Bereiding van Giant blaasjes inkapselen Microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie

Het algemene doel van deze centrifugatiemethode voor water-in-olie emulsie is om gemakkelijk een dunne laag gigantische vesikel te bereiden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van de synthetische biologie, zoals het creëren van een kunstmatige cel op basis van een gigantische vesikel. Om met deze procedure te beginnen, bereid een 25 millimolair stockoplossing van DOPC en een 0,2 millimolair stockoplossing van Texas Red DHPE in chloroform voor.

Vorm vervolgens een lipidenfilm op de binnenoppervlakte van een glasvial van vijf milliliter door een mengsel van de DOPC en Texas Red DHPE stockoplossingen te laten verdampen onder stromend stikstofgas. Na het incuberen van de film onder verlaagde druk gedurende de nacht, voeg je een milliliter vloeibare paraffine toe aan de vial. Wikkel de vial in aluminiumfolie en incubeer het mengsel gedurende de nacht bij 80 graden Celsius.

In een gedekte microbuis met een inhoud van 1,5 milliliter meng je 237,5 microliters van een micrometer niet-fluorescerende microsferen en 12,5 microliters van een micrometer fluorescerende microsferen. Voeg nu 64 milligram sucrose toe, gevolgd door 125 microliters van een molaaire Tris gebufferde oplossing en 875 microliters gedeïoniseerd water aan de microbuis. Vortex het mengsel gedurende 30 seconden en soniceer het gedurende 10 minuten.

Na de bereiding van 10 milliliter van een Tris gebufferde oplossing, plaats je een milliliter in een gedekte microbuis met een inhoud van 1,5 milliliter. Nadat de oplossing is gevortext en gesoniceerd, meng je een milliliter van de olieoplossing met 300 microliters van de binnenste waterige oplossing in een microbuis met een inhoud van 1,5 milliliter. Emulgeer de twee componenten in de microbuis door een mechanisch homogenisator te gebruiken die werkt op 10.000 tpm gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.

Vervolgens plaats je voorzichtig 300 microliters van de water-in-olie emulsie op het oppervlak van één milliliter van de buitenste waterige oplossing bij vier graden Celsius in een gedekte microbuis met een inhoud van 1,5 milliliter. Direct na het afkoelen van de microbuis gedurende 10 minuten centrifugeer je het mengsel bij 18.000 keer G gedurende 30 minuten. Wanneer je klaar bent, verkrijg je de geprecipiteerde gigantische vesikelen of GV's door de bodem van de microbuis met een priem te doorboren en een druppel in een gesteriliseerde microbuis met een inhoud van 1,5 milliliter te verzamelen.

Plaats een zelfklevende incubatiekamer voor NC twee polymerasekettingreactie en hybridisatie op een microscoopdekje. Gebruik een micropipet om 25 microliters van de verdunde geprecipiteerde GV's op het specimengebied af te zetten en plaats onmiddellijk een dekje van 0,15 millimeter dik bovenop de incubatiekamer. Na het opnemen van microscoopbeelden van de vesikelen, voer je fluorescentiemicroscopie uit door eerst UFBNA en UFMCHE fluorescentiespiegeleenheden in de microscoop te plaatsen.

Pas vervolgens de eenheden aan met excitatiefilters en emissiefilters voor de analyse. De belangrijkste determinant voor het succes van de water-in-olie methode is dat de soortelijk gewicht van de binnenste waterige oplossing groter moet zijn dan die van de buitenste waterige oplossing, zodat de GV's tijdens de centrifugatie zullen sedimenteren. Differentiële interferentiemicroscopie en fluorescentiemicroscopie van de GV's zonder microsferen en met microsferen bevestigden dat GV's met lage lamellariteit werden gevormd.

Van de 160 GV's die verkregen werden, bevatten 55 een gecapsuleerde microsfeer en 105 waren leeg, wat een verhouding van 34% encapsulatie oplevert. Het volumefractie van microsferen in de GV's werd geschat op ongeveer 11 plus min drie volumeprocent en de nauwkeurigheid van de berekende volumefractie was 10 tot 30%. De encapsulatie van andere materialen in 100 mol% DOPC GV's met behulp van dezelfde buitenste waterige oplossing en hetzelfde protocol was succesvol, zoals aangetoond door differentiële interferentiemicroscopie en fluorescentiemicroscopie. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals flowcytometrie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de verduidelijking van de gemodelleerde cel.

Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je gigantische vesikelen kunt bereiden met gecapsuleerde materialen.