Name: Bereiding van Giant blaasjes inkapselen Microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Leer hoe je reuzenblaasjes bereidt met een water-in-olie emulsie centrifugatiemethode voor synthetische biologie. Deze techniek maakt kunstmatige celmodellen met geëncapsuleerde materialen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Tomoko Yamaguchi voor het tekenen van de schematische afbeelding in figuur 1. Deze studie werd ondersteund door de Okazaki ORION Project van de Okazaki Institute for Integrative Bioscience van theNational Institutes of Natuurwetenschappen (NINS); door de Astrobiologie Center Project (geen AB281010.) van NINS; door een Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek inzake innovatieve Areas (Dynamische bestellen van biomoleculaire systemen voor de creatie van geïntegreerde functies) van de Japan Society voor de Bevordering van de Wetenschap (JSPS) (geen 25.102.008.); door een Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (KK, geen 15K17850.) uit JSPS; andby een Grant-in-Steun voor onderzoek Activity Start-Up (naar YN, nr. 15H06653) uit JSPS. Extra steun werd verleend door een subsidie ​​van de Noguchi Institute, een subsidie ​​van de Kao Stichting voor de Kunsten en Wetenschappen, en een subsidie ​​van de Kurita Water en Milieu Foundation.

1. Bereiding van GVS door de W / O emulsie centrifugatiemethode <ol><li> Bereid een voorraadoplossing van 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC, 25 mM) en een voorraadoplossing van Texas Red 1,2-dihexadecanoyl- sn glycero-3-fosfoethanolamine, triëthylammoniumzout (Texas Red DHPE, 0,20 mM) in chloroform en bewaar de voorraadoplossingen bij -20 ° C. </li><li> Bereid een olieoplossing. <ol><li> Vorm een ​​lipide film op het binnenoppervlak van een 5 ml glazen flesje door het verdampen van een mengsel van de DOPC voorraadoplossing (51,0 pl en Texas rood DHPE voorraadoplossing (19,2 ui) onder stromend stikstofgas. </li><li> Incubeer de film onder verminderde druk gedurende de nacht en voeg 1,0 ml vloeibare paraffine (0,86-0,89 g / cm 3) aan het flesje. Wikkel de flacon in aluminiumfolie en incubeer het op 80 ° CO / N in rust. De eindconcentraties van DOPC en Texas rood DHPE zijn 1,3 en 3,8 x 10-3 mMRespectievelijk, en de DOPC: Texas rood DHPE molverhouding 100: 0,3. </li></ol></li><li> Bereid de binnenste waterige dispersie. <ol><li> In 1,5 ml microbuisjes deksel, meng 237,5 ul van een dispersie van 1,0 urn niet-fluorescerende microbolletjes (2,5 vol%) en 12,5 ui van een dispersie van 1,0 urn fluorescente microsferen (2,5 vol%); dit komt overeen met een 95: 5 (v / v) verhouding van niet-fluorescerende fluorescerende microbolletjes. </li><li> Voeg 64 mg sucrose, gevolgd door 125 pl Tris-gebufferde oplossing (TBS, 1 M) en 875 pl gedeïoniseerd water. Het eindvolume fractie van microsferen is 0,5 vol% en de eindconcentraties Tris-HCl (pH 7,5) en sucrose zijn 0,1 en 0,15 M, respectievelijk. </li><li> Vortex de microbuis gedurende 30 seconden en vervolgens ultrasone trillingen het voor 10 min. </li></ol></li><li> Bereid de buitenste waterige oplossing. <ol><li> Na bereiding van 10 ml Tris-gebufferde oplossing (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M glucose) in dezelfde werkwijze als inwendige waterige media plaats 1 ml van de oplossing in een 1,5 ml microbuisjes deksel. Vortex de microbuis gedurende 30 seconden en vervolgens ultrasone trillingen het voor 10 min. </li></ol></li><li> Bereid een w / o emulsie die microsferen. <ol><li> Meng 1 ml van de olie-oplossing (vloeibare paraffine bevattende DOPC en Texas rood DHPE) met 300 ul van de binnenste waterige oplossing in een 1,5 ml microbuisjes. </li><li> Emulgeren de twee componenten in de microbuis met een mechanische homogenisator (een roerinrichting met schoepen die draaien met hoge snelheid) bedreven bij 10.000 rpm gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Neerslaan van het GVS. <ol><li> Voorzichtig laag 300 pl van de w / o-emulsie op het bovenoppervlak van 1 ml van de buitenste waterige oplossing bij 4 ° C in een 1,5 ml microbuisjes deksel. Koel het microbuis gedurende 10 min bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Verzamel de GVS. <ol><li> Onmiddellijk na het koelen van de microbuis,Centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 30 min. Haal de neergeslagen GVS door het doorboren van de bodem van de microbuis met een punaise en verzamelen van een druppel in een gesteriliseerde microbuis van 1,5 ml. </li><li> Verdun de neergeslagen GV druppeltje 10-100-voudig in volume met de buitenste waterige oplossing als de verkregen GVS worden verkregen in hoeveelheden die groot genoeg zijn om observatie bemoeilijken. </li></ol></li></ol> 2. Microscopie Observation van GVS <ol><li> Bereid microscopie exemplaar. <ol><li> Plaats een hechtmiddel incubatiekamer in situ polymeraseketenreactie en hybridisatie (kamerafmeting 9 mm x 9 mm x 0,3 mm dik) bovenop een microscoop dekglaasje. </li><li> Met behulp van een micropipet, aanbetaling van 25 ul van de verdunde neergeslagen GVS op het monster gebied en meteen plaats nog een dekking van glas (ongeveer 0,15 mm dik) op de top van de incubatie kamer. </li></ol></li><li> Record differentiële interferentie contrast microscopie beelden van de GVS. <ol><li> Neem microscopiebeelden van de vesicles met een microscoop (10X, 20X en 40X doelstellingen) met een 12V100WHAL-L halogeenlamp. </li></ol></li><li> Gedrag fluorescentiemicroscopie observaties. <ol><li> Plaats U-FBNA en U-FMCHE fluorescentie-mirror-eenheden in de microscoop. Monteer de units met 470-495 nm en 565-585 nm excitatie filters, respectievelijk, en met emissie-filters die 510-550 nm en 600-690 nm licht te zenden, respectievelijk. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuisi%2C+PL+%22The+emergence+of+life%3A+from+chemical+origins+to+synthetic+biology%22">The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology</a>. , Cambridge University Press. (2006).</li>
<li>Luisi, P. L., Stano, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuisi%2C+PL+%22The+minimal+cell%3A+the+biophysics+of+cell+compartment+and+the+origin+of+cell%22">The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasmussen%2C+S+%22Protocells%3A+Bridging+nonliving+and+living+matter%22">Protocells: Bridging nonliving and living matter</a>. , The MIT Press. (2008).</li>
<li>Luisi, P. L., Walde, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuisi%2C+PL+%22Giant+vesicles%3A+perspectives+in+supramolecular+chemistry%22">Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry</a>. , Wiley-Interscience. (2000).</li>
<li>Kita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+genetic+information+with+self-encoded+replicase+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes.</a> Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).</li>
<li>Nomura, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+within+cell-sized+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene expression within cell-sized lipid vesicles.</a> Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).</li>
<li>Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+in+liposome%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction in liposome.</a> Chem Biol. 2 (10), 677-682 (1995).</li>
