Een Rapid Filter Insert-gebaseerde 3D Cultuur System for Primary Prostaat Cel Differentiatie
13 februari 2017
Hier presenteren we een methode voor het opzetten van een snel in vitro systeem dat het driedimensionale kweken en de daaropvolgende luminale differentiatie van primaire prostaatepitheelcellen ondersteunt.
Het algemene doel van dit filter-insert-gebaseerde 3D-kweeksysteem voor primaire cellen afkomstig van patiënten is om een biologisch relevanter in vitro modelsysteem voor prostaatkankeronderzoek te vestigen. Door primaire menselijke cellen te gebruiken, kan deze methode helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie van de prostaat en in prostaatkanker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een relatief snelle in vitro methodologie is voor het vestigen van gedifferentieerde primaire prostaatcellen, die ook toelaat voor de snelle isolatie van biomoleculen zoals RNA, DNA en eiwitten.
Visuele demonstratie van deze methoden is cruciaal omdat de verwerking van cellen op het filter-insert voor histologie of voor RNA- en eiwitverzameling delicaat en tijdsgevoelig is. Om diffusie tussen de kamers in een biologische veiligheidskast te beperken, breng een dunne laag van 0,1%gelatine aan op de onderkant van de inserts en laat ze drogen. Herhaal deze procedure nog twee keer.
Breng vervolgens de cellen aan op de binnenkant van de met gelatine gecoate inserts en kweek ze gedurende maximaal twee weken. Na twee weken breng je de gekweekte filter-inserts direct toe op een van de geschikte downstream-toepassingen die hieronder worden beschreven. Om deze procedure te starten, aspireer PBS uit de buitenste kamer en verwijder voorzichtig PBS uit de binnenste kamer.
De gekweekte inserts kunnen kort in PBS worden bewaard totdat de toepassing klaar is om te beginnen, maar laat de membraan niet uitdrogen. Voeg vervolgens 100 microliter van 0,25%Trypsin EDTA toe aan elke binnenkamer. Incubeer ze vervolgens vijf minuten bij 37 graden Celsius.
Skraap vervolgens de cellen kort en voorzichtig op het membraanoppervlak met een pipet van 200 microliter terwijl je op en neer pipetteert. Incubeer ze vervolgens een minuut bij 37 graden Celsius. Voeg na een minuut 250 microliter geconditioneerd medium toe aan de eerste binnenkamer en pipet op en neer om het filter voorzichtig te spoelen.
Breng vervolgens de gesuspendeerde cellen over naar de aangrenzende filterkamer die dezelfde mediacondities bevat en herhaal het pipetten op en neer. Herhaal deze procedure voor elk van de inserts van een enkele conditie. Verzamel vervolgens de cellen en breng ze over naar een centrifugeerbuisje van 1,5 milliliter.
Spoel elke binnenkamer met een extra 100 tot 200 microliter geconditioneerd medium om alle resterende cellen te verzamelen en voeg ze toe aan het 1,5 milliliter centrifugeerbuisje. Draai vervolgens de cellen in een microcentrifuge bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Aspibeer daarna de supernatant en was het cellenpellet eenmaal met 1.000 microliter PBS.
Draai de cellen opnieuw in een microcentrifuge bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Aspibeer na vijf minuten het PBS en bevries het monster bij minus 80 graden Celsius voor later gebruik. Voeg in deze procedure 200 microliter guanidiniumthiocyanaat fenol chloroform of een soortgelijk extractiemiddel toe aan de binnenkamer en schud de cellen kort op het membraanoppervlak door op en neer te pipetten.
Incubeer vervolgens de cellen in het extractiemiddel gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en laat de buitenste kamer droog. Was vervolgens het filtermembraan door de extractieoplossing op en neer te pipetten. Verzamel zoveel mogelijk van het extractiemiddel door de zes-wellplaat te kantelen en resterende vloeistof te aspireren.
Let op dat het filter los kan raken van het insert. Was het losgekoppelde filtermembraan indien het is bevestigd. Verzamel vervolgens zoveel mogelijk van het extractiemiddel en volg het protocol van de fabrikant voor zuivering en herstel van DNA, RNA of eiwit.
Wees voorzichtig bij het wassen van de cellen en het filter met guanidiniumthiocyanaat, omdat overmatig schudden lage kwaliteit RNA kan opleveren. Om eiwit uit het filter-insert te isoleren, plaats je het filter-insert in de zes-wellplaat op ijs. Voeg vervolgens 10 microliter eiwitlysebuffer toe aan de binnenkamer.
Schud en schraap de cellen op het membraanoppervlak met een pipet van 20 microliter terwijl je op en neer pipetteert en vermijd het vormen van bellen in de lysebuffer. Incubeer vervolgens de zes-wellplaat met filter-inserts gedurende tien minuten op ijs. Herhaal het schrabben en spoel vervolgens het membraanoppervlak af met de lysebuffer.
Verzamel de lysaten uit de zes inserts en breng ze over naar een centrifugeerbuisje van 1,5 milliliter op ijs. Spoel vervolgens de eerste membraan met een extra 10 microliter lysebuffer en breng het over naar de volgende filter. Herhaal deze procedure voor alle inserts van een bepaalde experimentele conditie, verzamel eventueel resterend lysebufferoplossing en voeg toe aan het 1,5 milliliter buisje.
Incubeer het monster nog vijf minuten op ijs. Draai vervolgens gedurende 15 minuten op maximale snelheid bij vier graden Celsius. Wanneer het klaar is, pipet het lysate in een nieuw 1,5 millimeter buisje.
Ga vervolgens verder met de analyse van eiwitconcentratie of bewaar de lysaten bij minus 80 graden Celsius. Voeg in deze procedure 500 microliter en een milliliter van 10%NBF toe aan respectievelijk de binnen- en buitenkamer. Incubeer ze een nacht bij vier graden Celsius.
