Name: Een Rapid Filter Insert-gebaseerde 3D Cultuur System for Primary Prostaat Cel Differentiatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer een snel 3D-kweeksysteem met filterinserts voor primaire prostaatepitheelcellen. Deze methode ondersteunt luminaire differentiatie en snelle isolatie van RNA, DNA en eiwit voor prostaatkankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door T32 (CA 9686-18) en TL1 (TL1TR001431) postdoctorale opleiding subsidie ​​awards (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), alsmede U01 PAR-12-095 (Kumar) en P30 CA051008-21 (Weiner). Monster fixatie, snijden en kleuring werd uitgevoerd in de Lombardi Comprehensive Cancer Center histologie en Tissue Shared Resource. Wij danken Richard Schlegel voor nuttige discussies. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Cancer Institute en de National Institutes of Health.

1. De vaststelling van de 3D-Cell Culture Insert System <ol><li> Plaats 2 polycarbonaat celkweek inserts in een omgekeerde oriëntatie (filter zijde naar boven) in een plaat met 6 putjes (Figuur 1A). </li><li> Een dunne laag van 0,1% gelatine in water aan de onderzijde van het inzetstuk en laten drogen (10-20 min) in een biologische veiligheidskast om steriliteit te handhaven. </li><li> Herhaal stap 1.2 twee keer voor een totaal van 3 toepassingen van 0,1% gelatine op de inzetstukken. NB: De gelatine coating limiet diffusie tussen de kamers te helpen. </li><li> Om de primaire CRC&#39;s van standaard kweekomstandigheden verzamelen, voeg 5 ml PBS aan de cultuur kolf te wassen. <ol><li> Trypsinize de cellen gebruikt (1 ml voor een T-25 en 2 ml van een T-75) 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Tik zachtjes tegen de zijkant van de kolf om te helpen bij het loskomen van de cellen. ga dan naar de trypsine reactie te stoppen en het verzamelen van de cellen door toevoeging van 5 ml compleet DMEM. </li><li> Verzamelen<html> de cellen in een 15 ml buis. Centrifugeer de buizen bij 4 ° C en 188 xg en tel behulp van een geautomatiseerde celtelinrichting of een hemocytometer. </li><li> Re-schorten 600.000 CRC&#39;s in 250 ul geconditioneerde media (CM) en toe te voegen aan de juiste richting (filter naar beneden) cultuur insert (Figuur 1B). Dit wordt aangeduid als de binnenkamer. Opmerking: CM F-media geconditioneerd door bestraalde J2 cellen en bevat 10 urn Y-27632 zoals hierboven beschreven 7, 8, 9, 11. </li></ol></li><li> Toepassen 2 ml CM aan de buitenkamer van de plaat met 6 putjes en incubeer bij 37 ° C overnacht (gedurende ten minste 18 uur). </li><li> Verwijder voorzichtig de CM op de binnenkamer met 1 mL of 200 pi pipet en voeg langzaam differentiatie medium (DM) naar de binnenkamer met een 1 ml pipet tot vol. Wees voorzichtig om niet verstoren de cellaag. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Onderhoud van de 3D-Cultures <ol><li> Controleer de culturen elke dag. Gezonde cellen verschijnen zoals in figuur 2. </li><li> Verander het GH in de buitenkamer elke dag of om de andere dag, afhankelijk van het metabolisme van de cellen. </li><li> Wanneer de media van de binnenkamer verandert van kleur (geel), verwijder voorzichtig de media op de binnenste filter kamer met een 1 ml of 200 pi pipet. </li><li> Aspireren de media in de buitenste 6 wells plaat kamer met een aspiratie tip. </li><li> Met behulp van een 1 ml pipet, langzaam toe te passen verse DM naar de binnenkamer tot de volledige. Wees niet te schrapen of anderszins verjagen de cellaag. </li><li> Vervang de media in de buitenkamer met 2 ml vers CM. </li><li> Handhaving van de culturen voor 2 weken, en vervolgens overgaan tot verwerking voor de gewenste bimoleculaire isolement. Opmerking: Elke rij in 6 wells plaat, een totaal van zes inzetstukken (Figuur 1B), worden per experiment verwerkt om voldoende cellen te verkrijgen DNA, RNA of eiwit voor analyse. </li><li> Aspiraat media in de buitenkamer en spoelen met 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Haal het papier uit de binnenste kamer met een 1 ml of 200 pi pipet en voeg 500 pi PBS. Er geen krassen of anderszins de cellen op het membraan storen. </li><li> Aspireren PBS uit de buitenkamer en verwijder PBS uit de binnenkamer met 1 mL of 200 pi pipet. Nadat de PBS is verwijderd, gaat u rechtstreeks naar de juiste toepassing hieronder beschreven. Sta niet toe dat het membraan te drogen. De cultuur kan kort worden bewaard in de PBS totdat de applicatie is klaar om te beginnen. </li></ol> 3. Verwerking van de Filters voor Pellet Banking <ol><li> Voeg 100 ul 0,25% trypsine-EDTA bij elke binnenkamer en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Kort zorgvuldig schudden / schrapen de cellen op het membraanoppervlak met 200 pi pipet terwijl op en neer pipetteren (vermijd puncTuring het membraan). Incubeer gedurende 1 min bij 37 ° C. </li><li> Voeg 250 ul CM van de eerste binnenkamer en pipet zachtjes op en neer naar het filter te spoelen. </li><li> Overdracht geresuspendeerde cellen aan de aangrenzende filterkamer die hetzelfde medium bevat en omstandigheden te herhalen en neer te pipetteren. </li><li> Herhaal deze procedure voor elk van de inzetstukken van een aandoening. Verzamelen en overdragen cellen een 1,5 ml centrifugebuis. </li><li> Spoel elk binnenste kamer met een extra 100-200 ui CM om eventuele resterende cellen te verzamelen. Voeg toe aan de 1,5 ml centrifugebuis in stap 3.5. </li><li> Spin de cellen bij 423 xg in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het supernatant en was de cel pellet eenmaal met 1000 pi PBS. </li><li> Spin opnieuw bij 423 xg in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Aspireren PBS en bevriezen bij -80 ° C voor later gebruik. </li></ol> 4. Het verwerken van de Filters voor RNA of DNA Isolation <ol&gt; <li> Voeg 200 ul van guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie en dergelijke reagens om de binnenkamer en kort schudden de cellen op het membraan oppervlak door en neer te pipetteren. </li><li> Incubeer bij de extractie reagens voor 5 min bij kamertemperatuur met de buitenkamer droog. <ol><li> Aangezien het filter kunnen dissociëren van het inzetstuk, was het ontkoppeld filtermembraan pipetteren de extractieoplossing en neer. Verzamel zoveel van de extractie reagens mogelijk door het kantelen van de plaat met 6 putjes en aspireren van eventueel resterende vloeistof. </li></ol></li><li> Volg protocol van de fabrikant voor de zuivering en terugwinning van DNA, RNA of eiwit. </li></ol> 