<li>Shohda, K., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/sm/c0sm01463j#!divAbstract">Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle.</a> Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).</li>
<li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).</li>
<li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recursive+vesicle-based+model+protocell+with+a+primitive+model+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle.</a> Nat Comm. 6, 8352(2015).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles%3A+preparations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles: preparations and applications.</a> Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Reeves, J. P., Dowben, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+properties+of+thin-walled+phospholipid+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles.</a> J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).</li>
<li>Needham, D., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanical+properties+of+giant+lipid+%28DMPC%29+vesicle+bilayers+from+20+%C2%B0C+below+to+10+%C2%B0C+above+the+liquid+crystal-crystalline+phase+transition+at+24+%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C.</a> Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).</li>
<li>Oku, N., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alkali+metal+chlorides+on+formation+of+giant+liposomes+by+freezing+and+thawing+and+by+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis.</a> Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/1986/DC/dc9868100303#!divAbstract">Liposome electroformation.</a> Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F3-798-50724-4_62">Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields.</a> New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).</li>
<li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja074029f">Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow.</a> J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).</li>
<li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li>
<li>Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding%3A+obvious+but+underappreciated%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding: obvious but underappreciated.</a> Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).</li>
<li>Ellis, R. J., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v425/n6953/full/425027a.html">Cell biology: join the crowd.</a> Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la026100v">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/100/19/10718.abstract">Engineering asymmetric vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+analysis+of+structural+properties+of+giant+liposomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry.</a> Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).</li>
<li>Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+lamellarity+of+giant+liposomes+prepared+by+the+inverted+emulsion+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method.</a> Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).</li>
<li>Cabré, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+division+proteins+FtsZ+and+ZipA+induce+vesicle+shrinkage+and+cell+membrane+invagination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination.</a> J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).</li>
<li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li>
<li>Hayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+morphological+control+of+tubulin-encapsulating+giant+liposomes+by+hydrostatic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure.</a> Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).</li>
<li>Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+fusion+and+budding+of+giant+phospholipid+vesicles+containing+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).</li>
<li>Natsume, Y., Toyota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetrical+polyhedral+configuration+of+giant+vesicles+induced+by+orderly+array+of+encapsulated+colloidal+particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles.</a> PLOS ONE. 11 (1), e0146683(2016).</li>
<li>Natsume, Y., Toyota, T. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/303780392_Appearance_of_Crystalline_Pattern_for_Colloidal_Particles_Encapsulated_in_Giant_Vesicles_-Direct_Cross-sectional_Observation_of_Ordered_and_Disordered_Phases-">Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases.</a> Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
<li>Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evolution+of+%CE%B1-hemolysin+using+a+liposome+display%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).</li>
<li>Whittenton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+asymmetric+liposomal+nanoparticles+for+encapsulation+of+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides.</a> Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).</li>
<li>Natsume, Y., Toyota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles+containing+microspheres+with+high+volume+fraction+prepared+by+water-in-oil+emulsion+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation.</a> Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).</li>
<li>Pontani, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+inside+giant+unilamellar+vesicles+analyzed+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry.</a> Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).</li>
<li>Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+display+for+in+vitro+selection+and+evolution+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoco%22%5BJournal%5D)">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).</li>
<li>Hamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+asymmetric+cell-sized+lipid+vesicles+from+lipid-coated+water-in-oil+microdroplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets.</a> J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).</li>
<li>Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+liposome-encapsulated+plasmid+DNA+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery.</a> Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+tracking+of+a+minimum+gene+expression+system+reconstituted+in+giant+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes.</a> ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).</li>
<li>Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+reconstitution+of+a+membrane+protein+in+a+giant+unilamellar+vesicle%3A+experimental+verification+with+the+potassium+channel+KcsA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA.</a> J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).</li>
<li>Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+micrometer-sized+artificial+objects+into+live+cells%3A+a+method+for+cell-giant+unilamellar+vesicle+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion.</a> PLOS ONE. 9 (9), e106853(2014).</li>
<li>Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s00354-012-0121-z">Molecular robotics: a new paradigm for artifacts.</a> New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).</li>
<li>Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+robots+with+sensors+and+intelligence%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular robots with sensors and intelligence.</a> Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