De volgende dag aspireer NBF uit de buitenkamer en voeg een milliliter HEA-verwerkingsgel toe aan een centrifugeerbuisje van 1,5 milliliter. Smelt de agarose langzaam in een magnetron met laag vermogen en herhaalde pulsen van 10 seconden tot de agarose is gesmolten. Houd de HEA in een warm bad van 37 graden Celsius om verdichting te voorkomen tot het klaar is om te gebruiken.
Verwijder vervolgens NBF uit de binnenkamer. Breng 25 microliter gesmolten HEA aan op de binnenkamer en laat de agarose twee tot vijf minuten stollen. Bevochtig vervolgens twee histologische schuimkussentjes in 10%NBF en plaats een kussentje in een inbeddingskastje.
Beschermen van de integriteit van de cellagen op het filter-insert met behulp van HistoGel is een kritische stap voor het behoud van de intacte cellagen voor histologisch snijden. Gebruik vervolgens een nr. 11 scalpel om de filter vanaf de onderkant van de plastic insert
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een op filterinserts gebaseerd 3D-kweeksysteem voor primaire prostaatcellen van patiënten, gericht op het creëren van een biologisch relevant in vitro model voor prostaatkankeronderzoek. De methode maakt de snelle vestiging van gedifferentieerde primaire prostaat-epitheelcellen en de isolatie van biomoleculen mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Prostaatkankeronderzoek
- In vitro celkweek
- Celdifferentiatie
Achtergrond
- Primaire menselijke cellen geven inzicht in de ontwikkelingsbiologie van de prostaat.
- Bestaande modellen weerspiegelen mogelijk niet nauwkeurig de biologie van prostaatkanker.
- Snelle methodologieën zijn essentieel voor tijdige onderzoek.
- Isolatie van biomoleculen is cruciaal voor verdere analyse.
Doel van studie
- Om een snel in vitro systeem te vestigen voor het kweken van primaire prostaat-epitheelcellen.
- Om luminale differentiatie van deze cellen te ondersteunen.
- Om het onderzoek naar prostaatkankermechanismen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Gebruik van filterinserts voor 3D-celkweek.
- Toepassing van gelatine om diffusie in het kweeksysteem te beperken.
- Verzameling van RNA, DNA en eiwitten uit gekweekte cellen.
- Visuele demonstraties om de verwerking van cellen te helpen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vestiging van een 3D-kweeksysteem voor primaire prostaatcellen.
- Demonstratie van snelle differentiatiecapaciteiten.
- Effectieve isolatie van biomoleculen voor downstream-toepassingen.
- Visuele methoden verbeteren het begrip van celverwerking.
Conclusies
- Het ontwikkelde systeem biedt een relevanter model voor prostaatkankeronderzoek.
- Snelle methodologieën kunnen onderzoekstijden versnellen.
- Primaire cellen zijn essentieel voor het bestuderen van prostaatbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This filter insert-based 3D culture system enables rapid differentiation of primary prostate epithelial cells, providing a biologically relevant in vitro model for prostate cancer research. By supporting luminal differentiation and biomolecule isolation within two weeks, it addresses the need for predictive preclinical systems that reduce reliance on less translatable 2D cultures. The approach enhances target validation and mechanistic de-risking in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through differentiation of normal and tumor-derived prostate cells under physiologically relevant conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining lineage commitment while inducing tissue-specific marker expression lost in 2D culture.
- Strategic Value: Improves predictive confidence in target selection by modeling luminal differentiation states associated with prostate cancer pathogenesis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream molecular analysis, including RNA, DNA, and protein isolation for biomarker and pathway studies.
- Operational Value: Enables medium- to high-throughput sample processing with standardized biomolecule extraction from filter inserts.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness for compound screening by providing differentiated cells that reflect in vivo-like states.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by using patient-derived cells that retain tissue of origin characteristics while acquiring differentiation markers.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting consistent phenotypic readouts across experimental conditions.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling mechanistic de-risking of prostate cancer targets in a primary cell context.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing and pathway clarification through differentiated primary prostate cell models, supporting lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by modeling luminal differentiation in both normal and malignant prostate epithelial cells.
- Screening: Enables assay standardization and quantitative biomolecule outputs, facilitating reliable compound evaluation in subsequent screening campaigns.
- Analytics: Provides measurable outputs including RNA, DNA, and protein isolation, allowing teams to compare molecular profiles across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through use of patient-derived cells that reflect prostate tissue biology and differentiation states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for prostate research, adaptable across normal and cancer-derived cell lines for longitudinal studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through differentiation-competent primary cell models.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized filter insert processing and timed biomolecule recovery.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing earlier insight into target biology, reducing late-stage biological risk in prostate cancer programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in a differentiated primary cell system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, 3D systems, and histological processing for optimal filter insert handling.
- Depends on access to centrifuge, microscopy, and biomolecule extraction instrumentation for RNA, DNA, and protein isolation.
- Necessitates cross-team standardization of gelatin coating, trypsinization, and fixation protocols to ensure consistency across users.
- Involves adaptation considerations when extending to other epithelial systems, as gelatin and media conditions may require optimization.
- Includes practical limitations such as the delicacy of filter membrane handling during cell recovery and histological processing, which requires careful technique to avoid layer disruption.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Establishment of the 3D Cell Culture Insert System
1:28
Processing the Filters for Pellet Banking
3:17
Processing the Filters for RNA or DNA Isolation
4:20
Processing the Filters for Protein Isolation
5:42
Processing for H&E and Immunostaining
7:42
Results: Representative Bright Field and Immunofluorescence Images of the Cells Sectioned on the Filter
8:22
Conclusion