5. Het verwerken van de Filters voor eiwit Isolation <ol><li> Plaats het filterelement in de 6 wells plaat op het ijs. Om de binnenkamer, voeg 10 ul van proteïne lysisbuffer aangevuld met 1 mM natriumfluoride (NaF), 1 mM natrium vanadaat (NIW), 100 mM dithiothreitol (DTT) en 100 pl anti-protease cocktail. </li><li> Schud / schrapen de cellen op het membraanoppervlak met 20 ul pipet tijdens en neer te pipetteren. Vermijd het genereren van bellen in de lysisbuffer. </li><li> Incubeer de 6 wells plaat met filter inzetstukken op ijs gedurende 10 min. </li><li> Herhaal schrapen en spoel het membraanoppervlak met de lysisbuffer. </li><li> Verzamel de lysaten van de inzetstukken 6 en overbrengen in een 1,5 ml centrifugebuis op ijs. </li><li> Spoel het eerste membraan met een extra 10 ul lysisbuffer en transfer naar het volgende filter. </li><li> Herhaal stap 5,6 voor inzetstukken, verzamelen alle resterende lysis bufferoplossing toevoegen 1,5 ml buis (stap 5,5). </li><li> Incubeer het monster op ijs gedurende nog 5 min. </li><li> Centrifugeren op maximale snelheid (16.873 xg in een tafelblad centrifuge) gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Pipette lysaat supernatant in een nieuwe 1,5 ml buis. </li><li> Overgaan tot de analyse van eiwitconcentratie of store lysaten bij -80 ° C. </li></ol> 6. Processing voor H &amp; E en Immuno-kleuring <ol><li> Voeg 500 ul en 1 ml 10% NBF (neutraal gebufferde formaline) aan de binnenste en buitenste kamer en laat incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Zuig het NBF van de buitenkamer en voeg 1 ml hydroxyethyl agarose (HEA) verwerken gel om een ​​1,5 ml centrifuge. Langzaam smelt de agarose in een magnetron met behulp van laag vermogen en herhaalde 10-20 s pulsen totdat de agarose wordt gesmolten. </li><li> Houd de HEA in een 37 ° C warm bad om stolling te voorkomen tot gebruik. </li><li> Verwijder de NBF uit de binnenkamer en 25 ui gesmolten HEA toepassing op de binnenkamer en laat de agarose te stollen gedurende 2-5 min. </li><li> Natte 2 foam histologie pads in 10% NBF en plaats een pad in een inbedding cassette (zie Figuur 3D). </li><li> Gebruik een # 11 scalpel blade (die een zeer scherpe, puntige fijn blad heeft) aan de filter scoren vanaf de onderzijde van het inzetstukkamer, gedeeltelijk los uit de plastic insert kamer. </li><li> Plaats een kleine hoeveelheid (100-200 ul) van NBF in een petrischaal en dompel de gedeeltelijk losgeraakt filter in de NBF (figuur 3A). </li><li> Met een # 10 scalpel blade voorzichtig drukken tegen het midden van het filter aan de binnenkant van het inzetstuk kamer, volledig los van het filter het inzetstuk vat (Figuur 3B). Als er een deel van het filter dat nog is bevestigd aan het vat, verbreken met de scalpel. </li><li> Snijd de HEA-gecoate filter in de helft met de # 10 mes scalpel (figuur 3C). </li><li> Plaats elke helft van het filter op het schuimkussen in de histologie cassette bereid in stap 6.4 (Figuur 3D). </li><li> Voeg de tweede 10% NBF doordrenkte spons om de cassette, daartussen het filter. </li><li> Snap verzegeling van de cassette, plaats in de NBF en incubeer overnacht. </li><li> Procesfilters in paraffineblokken voor snijden en kleuring alseerder 12 beschreven. </li></ol>