<html> Het soortelijk gewicht van de binnenste waterige dispersiemedium en de buitenste waterige oplossing moet zorgvuldig worden gekozen. Voor de w / o-emulsie te precipiteren in de buitenste waterige oplossing tijdens het centrifugeren, moet de dichtheid van de binnenste waterige dispersiemedium groter dan die van de buitenste waterige oplossing. We hebben geprobeerd om GVS behulp binnenste en buitenste oplossingen zonder suiker bereiden, maar we geen GvS verkregen onder deze omstandigheden, omdat de binnenste waterige oplossing niet voldoende massa om de interferentie tussen de twee fasen oversteken hadden. Als er een grote osmotisch drukverschil tussen de twee oplossingen, GvS die neerslaan in de buitenste waterige oplossing kan krimpen of scheuren. Daarom moet de osmotische druk binnen en buiten de GVS gelijk zijn. Hiervoor gebruikten we sucrose als een opgeloste stof in de binnenste waterige dispersie en glucose als opgeloste stof in de buitenste waterige oplossing; beide suikers waren bij dezelfde concentratie. zowel zoutss = &quot;xref&quot;&gt; 22 en suiker 23, 35, 38 zijn gebruikt voor dergelijke doeleinden, maar suiker wordt gewoonlijk toegepast omdat het minder toxisch en beter oplosbaar dan zout. Als echter te veel suiker wordt toegevoegd, de GVS in contact kan komen met de bodem van het dekglas en bezwijken komen. Er zijn verscheidene strategieën voor dit vermijden. Een strategie is het soortelijk gewicht tussen de binnenste en buitenste waterige oplossingen voor de GVS neerslaan onder milde omstandigheden verminderen; in het bijzonder kan de bovenstaande vloeistof van de dispersie neergeslagen GV worden uitgewisseld met een oplossing die identiek is aan de binnenste waterige oplossing de mogelijkheid van vesiculaire scheuren verminderen door hechting aan het dekglas als gevolg van het drijfvermogen. Een andere strategie is om beide dekglazen vooraf te bekleden met een dunne lipide film 29. Een goede voorbereiding en incubatie van de emulsie wordenbelangrijk. We gebruikten vloeibare paraffine om de olie te bereiden. Minerale olie 26, 31, dodecaan 21, 33 en squalaan 33, 39 worden ook vaak gebruikt als oplosmiddel olie. Omdat deze materialen verschillen in dichtheid, viscositeit en oppervlaktespanning, verschillende aantallen blaasjes vormen, zelfs wanneer dezelfde centrifugeeromstandigheden gebruikt 33. Om de vesicles met de beoogde eigenschappen te verkrijgen, is het noodzakelijk om de soortelijke gewichten en viscositeiten van de binnenste en buitenste waterige oplossingen en de centrifugale acceleration.For bereiding van de oliefase te optimaliseren, moet incubatie plaatsvinden bij hoge temperatuur en in een droge milieu zoals een incubator of een dehydrator. In deze studie hebben we de vloeibare paraffine tot 80 ° C verwarmd om de lipide molecules.In toevoeging volledig op te lossen, moet de emulsiealleen bereid als nodig en moet onmiddellijk gecentrifugeerd omdat het onstabiel net nadat het is bereid en de w / o druppels gemakkelijk samensmelten met elkaar. De emulsie kan in grote hoeveelheden worden bereid door sonificatie, vortexen of tikken. Het gebruik van een homogenisator zorgt voor een snelle bereiding van grote hoeveelheden emulsie en gemakkelijker emulgeren in olie met een hoge viscositeit. Het is ook belangrijk dat de emulsie lagen op de buitenste waterige oplossing voorzichtig en snel en vervolgens gekoeld bij 4 ° C. De tijd tussen emulgering en centrifugeren verkorten, kan de olie-buitenste waterige oplosmiddelsysteem worden voorgekoeld alvorens de emulsie is gelaagd op, en het gehele systeem kan dan worden gecentrifugeerd immediately.If de witte troebeling sneller of langzamer dan normaal, de mechanische homogenisator moet grondig worden gespoeld om schoonmaakmiddelen te verwijderen. Bovendien, voor emulgeren, de olie oplossing, binnenste waterige oplossing en emulgator moet r zijneturned tot kamertemperatuur. Juiste centrifugaalversnelling is ook belangrijk. Door centrifugeren bij 18.000 x g, konden we GVS bereiden met een inwendige materiaal ingekapseld in een hoge concentratie. Wanneer het inkapselen van verschillende materialen vereist, is het beter om de centrifugale versnelling verminderen. Zo werd een actine montagesysteem inkapselen zeven verbindingen bereikt door centrifugatie bij minder dan 350 g x 35. In gevallen waarin centrifugeren ongewenst is, kan GVS worden verkregen door de suikerconcentratie of door precipiteren van het emulsie onder invloed van zijn eigen gewicht 38, 40, 41. De hierin gerapporteerde methode heeft twee belangrijke beperkingen. Een daarvan is dat oliemoleculen (paraffine, in dit geval) kan worden opgelost in het GV membraan, zoals door de Weit is opgemerktZ-groep 21. Wanneer insertie van een membraaneiwit in de GV membraan gewenst is, moet het effect van gelijktijdig bestaande olie- moleculen op het eiwit beschouwd. De andere beperking is de variatie van volumefractie. In deze studie hebben we schattingen zijn de fracties van microsferen in het GVS varieerde 4-30 vol%; de volumegehalten niet identiek aan de volumefractie van de binnenste waterige oplossing gebruikt voor GV bereiding. Hoewel we konden microsferen in het GVS kapselen in een volumefractie hoog genoeg voor microscopie observatie, is deze methode niet geschikt voor de bereiding van GVS met een gelijkmatige verdeling volumefractie. Vermeld is dat de verdeling van microsferen volumedelen verandert tijdens het centrifugeren 34. De w / o-emulsie centrifugatiemethode wordt gewoonlijk gebruikt voor de vorming van GVS met ingekapselde materialen. Echter slechts weinig rapporten beschreven de preparatie van GVS inkapselen microschaal materialen 34, 42. Onlangs hebben moleculaire robots die een ingekapselde DNA-apparaat of een moleculair systeem zo ontworpen 43, 44. GVS met compartimenten zijn de eerste keuze voor dit soort toepassingen; Daarom kunnen technieken, zoals de onze, die kunnen worden gebruikt voor het inkapselen van magnetische microsferen en microsferen met verschillende oppervlakte functionalisering verwachting bruikbaar 44 zijn.

