diagram toont het neurogenesepatroon. In deze confocale microscoopfoto van de hersenen, zijn de VL2p adPNs in groen weergegeven en zijn geassocieerd met multicellulaire neuro blast adPNs in magenta.
Deze afbeelding toont de cellen in de laterale hoorn. De neuronale morfologie van de antennekwab is hier te zien. Deze afbeelding toont de gegevens voor DL1 adPNs.
Zoals hier te zien is, verschijnen de DL1 adPNs later in de ontwikkeling dan VL2p adPNs. Inductie van twin-spot MARCM-klonen van DC3 adPNs toont aan dat dit neurontype later in de ontwikkeling verschijnt. Deze afbeelding toont dat de twin-spot MARCM-gebeurtenis plaatsvindt in een GAL4-negatieve neuron binnen de adPN-lijn.
Eenmaal beheerst, kan deze techniek onderzoekers helpen om neurale afstamming te analyseren en verschillende markers te bieden om neuronen van neuroblastklonen te onderscheiden. Bovendien kan twin-spot MARCM homozygote mutante klonen produceren om moleculaire mechanismen te onderzoeken. In een heterozygoot genetisch achtergrond.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een twin-spot MARCM-protocol dat is ontworpen voor celstamboomanalyses met een hoge resolutie en studies naar genfuncties in neuronen. Door neuronen afkomstig uit gemeenschappelijke progenitorcellen in twee verschillende kleuren te labelen, kunnen onderzoekers de ontwikkeling en de geboortedatum van individuele neuronen effectief volgen.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Hersenweefsel bestaat uit een diverse reeks neuronen.
- Het begrijpen van de assemblage van neuronen tijdens de ontwikkeling is complex.
- Huidige technieken bieden mogelijk onvoldoende resolutie voor lineage tracing.
- Dit protocol is erop gericht deze uitdagingen aan te pakken.
Doel van de studie
- Om gedetailleerde celstamboomanalyses uit te voeren.
- Om onderzoeken naar genfunctie in neuronen te verbeteren.
- Om het onderzoek naar cellulaire en moleculaire mechanismen bij de neurale ontwikkeling te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Twin-spot MARCM-protocol voor neuronale labelling.
- Gebruik van verschillende kleurmarkers voor lineage tracing.
- Beeldvormingstechnieken met hoge resolutie.
- Analyse van neuronale ontwikkeling en genfunctie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling van neuronen vanuit gemeenschappelijke progenitoren.
- Vermogen om geboedeinformatie van individuele neuronen terug te halen.
- Verbeterd inzicht in neurale lineage en ontwikkeling.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van genfuncties in verschillende individuen.
Conclusies
- Het twin-spot MARCM-protocol is een waardevol instrument voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Het maakt gedetailleerde analyse van neuronale lineage en genfunctie mogelijk.
- Deze techniek kan ons begrip van de neurale ontwikkeling aanzienlijk bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Inzicht in de neurale lineage en genfunctie in modelorganismen biedt fundamentele inzichten voor de validatie van targets bij de ontwikkeling van neurotherapeutica. De twin-spot MARCM-techniek maakt hoogresolutie-mapping van de volgorde van neurale geboorte en fenotypische analyse van genetisch identieke neuronen tussen individuen mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Deze benadering verhoogt het voorspellend vertrouwen door ontwikkelingsmechanismen te koppelen aan functionele uitkomsten in ziekterelevante systemen.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door neuronale lineages te volgen vanuit gemeenschappelijke progenitorcellen om de genfunctie in gedefinieerde celpopulaties te beoordelen.
- Operationele waarde: Faciliteert biologische risicoreductie door fenotypische analyse van homozygote mutante klonen in heterozygote achtergronden, waardoor mechanistische ambiguïteit wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het leveren van kwantitatieve lineage-gegevens die correleren met mechanismen van neurodevelopmentale ziekten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gevalideerde, kleurgecodeerde neuronale systemen die geschikt zijn voor downstream compound screening in ziekterelevante neurale circuits.
- Operationele waarde: Garandeert assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid via induceerbare, stadiumspecifieke clonale generatie die wordt gecontroleerd door de duur van de hitte-shock.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform mogelijk over meerdere neuronale subtypen (bijv. adPN-lijnen) voor vergelijkende fenotypische screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Ondersteunt systeemmodellering van ziekten door geboortevolgorde-analyse mogelijk te maken van neuronen die betrokken zijn bij neuro-ontwikkelingsstoornissen.
- Mechanische risicoreductie: Maakt fenotypische analyse mogelijk van identieke neuronen over verschillende dieren heen, om genetische variabiliteit te onderscheiden van stochastische variabiliteit in studies naar genfuncties.
- Preklinische continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en validatie door lineage-opgeloste gegevens te leveren voor studies naar target engagement en pathway-modulatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De twin-spot MARCM-methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot preklinische mechanistische studies, in het bijzonder voor neuro-ontwikkelingsindicaties waarbij de neuronale oorsprong en connectiviteit van cruciaal belang zijn.
- Discovery-biologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways door genperturbatie te koppelen aan lineage-specifieke neuronale fenotypes.
- Screening: Levert reproduceerbare, assay-klare neuronale preparaten met kwantitatieve outputs op basis van clonale geboortetiming en marker-expressie.
- Analytica: Maakt vergelijkende analyse van neuronale morfologie en genexpressie over verschillende ontwikkelingsstadia mogelijk met behulp van tweekleurige readouts.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische validatie door lineage-afgestemde modellen te bieden voor targetmodulatie die is afgestemd op biomarkers.
- Enterprise-hergebruik: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor het genereren van gestandaardiseerde neuronale cohorten over projecten en modelsystemen heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-validatie door lineage-gerelateerde confounding in genfunctiestudies te verminderen.
- Operationele waarde: Verbeterde reproduceerbaarheid en standaardisatie via gecontroleerde clonale inductie en gestandaardiseerde kleurings- en montageprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege detectie van lineage-specifieke fenotypische effecten mogelijk te maken, waardoor biologische risico's in een later stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door mechanistische helderheid te verschaffen over neuronale targets in heterogene weefsels.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in Drosophila-genetica, clonale labeleringstechnieken en confocale microscopie voor een nauwkeurige interpretatie van de lineage.
- Afhankelijk van instrumentatie, waaronder hitte-shockapparatuur, dissectiemicroscopen en confocale beeldsystemen voor de inductie en visualisatie van klonen.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft de timing van de hitte-shock, kleuringsprotocollen en beeldparameters om clonale consistentie tussen gebruikers te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op verschillende neuronale lineages of ontwikkelingsstadia buiten het getoonde adPN-model.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de afhankelijkheid van de clonale efficiëntie van de duur van de hitte-shock en de noodzaak van optimalisatie per doellineage, zoals vermeld in het protocol.