<ol><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li>
<li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li>
<li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li>
<li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li>
<li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li>
<li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26910887">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li>
<li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor%28s%29+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li>
<li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868(2015).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Primaire cellijnen zijn een belangrijke en zich snel ontwikkelende platform voor kankeronderzoek. De cultuur insert-gebaseerde 3D-cultuur systeem ondersteunt de differentiatie van primaire prostaat CRCs binnen twee weken termijn. De CRC filter methode vertegenwoordigt een nieuwe, medium throughput methode voor prostaatkanker onderzoek. Bestaande muis PDX merken tijdrovend en zeer duur, en veel van de PDX monsters niet in kweek, beperken onderzoeker geïnitieerde experimenten en hun nut. Bovendien, terwijl slagingspercent...

De identificatie en toepassing van kankertherapieën die op maat gemaakt kunnen individuen een hoofddoel in kankeronderzoek. Onlangs zijn er nieuwe benaderingen ontwikkeld die zorgen voor een grotere gemak bij het opzetten van primaire celculturen potentieel verschaffen leibanen van identificeren en testen gepersonaliseerde therapieën. Bijvoorbeeld, de R-spondin gebaseerde prostate organoïde benadering 1 zorgt voor driedimensionale (3D) het kweken van normale en metastatische prostaatkankercellen in commerciële extracellulaire matrix (bijvoorbeeld Matrigel), terwijl de voorwaardelijk herprogrammeren van cellen (CRC) methode ontwikkeld aan Georgetown 2, 3 maakt gebruik van meer standaard 2D kweekomstandigheden. Met name de combinatie van een Rho kinase inhibitor (Y-27632) en bestraalde J2 murine fibroblast voedingscellen tot de onbepaalde kweken van keratinocyten CRC 2. De CRC methodologieextreem robuust, met primaire cellijnen met succes en voor onbepaalde tijd gehandhaafd van de prostaat en vele andere normale en kwaadaardige epitheliale weefsels 3. Belangrijker onze CRC technologie toegestaan ​​voor de snelle identificatie van de etiologische basis voor terugkerend respiratoir papillomatose bij een patiënt die een aantal eerdere medicamenteuze behandelingen hadden gefaald. Voorts worden volgens normale en tumor afgeleide CRC, de succesvolle identificatie van een FDA goedgekeurde geneesmiddel, Vorinostat werd binnen twee weken na de initiële biopsie weefsel. De patiënt werd op vorinostat, waardoor de succesvolle behandeling van hun ziekte 4. De normale prostaat bestaat uit luminale, basale en de zeldzame neuroendocriene cellen 5. Luminale cellen vormen de kolomvormige epitheellaag van de klier en drukken de androgeenreceptor (AR), en andere luminale merkers zoals cytokeratine 8 en 18 en prostate-specifiek antigeen (PSA) 6. Omgekeerd worden basale cellen gelokaliseerd onder de luminale laag en te uiten cytokeratine 5 en p63, maar lage niveaus van de AR 5. We 7, 8, 9 en 10 anderen hebben met succes gebruik prostate CRC&#39;s in preklinische mechanistische geneesmiddelgevoeligheid onderzoeken. Echter, wanneer gekweekt onder standaard 2D weefselkweekomstandigheden deze cellen niet volledig aangrijpen AR 10 signalering. Belangrijker nog, toen onder de renale capsule van immunodeficiënte muizen geplaatst, de CRC&#39;s weer normale prostaat klier architectuur en functie aan te geven dat de prostaat CRCs behouden hun lineage betrokkenheid bij plaatsing in een tolerante omgeving. De ontwikkeling van het filterelement gebaseerde celcultuur beschreven maakt de snelle (2 weken) in vitro differentiatie van prostate CRC zoals blijkt by de verhoogde expressie van de AR en AR doelwitgenen en verlaagde p63. De filterpatronen gebruikt bevatten polycarbonaat membranen (poriegrootte 0,4 pm) die het kweken van zoogdiercellen kan ondersteunen. Het systeem, zoals ontwikkeld, maakt gebruik van normale en kwaadaardige prostaat CRC, 6 putjes en het filter inserts. Celkweekmedia J2 geconditioneerd door cellen 11 wordt in de onderste kamer en prostaatkanker differentiatie media in de bovenste kamer. De technieken die hierin beschreven ondersteunen prostaat lumen celdifferentiatie binnen een 2 week termijn, in overeenstemming met de doelstellingen van gepersonaliseerde geneeskunde. Het was ook noodzakelijk om de methoden waarmee de uitgebreide moleculaire, genetische en cellulaire profilering van de kweken te ontwikkelen. Werkwijzen voor het isoleren van DNA, RNA en eiwit uit cellen vrijgemaakt uit het filteroppervlak ontwikkeld en gestroomlijnd accurate tweede monster verwerking. Finally, de methodologie die nodig is voor het verwijderen van het filter om inbedding mogelijk te maken, snijden en voor H &amp; E, immunohistochemische en immunofluorescentie kleuring, wordt volledig beschreven.

