Zoogdiercelcapsulatie in Alginaatkralen Met Een Eenvoudig Verrijkt Vaartuig

Deze video beschrijft een methode om zoogdiercellen, zoals pancreaseilandjes, te immobiliseren in alginaatkralen met behulp van een eenvoudige geroerde vat. Het principe van de methode is om alginaatdruppels te genereren door water en olie emulsie, gevolgd door interne gelering van de alginaatdruppels. De eerste stap van de procedure bestaat uit het genereren van een emulsie waarin een waterige fase met alginaatcellen en calciumcarbonaat is gedispergeerd in een minerale olie organische fase.

De tweede stap is het verzurende van de emulsie door toevoeging van een in olie oplosbare zuur, zoals azijnzuur, dat snel in de waterige fase wordt verdeeld. De pH-daling leidt tot het oplossen van het calciumcarbonaat, en tot de interne gelering van de alginaatdruppels in kralen. De laatste stap bestaat uit het herstellen van de kralen uit de emulsie door toevoeging van een waterige oplossing, scheiding van de fasen door centrifugatie, gevolgd door het wassen en filteren van de kralen.

De geïmmobiliseerde cellen kunnen vervolgens in vitro worden gekweekt of gebruikt voor transplantatie. De methode die we beschreven hebben, is een alternatief voor het gebruik van op spuitmond gebaseerde celapplicators om alginaatkralen te genereren. Dit is afgeleid van een methode voor enzym- en microbiële cel immobilisatie, voor het eerst gerapporteerd door Poncelet en anderen in 1992.

De toepassing die ons het meest interesseert, is alginaat-incapsulatie als middel om getransplanteerde cellen immunote isoleren, om zo de behoefte aan anti-afstotingsmedicijnen te verminderen of zelfs te elimineren. De belangrijkste voordelen van het emulsie-gebaseerde proces ten opzichte van op spuitmond gebaseerde apparaten zijn de schaalbaarheid en de robuustheid. Aangezien de druppels bijna gelijktijdig worden gegenereerd, kunnen zeer grote hoeveelheden kralen worden geproduceerd in zeer korte tijdsperioden, van zowel zeer verdunde of zeer geconcentreerde alginaatoplossingen.

Bovendien is het proces zeer robuust en niet vatbaar voor storingen, en zelfs in aanwezigheid van deeltjes die spuitmonden kunnen verstoppen, en ten slotte is de procesapparatuur redelijk eenvoudig en dus toegankelijk, zeer relatief laag geprijsd voor de meeste laboratoria. De belangrijkste verwerkingsstappen zijn emulgeren om de alginaatdruppels te vormen, en acidificeren om de interne calciumbron vrij te maken. De druppelgrootte wordt voornamelijk beïnvloed door de ontwerp van de roerder, de roersnelheid en de duur van de roering.

De mechanische eigenschappen van de kralen en de overleving van de cellen worden beïnvloed door de mate en duur van acidificering. In deze video demonstreren we een methode die wordt gebruikt om cellen in 5% alginaatkralen te incapsularen voor transplantatie. Deze parameters vereisen waarschijnlijk optimalisatie voor andere mogelijke toepassingen.

Om 5% alginaatkralen te genereren die een half en half mengsel bevatten van LVM en MVG alginaten, weegt u 583 milligram LVM en 583 milligram MVG alginezuurpoeder af. Plaats 20 milliliter procesbuffer op een magnetische roerplaat. Voor transplantatietoepassingen gebruiken we een 10 millimolair HEPES-buffer met 170 millimolair natriumchloride op pH 7,4.

Voeg geleidelijk het alginezuurpoeder toe aan de oplossing. Laat de oplossing 's nachts roeren op lage snelheid. Indien nodig, bevestig de kolf aan de roerplaat.

De volgende dag, als het alginaat niet volledig is opgelost, bevestig de pot aan een roterende mixer en blijf 's nachts mengen bij 37 graden Celsius. Zodra het alginaat volledig is opgelost, steriliseer de oplossing door 30 minuten te autoclaven. Laat de temperatuur onder de 50 graden Celsius vallen voordat u de autoclaaf opent.

Bereid de calciumcarbonaatsuspensie voor door één gram calciumcarbonaat toe te voegen aan 20 milliliter procesbuffer. Autoclaveer de calciumcarbonaatsuspensie en het geroerde vat dat wordt gebruikt voor het emulsieproces. Verwijder vóór gebruik alle sporen van gecondenseerd water uit het vat.

Onmiddellijk vóór het emulsieproces, los 44 microliter ijsaftige azijnzuur op in 11 milliliter mineraal olie geplaatst in een 50 milliliter conische buis. Een veelgemaakte fout is onvolledige oplossing van de azijnzuur, vermijd pipetten van hoeveelheden kleiner dan 10 microliter, en zorg ervoor dat het zuur volledig is opgelost door herhaald voortdraaien. Laat alle oplossingen kamertemperatuur bereiken voordat u doorgaat met cel-incapsulatie.

Plaats 10 milliliter mineraal olie in de spinner fles en begin met roeren op 250 RPM. Als er gebruik wordt gemaakt van aanhechtende cellen zoals beta-tc3 cellen, probeer de cellen te trypsiniseren. Beëindig de reactie door toevoeging van compleet medium en neem een monster voor celtelling.

Bepaal de celconcentratie handmatig of met een geautomatiseerde celteller. Centrifugeer de cellen gedurende zeven minuten bij 300 g en suspendeer vervolgens het celpallet in compleet medium. Herhaal de centrifugeerstap en suspendeer vervolgens de cellen in het juiste volume compleet medium om 10 en een half keer de gewenste uiteindelijke concentratie in de kralen te verkrijgen.

Breng 9,9 milliliter alginaatoplossing over in een buis met platte bodem, voeg vervolgens 1,1 milliliter van de celvoorraad toe en 550 microliter van de calciumcarbonaatsuspensie. Meng de alginaat, calciumcarbonaat en celsuspensie door licht voortdraaien. Breng onmiddellijk 10,5 milliliter van deze mengsel over in het roerende olie met behulp van een spuit.

Verhoog de roersnelheid en start vervolgens de timer. Om de roersnelheid te bepalen, moet eerst een standaardcurve worden gegenereerd die de kraalgrootte relateert aan de roersnelheid. Na 12 minuten voegt u 10 milliliter van de olie en azijnzuuroplossing toe om de emulsie te acidificeren, het calcium uit het carbonaat vrij te maken en geklonterde kralen te verkrijgen.

Laat acht minuten voor deze interne geleringsstap. Merk de kleurverandering op van de geëmulgeerde druppels die de phenol red pH-indicator bevatten. Verlaag de roersnelheid tot 400 RPM, neutraliseer het zuur door toevoeging van 40 milliliter procesbuffer gemengd met 1