<html> De constructieve, of synthetische biologie aanpak is een fascinerende weg voor het verkennen van de grens tussen levende en niet-levende materie. Omdat de cel het minimum vereist apparaat voor het leven zoals we dat nog verscheidene onderzoekers hebben geprobeerd om kunstmatige cellen uit eenvoudige, goed begrepen chemische construct zodat verschijnselen die bij zo&#39;n kunstmatige cellen worden onderzocht, met als uiteindelijk doel het ophelderen de oorsprong van het leven en het bestuderen van de basisfuncties van levende cellen 1, 2, 3. Vooral blaasjes 4, waarbij bolvormige microcompartments van amfifiele moleculen zijn en kunnen biologische moleculen zoals eiwitten 5, 6 en DNA 7, 8, 9 kapselen,lass = &quot;xref&quot;&gt; 10, zijn vaak gebruikt als model van biologische membranen. Vesicles kunnen worden gekwalificeerd als kleine (gedefinieerd als een diameter van &lt;100 nm), groot (diameter &lt;1 urn) of grote (diameter&gt; 1 pm). Giant blaasjes (GVS) zijn uitgebreid bestudeerd, omdat ze zijn vergelijkbaar met levende cellen in grootte, vorm en structuur. Door de grootte van GVS kunnen morfologische veranderingen in GV membranen gemakkelijk worden waargenomen in real time onder een optische microscoop. Verschillende werkwijzen voor het bereiden GvS gemeld 11, inclusief de werkwijze hydratatie 12, 13, de vries-dooi methode 14, de werkwijze electroformation 15, 16, en de werkwijze fluïdeapparaat 17, 18. Echter, inkapselen eiwitten en andere Macromolecules in GVS bij hoge concentraties door middel van deze methoden is moeilijk. In het bijzonder is het uiterst moeilijk om biologisch materiaal in voldoende hoeveelheid (20-30 vol%) inkapselen de drukke omgeving in de cellen 19, 20 nabootsen. Vormen GVS direct, Weitz en medewerkers werd een water-in-olie (w / o) emulsie centrifugatiemethode 21, 22. Deze werkwijze heeft vijf belangrijke kenmerken. Ten eerste omdat GVS bereid volgens deze werkwijze hebben een lage lamellarity 23, 24, het membraan zo dun dat ze gemakkelijk kunnen worden vervormd. GV membraan deformatie geïnduceerd door FtsZ (een bacteriële celdeling eiwit), tubuline, en andere macromoleculen is onderzocht 25, 26, 27, 28, en we waarnamen polyhe<html> dron-achtige vervorming van GV membranen geïnduceerd door inkapseling van microsferen 29, 30. Ten tweede kan membraaneiwitten in de vesiculaire membraan door deze werkwijze ingevoegd zij het met moeite 31. Bijvoorbeeld, de Yomo groep gebruikt deze methode om de in vitro synthese en porievormende activiteit van het membraaneiwit α-hemolysine 32 bestuderen. Ten derde is het mogelijk om asymmetrische GVS waarbij de lipide bestanddelen van de binnenste en buitenste blaadjes zijn verschillende 22 genereren. Bijvoorbeeld Whittenton et al. gegenereerde asymmetrische GVS met kationische lipiden in het binnenste leaflet negatief geladen polynucleotiden kapselen en neutrale lipiden op de buitenste laag van toxiciteit en niet-specifieke cellulaire opname 33 verminderen. Ten vierde kan de concentratie en de volumefractie van stoffen in het GVS relatief hoogs = &quot;xref&quot;&gt; 28, 34. Ten vijfde kunnen meerdere soorten materiaal worden ingekapseld 35. Bijvoorbeeld Nishimura et al. ingekapseld een in vitro transcriptie-translatie systeem in GVS en gebruikt het systeem om groen fluorescerend eiwit (GFP) kenbaar te maken binnen het GVS 36. Deze vijf eigenschappen maken w / o-emulsie centrifugeren een onmisbare methode voor het genereren van cel nabootsen GVS. In eerder werk GVS gegenereerd door centrifugatie werden verzameld door middel van een injectiespuit met een lange 16 G roestvrijstalen naald met een aantal van de uiteindelijke waterige oplossing 22. In de handen van onervaren technici, kan dit inningsmethode gemakkelijk leiden tot verontreiniging van de GV enkele van de olie. In deze studie hebben we de w / o-emulsie centrifugatieprotocol ontwikkeld door Yomo groep 23, 37,waarbij neergeslagen GVS worden verzameld door een gat in de bodem van de centrifugebuis waarin ze bereid geopend. We bereidden GVS inkapselen 1,0 gm microsferen, die in omvang intracellulaire organellen. Het gebruik van microsferen liet ons toe om de concentratie te schatten door het berekenen van het volume fractie. Oprichting van een methode voor de bereiding van GVS in welke materialen dicht zijn verpakt is een belangrijke stap voor het creëren van kunstmatige cellen. Om het nut van onze protocol van verschillende soorten binnenkant materialen bevestigen hebben we aangetoond dat GFP en een kleine wateroplosbaar fluorescent molecuul (uranine) kan worden vastgelegd in het GVS.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Vesiculaire membraanmolecule</td></tr><tr><td>Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine, triethylammoniumzout (Texas Red DHPE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7,5)</td><td>Nippon Gene Co.</td><td>318-90225</td><td>Pufferoplossing</td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>049-31165</td><td>Voor buitenste wateroplossing</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>196-00015</td><td>Voor binnenste wateroplossing</td></tr><tr><td>Polybead carboxylaat microsferen 1,0 &micro;m</td><td>Polysciences</td><td>08226-15</td><td>Niet-fluorescent, 2R = 1,0 &micro;m</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG carboxylaat microsferen 1,0 &micro;m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td>Fluorescent, 2R = 1,0 &micro;m</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG carboxylaat microsferen 0,10 &micro;m</td><td>Polysciences</td><td>16662-10</td><td>Fluorescent, 2R = 0,10 &micro;m</td></tr><tr><td>Fluoresceïne natriumzout (uranine)</td><td>Sigma Aldrich Japan</td><td>F6377-100G</td><td></td></tr><tr><td>GFP-standaard (recombinant)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MB-0752</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>APPARATUUR:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5427R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5409000233</td><td>Centrifuge rotor: FA-45-48-11</td></tr><tr><td>Physcotron</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-310EIII</td><td>Handige microhomogenisator</td></tr><tr><td>Generatoras</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-4</td><td>Homogenisatorbevestiging</td></tr><tr><td>Frame-Seal incubatiekamers voor in situ PCR en hybridisatie</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>SLF0201</td><td>Hybridisatiekamervolume: 25 &micro;L Kamorgrootte: 9 &times; 9 &times; 0,3 mm</td></tr><tr><td>Frame-Seal incubatiekamers voor in situ PCR en hybridisatie</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>SLF0601</td><td>Hybridisatiekamervolume: 65 &micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Kamorgrootte: 15 &times; 15 &times; 0,3 mm</td></tr><tr><td>Microman E</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td>Pipet voor stroperige vloeistof. We hebben vloeibare paraffine gemeten met behulp hiervan.</td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Olympus Co.</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Spiegeleenheid</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FBNA</td><td>Excitatiever: 470 - 495 nm Emissiefilter: 510 - 550 nm</td></tr><tr><td>Spiegeleenheid</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FMCHE</td><td>Excitatiever: 565 - 585 nm Emissiefilter: 600 - 690 nm</td></tr></tbody></table>