<table><tbody><tr><td>Corning Costar Snapwell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Inserts</td><td>Millipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 Well</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin 0.1% in water</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Standard Scalpel 11 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>Fishcer Scientific</td><td>S299-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Vanadate</td><td>Fishcer Scientific</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Nutrient Mix Media</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Non-Adherent Dressing</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Sigma</td><td>SIAL0167</td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes</td><td>Crystalgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

een rapid filter insert-gebaseerde 3d cultuur system for primary prostaat cel differentiatie

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Voorwaardelijk geherprogrammeerd cellen (CRC) een duurzame werkwijze voor primaire celkweek en het vermogen om grote &quot;levende biobanken &#39;van patiënt afgeleide cellijnen te ontwikkelen. Voor veel soorten epitheliale cellen hebben verschillende driedimensionale (3D) cultuur benaderingen beschreven die een verbeterde gedifferentieerde toestand ondersteunen. Terwijl CRCs hun lineage inzet voor het weefsel waaruit ze worden geïsoleerd behouden, falen ze uit te drukken veel van de differentiatie markers in verband met het weefsel van herkomst wanneer gekweekt onder normale tweedimensionale (2D) kweekomstandigheden. De toepassing van patiënt afgeleide CRC voor prostaatkanker onderzoek te versterken, is een 3D cultuur format gedefinieerd die snel (2 weken totaal) luminale celdifferentiatie in normale en tumor-afgeleide prostaat epitheliale cellen mogelijk maakt. Hierin wordt een filterelement-gebaseerd formaat beschreven voor het kweken en differentiatie van normale en kwaadaardige prostaat CRC. A detailed beschrijving van de voor cellen en -verwerking zijn voor immunohistochemische en immunofluorescentie kleuringen worden voorzien. Gezamenlijk de 3D cultuur format beschreven, in combinatie met de primaire CRC lijnen, een belangrijk middellange doorvoer modelsysteem voor hoog- biospecimen gebaseerde prostate onderzoek.

De celkweek insert systeem is een relatief eenvoudige en snelle procedure voor het produceren van 3D-kweken prostate CRC&#39;s die luminale celdifferentiatie ondersteunt. Een schema van het systeem wordt getoond (Figuur 1A) aandacht voor de toepassing van de gelatine coating op het onderoppervlak van het filterelement. De inzetstukken zijn alleen vernietigd voor de toepassing van de gelatine. In figuur 1B de filters in de juiste richting voor het kweken....

Hier presenteren we een methode voor het opzetten van een snel in vitro systeem dat het driedimensionale kweken en de daaropvolgende luminale differentiatie van primaire prostaatepitheelcellen ondersteunt.

Een Rapid Filter Insert-gebaseerde 3D Cultuur System for Primary Prostaat Cel Differentiatie

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Het algemene doel van dit op filterinserts gebaseerde 3D-cultuursysteem voor patiëntafgeleide primaire cellen is het tot stand brengen van een biologisch relevanter in vitro modelsysteem voor prostaatkankeronderzoek. Door gebruik te maken van primaire menselijke cellen kan deze methode helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie van de prostaat en bij prostaatkanker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een relatief snelle in vitro methodologie is voor de vestiging van gedifferentieerde primaire prostaatcellen, die daarnaast de snelle isolatie van biomoleculen zoals RNA, DNA en eiwit mogelijk maakt.Een visuele demonstratie van deze methoden is essentieel, aangezien de verwerking van cellen op de filterinzet voor histologie of voor de verzameling van RNA en eiwittenละเอียด en tijdgevoelig is. Om diffusie tussen de kamers in een biologische veiligheidskabinet te beperken, brengt u een dunne laag 0,1% gelatine aan op de onderzijde van de inzetten en laat u deze drogen. Herhaal deze procedure nog twee keer.Breng vervolgens de cellen aan in de binnenkamer van de met gelatine gecoate inserts en kweek deze tot twee weken. Pas na twee weken de gekweekte filterinserts direct toe in een van de geschikte downstream-applicaties die in het vervolg worden beschreven. Begin deze procedure door de PBS uit de buitenkamer af te zuigen en de PBS voorzichtig uit de binnenkamer te verwijderen.De gekweekte inserts kunnen kortstondig in PBS worden bewaard tot de applicatie kan beginnen, maar zorg dat het membraan niet uitdroogt. Voeg vervolgens 100 µL 0,25% Trypsine EDTA toe aan elke binnenkamer. Incubeer deze daarna gedurende vijf minuten bij 37 °C.Schraap daarna kort en voorzichtig de cellen op het membraanoppervlak met een 200 µL pipet terwijl u vloeistof opzuigt en weer uitstoot. Incubeer ze vervolgens gedurende één minuut bij 37 °C. Voeg na één minuut 250 µL geconditioneerd medium toe aan de eerste binnenkamer en pipetteer dit voorzichtig op en neer om het filter te spoelen.Breng na deze overdracht de geresuspendeerde cellen over naar de aangrenzende filterkamer met dezelfde mediumcondities en herhaal het opzuigen en uitstoten met de pipet. Herhaal deze procedure voor elk van de inserts van één conditie. Verzamel vervolgens de cellen en breng ze over naar een centrifugebuis van 1,5 milliliter.Spoel elke binnenkamer met nogmaals 100 tot 200 microliter geconditioneerd medium om alle resterende cellen te verzamelen en voeg deze toe aan de centrifugebuis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de cellen vervolgens in een microcentrifuge bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Aspireer daarna het supernatant en was het celpellet één keer met 1 000 microliter PBS.Centrifugeer de cellen opnieuw in een microcentrifuge bij 4 °C gedurende vijf minuten. Aspireer na vijf minuten de PBS en vries het monster in bij -80 °C voor later gebruik. Voeg bij deze procedure 200 µL guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform of een vergelijkbaar extractiereagens toe aan de binnenkamer en agiteer de cellen op het membraanoppervlak kort door herhaaldelijk te pipetteren.Incubeer vervolgens de cellen vijf minuten bij kamertemperatuur in het extractiereagens en laat de buitenkamer droog. Was daarna het filtermembraan door de extractieoplossing met een pipet herhaaldelijk op en neer te zuigen. Verzamel zoveel mogelijk van het extractiereagens door de plaat met zes putjes te kantelen en alle resterende vloeistof af te zuigen.Let op dat het filter kan lossnijden van de insert. Was het losgekomen filtermembraan indien dit is bevestigd. Verzamel vervolgens zoveel mogelijk van het extractiereagens en volg het protocol van de fabrikant voor de zuivering en het terugwinnen van DNA, RNA of eiwit.Er moet voorzichtig worden gewerkt bij het wassen van de cellen en het filter met guanidiniumthiocyanaat, aangezien overmatige agitatie kan leiden tot RNA van slechte kwaliteit. Om eiwit uit de filterinzet te isoleren, wordt de filterinzet in de zeswellplaat op ijs geplaatst. Voeg vervolgens 10 µL protein lysis buffer toe aan de binnenkamer.Agiteer en schraap de cellen op het membraanoppervlak met een pipet van 20 µL door herhaaldelijk op en neer te pipetteren, en voorkom