bereiding van giant blaasjes inkapselen microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

De constructieve biologie en de synthetische biologie benadering van het creëren van kunstmatig leven hebben betrekking op de bottom-up assemblage van biologische of niet-biologische materialen. Dergelijke benaderingen hebben veel aandacht gekregen in het onderzoek op de grens tussen levende en niet-levende materie en zijn gebruikt om kunstmatige cellen te bouwen in de afgelopen twee decennia. In het bijzonder, Giant Vesicles (GVS) vaak gebruikt als kunstmatige celmembranen. In dit artikel beschrijven we de voorbereiding van de GVS inkapselen zeer verpakt microbolletjes als een model van cellen met zeer gecondenseerde biomoleculen. De GVS werden bereid door middel van een eenvoudige water-in-olie-emulsie centrifugatiemethode. Specifiek werd een homogenisator gebruikt om een ​​waterige oplossing die het materiaal in te kapselen en een olie die opgelost fosfolipiden emulgeren en de verkregen emulsie werd voorzichtig op het oppervlak van een waterige oplossing gelaagd. Het gelaagde systeem werd vervolgens gecentrifugeerd to het genereren van het GVS. Deze krachtige methode werd gebruikt om materialen van kleine moleculen tot microbolletjes kapselen.

De w / o-emulsie centrifugatiemethode fotografisch en schematisch weergegeven in figuur 1. De schematische afbeelding in figuur 1 blijkt dat de belangrijkste determinant van het succes van deze werkwijze is dat het soortelijk gewicht van de binnenste waterige oplossing groter is dan die van de buitenste waterige oplossing moet zijn, zodat het GVS neerslaat tijdens het centrifugeren. Daarnaast is de vorming van een lipide monolaag op de w / o-interface vereist dat het systeem gekoeld gedurende 10 minuten nadat de emulsie is gelaagd op de buitenste waterige oplossing. Omdat het GVS vorm van overdracht van emulsiedruppeltjes in de w / o-interface, moet de osmotische druk in de binnenste en buitenste waterige lagen dezelfde zijn. Als een controle experiment hebben we ook bereid GvS die geen microbolletjes met behulp van de werkwijze getoond in figuur 1 en stap 1,3, behalve dat de binnenste waterige oplossingbereid zonder microsferen. Verzameling van het neergeslagen GVS na centrifugeren wordt getoond in figuur 2. Naast de semi fase bij de bodem van de microbuis, zagen we een witte, troebele tussenfase in de buitenste waterige oplossing (figuur 2a). Deze tussenfase was rijk aan combinaties van microsferen en olie, terwijl de onderste fase het GVS opgenomen. Dus na het doorboren van de bodem van de microbuis met een punaise (figuur 2b), verzameld we alleen de eerste druppel (figuur 2c), die enorme hoeveelheden GVS bevatte. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat er niet meer dan twee druppels worden verzameld; bijkomende druppels kunnen combinaties van microsferen en lipiden, wat zal resulteren in een lagere dichtheid van GVS bevatten. De verkregen vesiculaire dispersie vaak bevatte ingekapselde materialen buiten het GVS, omdat de GVS often breuk tijdens het centrifugeren. Alleen GVS verkrijgen sorteren een sorteer- werkwijze zoals dialyse, gelfiltratie of fluorescentie geactiveerde cel worden gekozen vanwege de afmetingen van het inkapselende materiaal. Indien het voor het doel waarvoor het neergeslagen GVS worden gebruikt, kunnen zij worden verdund met de buitenste waterige oplossing. In sommige gevallen, de tussenfase uitgebreid tot de onderkant van de buis, wat suggereert dat vesicles die gevormd werden bij elkaar gehouden door de olie. We verkregen differentiële interferentie microscopie en fluorescentie microscopie beelden van de GVS zonder microbolletjes (figuur 3a, 3b) en microsferen (figuur 3c -3 f). In overeenstemming met eerdere rapporten 23, 37, GVS met een lage lamellarity werden gevormd door ons protocol. Lipiden geconjugeerd met Texas Red DHPE, die rood FLUORES uitzendtcentie werd gebruikt, zodat de vorming van vesicles rechtstreeks door visualisatie van het dunne membraan kan worden bevestigd. Van de 160 GvS dat we verkregen, 55 microsferen ingekapseld en 105 leeg waren, waardoor een verhouding van inkapseling van 34%. We bepaalden de volumefractie (φ, vol%) van microsferen in het GVS met behulp van de volgende werkwijze. Omdat elke GV bevat tientallen tot enkele honderden microsferen, het tellen van alle microsferen onder een optische microscoop is een uitdaging. Daarom gemengd we de niet-fluorescerende 1,0 urn microbolvormen met een kleine hoeveelheid fluorescerende microbolletjes, die met de hand onder de fluorescentiemicroscoop geteld. Het aantal (N) van ingekapselde microsferen werd berekend door het aantal (n) van handmatig getelde fluorescerende microbolletjes met 20 te vermenigvuldigen (gebaseerd op de oorspronkelijke 95: 5 [v / v] verhouding van niet-fluorescerende fluorescerende microbolletjes). De waarde van66; Vervolgens werd geschat op 100 Nv / V, waarbij v het volume van de microsferen en V het volume van de afzonderlijke GV. Merk op dat de schatting van N uit n ontstaat telfouten en deze fouten moet rekening worden gehouden bij de berekening φ. De waarde van φ werd geschat uit N, die rechtstreeks werd berekend als 20 n, en dit op zijn beurt geleid tot de waarschijnlijkheid dat cp nauwkeurig vertegenwoordigt de werkelijke waarde &lt;50%. In feite, N fluctueert tot op zekere hoogte rond 20 n, dus we moeten beschouwen als 20 (n ± i), waarbij i is de fout in n. We schatten i zodat een kans van n ± i kon meer dan 50% verkregen op basis van een Poisson distributie. We schatten i, die op zijn beurt lieten berekenen 20 (n ± i) en waarden van66; dat opgenomen