dat er bellen ontstaan in de lysisbuffer. Incubeer vervolgens de zeswellsplaat met filterinzetten tien minuten op ijs. Herhaal het schrapen en spoel daarna het membraanoppervlak af met de lysisbuffer.Verzamel de lysaten van de zes inserts en breng deze over naar een centrifugebuis van 1,5 milliliter op ijs. Spoel vervolgens het eerste membraan met nog eens 10 microliter lysisbuffer en breng het over naar het volgende filter. Herhaal deze procedure voor alle inserts van een gegeven experimentele conditie, verzamel alle resterende lysisbufferoplossing en voeg deze toe aan de buis van 1,5 milliliter.Incubeer het monster nog vijf minuten op ijs. Centrifugeer het vervolgens 15 minuten op maximale snelheid bij vier graden Celsius. Pipetteer na afloop het lysaat in een nieuwe 1,5 millimeter buis.Ga vervolgens over tot de analyse van de proteïneconcentratie of bewaar de lysaten bij -80 °C. Voeg bij deze procedure respectievelijk 500 µL en 1 mL 10% NBF toe aan de binnenste en buitenste kamer. Incubeer deze gedurende de nacht bij 4 °C.Aspireer de volgende dag NBF uit de buitenkamer en voeg één milliliter HEA-verwerkingsgel toe aan een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Smelt de agarose langzaam in een magnetron met een laag vermogen en herhaalde pulsen van 10 seconden totdat de agarose is gesmolten. Bewaar de HEA in een warmtebad van 37 degrees Celsius omstolling te voorkomen totdat deze klaar is voor gebruik.Verwijder vervolgens NBF uit de binnenkamer. Breng 25 µL gesmolten HEA aan in de binnenkamer en laat de agarose twee tot vijf minuten stollen. Bevochtig daarna twee histology-schuimpads in 10% NBF en plaats één pad in een inbedcassette.Het waarborgen van de integriteit van de cellagen op de filterinsert met behulp van HistoGel is een kritische stap voor het behoud van de intacte cellaag voor histologische doorsneden. Gebruik daarna een scalpel met een mesje nr. 11 om het filter vanaf de onderzijde van de plastic insertkamer in te kerven, zodat het gedeeltelijk loskomt. Plaats 100-200 µL NBF in een petrischaal en dompel het gedeeltelijk losgemaakte filter onder in de NBF.Druk met een scalpel met een mesje nr. 10 voorzichtig tegen het midden van het filter vanuit de binnenzijde van de insertkamer om het filter volledig uit de inserthuls te verwijderen. Als er nog delen van het filter aan de huls vastzitten, snij deze dan door met de scalpel. Snijd vervolgens het HEA-gecoate filter doormidden.Plaats elke helft van het filter op het schuimkussen in de voorbereide histologiecassette. Voeg vervolgens de tweede, in 10%NBF gedrenkte spons toe aan de cassette, zodat het filter ertussen komt te liggen. Sluit daarna de cassette door deze dicht te klikken.Plaats het in NBF en laat het een nacht incuberen. Deze brightfield-afbeelding toont meerlaagse celstrata bovenop het poreuze membraan. De individuele fluorescentiebeelden voor kernen, P63 en de androgeenreceptor worden getoond, evenals de samenvoeging van alle drie de fluorescentiemarkers.Ten slotte wordt een composiet-overlay van helderveld- en immunofluorescentiebeelden getoond, waarmee de lokalisatie van het fluorescentiesignaal ten opzichte van de cellen en het filter wordt vastgesteld. Hier wordt een dwarsdoorsnede van onze filterinzet getoond, vergeleken met de ductale epitheellagen van een intacte prostaat. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee weken worden uitgevoerd, waarbij de uiteindelijke isolatie van de cellen en de filterinzet of het gewenste biomolecuul minder dan 30 minuten in beslag neemt indien correct uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om altijd voorzichtig om te gaan met de filterinserts, zodat er geen schade aan de cellaag of het onderliggende filter ontstaat. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals Western blots, RNA-microarrays en proteoomanalyses, worden uitgevoerd om aanvullende vragen met betrekking tot padanalyse en kankercellen te beantwoorden. Deze techniek zal onderzoekers op het gebied van prostaatkanker helpen om de prostaatbiologie en de onderliggende mechanismen van prostaatkanker met behulp van primaire prostaatcellen beter te verkennen.Na het bekijken van deze video heeft u een uitstekend inzicht in hoe u gecultiveerde primaire prostaatcellen in dit 3D-cultuursysteem correct opzet en terugwint.

a-rapid-filter-insert-based-3d-culture-system-for-primary-prostate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In this video, we demonstrate the culturing of isolated mouse prostate epithelial cells using a matrix gel-ring based culture technique. This approach can provide complementary information about the differentiation capacity of prostate epithelial cells to form 3D glandular structures in response to genetic or pharmacological manipulation.

Prostate Organoid Assay: A Matrix Gel Ring-based Ex Vivo Culture Technique to Study the Differentiation Capacity of Prostate Epithelial Cells

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Dit protocol wordt beschreven hoe retinale pigment epitheliale cellen (RPE) uit pluripotente stamcellen te produceren. De methode gebruikt een combinatie van factoren die de groei en de kleine molecules om direct de differentiatie van stamcellen in onvolwassen RPE in veertien dagen en volwassen, functionele RPE na drie maanden.

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

Genetisch gemodificeerde muizen zijn nuttige modellen voor het onderzoek naar prostaatkanker mechanismen. Hier presenteren we een protocol om te identificeren en ontleden prostaat lobben van het urogenitaal systeem van een muis, onderscheiden van hen op basis van histologie, isoleren en cultuur de primaire prostaat cellen in vitro als spheroïden voor downstream analyses.

Identificatie en karakterisering van het histologische dissectie van de prostaat lobben van de muis voor In Vitro 3D sferoïde cultuur modellen

Hier presenteren we een protocol om begeleiden van menselijke primaire prostaat organoid behandeling dan eindpunten om te beoordelen fenotype suggereren. Zaaien, cultuur onderhoud, herstel van matrix gel, worden morfologische kwantificering, insluiten en segmenteren, FFPE segmenteren, geheel-mount kleuring en toepassing van commerciële tests beschreven.

Behandeling en evaluatie van menselijke primaire prostaat Organoid cultuur

Muis prostaat organoïden vertegenwoordigen een veelbelovende context voor het evalueren van mechanismen die differentiatie reguleren. Dit artikel beschrijft een verbeterde aanpak om prostaat organoïden vast te stellen, en introduceert methoden om (1) eiwit lysaat van organoïden te verzamelen, en (2) de organoïden voor de confocale microscopie van de hele Mount te fixeren en te vlechten.

Evaluatie van de differentiatie capaciteit van muizen prostaat epitheelcellen met behulp van Organoid cultuur

Hier gepresenteerd is een protocol om farmacologische reacties te bestuderen in prostaat epitheel organoïden. Organoïden lijken nauw in vivo biologie en even patiënt genetica, waardoor ze aantrekkelijk modelsystemen. Prostaat organoïden kunnen worden vastgesteld uit wild type prostates, genetisch gemanipuleerde muismodellen, goedaardig menselijk weefsel en gevorderde prostaatkanker.

Prostaat-Organoid culturen als hulpmiddelen om genotypes en Mutationele profielen te vertalen naar farmacologische reacties

Met behulp van humane primaire prostaat Epitheelcellen, rapporteren we een nieuwe biomarker-vrije methode van functionele karakterisering van stam-achtige cellen door een spheroid-gebaseerde label-retentie test. Een stap-voor-stap protocol wordt beschreven voor BrdU, CFSE of far Red 2D Cell labeling; driedimensionale spheroid-formatie; Label-behoud stam-achtige celidentificatie door immunocytochemie; en isolatie door FACS.

Isolatie van stam-achtige cellen uit 3-dimensionale Spheroid-culturen

Dit protocol beschrijft een methode om een menselijk bloed-hersenbarrière (BBB) in vitro model vast te stellen. De endotheelcellen en pericyten worden aan elke kant van een insertfilter (bloedcompartiment) gezaaid en astrocyten worden in de onderste put (hersencompartiment) gezaaid. Het gekarakteriseerde model werd gebruikt voor nanodeeltjestransportexperimenten.

Een drievoudig kweekcelsysteem dat de menselijke bloed-hersenbarrière modelleert

In dit artikel wordt een nieuw ontworpen 3D-geprinte insert gepresenteerd als een model van co-cultuur en gevalideerd door de studie van de paracriene intercellulaire communicatie tussen endotheelcellen en keratinocyten.

Een innovatief 3D-geprint inzetstuk dat is ontworpen om eenvoudige 2D- en 3D-celculturen mogelijk te maken

Dit protocol biedt een uitgebreide procedure om fibroblasten te isoleren, uit te breiden en onsterfelijk te maken van radicale prostatectomieën. Bovendien beschrijft het tests die zijn ontwikkeld om de functionele effecten van overspraak tussen fibroblast en tumorcellen te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van zowel behandeling met geconditioneerd medium als co-kweek.

Isolatie, kweek en karakterisering van prostaatkanker-geassocieerde fibroblasten

Leer een snel 3D-kweeksysteem met filterinserts voor primaire prostaatepitheelcellen. Deze methode ondersteunt luminaire differentiatie en snelle isolatie van RNA, DNA en eiwit voor prostaatkankeronderzoek.

Een Rapid Filter Insert-gebaseerde 3D Cultuur System for Primary Prostaat Cel Differentiatie

Meer video's verkennen