telfouten voor GvS met diameters van 10 en 15 urn (tabel 1). Volgens deze werkwijze werd de volumefractie van microsferen in het GV figuur 3c ongeveer 11 ± 3 vol% te zijn. De nauwkeurigheid van de berekende volumefractie was 10-30%. Onze resultaten tonen aan dat we met succes ingekapseld 1 urn microbolvormen in GVS op een hoog volume fractie. We waren ook in staat om andere materialen in te kapselen in 100 mol% DOPC GVS met dezelfde buitenste waterige oplossing en hetzelfde protocol (Figuur 4). Specifiek GVS bevattende 0,1 gm microsferen werden bereid uit een Tris-gebufferde oplossing die 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M sucrose en 0,5 vol% fluorescerende microbolletjes met behulp van het protocol beschreven voor GVS bevattende 1,0 gm microsferen ( Figuur 4a). Naar aanleiding van het protocol beschreven above, DOPC GVS bevattende GFP (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sucrose en 100 ug / ml GFP Figuur 4b) en GVS bevattende uranine (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sucrose, en 30 uM uranine Figuur 4c) werden ook bereid. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> n </td><td> N </td><td> φ (10-um diameter) </td><td> φ (15-um diameter) </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 60 ± 20 </td><td> 6,0 ± 2,0 </td><td> 1,8 ± 0,6 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 80 ± 20 </td><td> 8,0 ± 2,0 </td><td> 2.4 ± 0.6 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 100 ± 20 </td><td> 10 ± 2 </td><td> 3,0 ± 0,6 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 120 ± 30 </td><td> 12 ± 4 </td><td> 3.6 ± 1.2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 ± 32 </td><td> 20 ± 3 </td><td> 5.9 ± 0,9 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 400 ± 45 </td><td> 40 ± 5 </td><td> 12 ± 2 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 600 ± 55 </td><td> - </td><td> 18 ± 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> een Fouten werden bepaald zoals beschreven in de tekst; n = aantal handmatig geteld microbolletjes; N = totaal aantal ingekapselde microsferen. </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Aantallen en Volume Fracties (φ, vol%) van de microsferen een. een Fouten werden bepaald zoals beschreven in de tekst; n = aantal handmatig geteld microbolletjes; N = totaal aantal ingekapselde microsferen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig1.jpg" /> Figuur 1: Flow Ch<html> kunst en schematische weergave van W / O-emulsie Centrifugeren Method. (A) Olie oplossing bestaande uit DOPC en Texas rood DHPE (100: 0,3 molaire verhouding) in vloeibare paraffine. (B) Binnen waterige dispersie bestaande uit sucrose en microbolletjes in Tris-HCl buffer. (C) Buitenste waterige oplossing bestaande uit glucose in Tris-HCl buffer. (D) Mengsel van 1 ml olie-oplossing en 300 pl inwendige waterige dispersie. (E) Emulgering met een homogenisator (10.000 rpm, 2 minuten). (F) De w / o-emulsie. (G) gelaagdheid van 300 ul van de emulsie 1 ml van de buitenste waterige oplossing. (H) Neergeslagen GvS net na centrifugeren. (I) Schematische weergave van het principe van de w / o-emulsie centrifugatiemethode. De zwarte pijl geeft de richting van de centrifugale versnelling..jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" /> Figuur 2: Het doordringen van de Microtube. (A) neergeslagen GVS net na centrifugeren (ook afgebeeld in figuur 1h). De rode ellips geeft de druppel van de dispersie neergeslagen GV. (B) Piercing van de microbuisjes met een punaise. De pellet die de GVS werd verkregen door doorboren de microbuis bij de bodem met een punaise en druppeltjes verzamelen uit het gat. (C) Druppeltje van het geprecipiteerde GVS (aangegeven door de gele pijl) dispersie verdund met de buitenste waterige oplossing. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Figuur 3: Microscopie Beelden van GVS. (A) differentiële interferentie contrast microscopie afbeelding van een GV zonder microbolletjes. De diameter van GV was ongeveer 10 urn. Schaal bar = 10 micrometer. (B) de fluorescentie microscopie beeld van een GV zonder microsferen. De rode fluorescentie werd uitgezonden door Texas Red DHPE. (C) microscopie verschilbeeld interferentiecontrast van een GV bevattende microbolletjes. (D) Fluorescentie microscopie beeld van 1,0 micrometer microsferen (YG carboxylaat microsferen) in een GV. Het aantal getelde fluorescerende microbolletjes (n) was 6. Wij schatten de fouten (i = 2) op basis van Poisson verdeling. Dan geschat we totaal aantal innerlijke microsferen (N = 20 (n ± i)) was 120 ± 40. Berekend werd dat deGV bevatte 1,0 urn microbolvormen in een volumefractie (φ = 100 Nv / V) van ongeveer 11 ± 3 vol%, waarbij v het volume van de microsferen en V het volume van het GVS. (E) Fluorescentie microscopie afbeelding van een GV membraan. De rode fluorescentie werd uitgezonden door Texas Red DHPE. (F) Samengevoegd beeld van de beelden in panelen d en e. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig4.jpg" /> Figuur 4: Differentieel Interferentie Contrast en fluorescentiemicroscopie Beelden van GVS met verschillende Encapsulated Materials. Differentiële interferentie contrast microscopie (bovenste) en fluorescentie microscopie (onder) afbeeldingenGVS bevattende (a) 0,1 urn microbolletjes, (b) GFP, en (c) uranine. Schaalbalken = 10 urn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Reusachtige blaasjes die micrometergrote componenten bevatten, zijn nuttige celmodellen. De centrifugatiemethode voor water-in-olie-emulsie is een eenvoudige, krachtige tool voor de bereiding van reusachtige blaasjes met ingekapselde materialen.

Bereiding van Giant blaasjes inkapselen Microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Het algemene doel van deze centrifugatiemethode voor water-in-olie-emulsies is om eenvoudig een dunne laag giant vesicles te prepareren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de synthetische biologie, zoals de creatie van een kunstmatige cel op basis van een giant vesicle. Ter voorbereiding van deze procedure dient een 25 millimolaire voorraadoplossing van DOPC en een 0,2 millimolaire voorraadoplossing van Texas Red DHPE in chloroform te worden bereid.Vorm vervolgens een lipidefilm op het binnenoppervlak van een glazen vial van vijf milliliter door een mengsel van de DOPC- en Texas Red DHPE-stokoplossingen te laten verdampen onder een stroom stikstofgas. Nadat de film een nacht onder verminderde druk is geïncubeerd, wordt er één milliliter vloeibare paraffine aan de vial toegevoegd. Wikkel de vial in aluminiumfolie en incubeer het mengsel gedurende een nacht bij 80 °C.Meng in een microbuisje met dop van 1,5 ml 237,5 µL niet-fluorescerende microsferen van 1 µm en 12,5 µL fluorescerende microsferen van 1 µm. Voeg vervolgens 64 mg sucrose toe aan het microbuisje, gevolgd door 125 µL 1 M Tris-gebufferde oplossing en 875 µL gedeïoniseerd water. Vortex het mengsel gedurende 30 seconden en sonicize vervolgens gedurende 10 minuten.Nadat 10 milliliter van een Tris-gebufferde oplossing is bereid, wordt één milliliter hiervan in een microtube van 1,5 milliliter met dop geplaatst. Zodra de oplossing is gevortexed en gesoneerd, wordt één milliliter van de olieloplossing gemengd met 300 µL van de innerlijke waterige oplossing in een microtube van 1,5 milliliter. Emulgeer de twee componenten in de microtube met behulp van een mechanische homogenisator die gedurende twee minuten bij 10.000 rpm op kamertemperatuur wordt bediend.Breng vervolgens voorzichtig 300 µL van de water-in-olie emulsie aan op het oppervlak van één milliliter van de buitenste waterige oplossing bij 4 °C in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml met dop. Centrifugeer het mengsel direct na een koelperiode van 10 minuten in het microcentrifugebuisje gedurende 30 minuten bij 18.000 ×g. Verkrijg na afloop de geprecipiteerde reuzenvesikels of GVs door de bodem van het microcentrifugebuisje met een punaise door te prikken en één druppel op te vangen in een gesteriliseerd microcentrifugebuisje van 1,5 ml.Plaats een adhesieve incubatiekamer voor NC twee polymerasekettingreactie en hybridisatie op een microscoopdekglas. Breng met een micropipet 25 µL van de verdunde geprecipiteerde GVs aan op het monstergebied en plaats onmiddellijk een dekglas van 0,15 mm dik op de incubatiekamer. Nadat er microscopische beelden van de blaasjes zijn vastgelegd, wordt fluorescentiemicroscopie uitgevoerd door eerst de UFBNA- en UFMCHE-fluorescentiespiegelunits in de microscoop te plaatsen.Voorzie de units vervolgens van excitatiefilters en emissiefilters voor de analyse. De belangrijkste bepalende factor voor het succes van de water-in-olie-methode is dat het soortelijk gewicht van de binnenste waterige oplossing groter moet zijn dan dat van de buitenste waterige oplossing, zodat de GVs tijdens het centrifugeren neerslaan. Differentiële interferentiemicroscopie en fluorescentiemicroscopie van de GVs zonder microsferen en met microsferen bevestigden dat GVs met een lage lamellariteit waren gevormd.Van de 160 verkregen GV's bevatten er 55 ingekapselde microsferen en waren er 105 leeg, wat een inkapselingsratio van 34% opleverde. De volumefractie van de microsferen in de GV's werd geschat op ongeveer 11 plus of minus drie volume procent en de precisie van de berekende volumefractie was 10 tot 30%. De inkapseling van andere materialen in 100 mole procent DOPC GV's met behulp van dezelfde externe waterige oplossing en hetzelfde protocol was succesvol, zoals aangetoond door differentiële interferentiemicroscopie en fluorescentiemicroscopie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals flowcytometrie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de elucidatie van de gemodelleerde cel.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in het voorbereiden van gigantische vesicles met ingekapselde materialen.

preparation-giant-vesicles-encapsulating-microspheres-centrifugation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden extrusie lipide vesicles van sub-micron afmetingen met een hoge mate van homogeniteit. Deze methode maakt gebruik van een druk-gecontroleerd systeem met gecontroleerde stikstofstroom tarieven voor liposoom voorbereiding. De lipide...

Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes

Hier presenteren we twee ultrasnelle protocollen voor reconstructie van membraaneiwitten in fusogenic proteoliposomes, en de fusie van dergelijke proteoliposomes met doel lipide bilayers voor wasmiddel-gratis bezorging van deze membraaneiwitten binnen de postfusion dubbelgelaagde. De combinatie van deze benaderingen kan snel en gemakkelijk-gecontroleerde vergadering van complexe multi-component membraan systemen.

Wasmiddel-vrije ultrasnelle reconstitutie van membraaneiwitten in lipide-Bilayers met behulp van Fusogenic aanvullende geladen Proteoliposomes.

Liposomen met single-keten amfifielen, vertonen met name de vetzuren, verschillende eigenschappen ten opzichte van deze met diacylphospholipids als gevolg van de unieke chemische eigenschappen van één keten amfifielen. Hier beschrijven we technieken voor de voorbereiding, zuivering, en gebruik van liposomen bestaat gedeeltelijk of geheel van deze amfifielen.

Voorbereiding, zuivering, en het gebruik van vetzuur-bevattende liposomen

Presenteren we een techniek voor contactloze micromanipulation van blaasjes, met behulp van de gelokaliseerde calcium ion verlopen. Microinjection van een calcium Ionenoplossing, in de nabijheid van een gigantische lipide blaasje, is gebruikt om het remodelleren van het lipide membraan, wat resulteert in de productie van membraan buisvormige uitsteeksels.

Membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde Calcium Ion verlopen

Deze studie beschrijft klassieke hydratatie met behulp van de dunne lipide-film methode voor de bereiding van nanoliposome gevolgd door nanodeeltjes karakterisatie. Een 47 kDa-hydrofiele en bolvormige proteïne, Tarin, is met succes ingekapseld als een strategie om de stabiliteit te verbeteren, snelle klaring te voorkomen en gecontroleerde afgifte te bevorderen. De methode kan worden aangepast aan hydrofobe moleculen inkaping.

Voorbereiding en karakterisering van Nanoliposomes voor de Entrapment van bioactieve hydrofiele bolvormige eiwitten

Het doel van het protocol is om de mechanische eigenschappen van de membraan van gigantische blaasjes betrouwbaar te meten met micro pipet aspiratie.

Het verkrijgen van gigantische Unilamellaire hybride blaasjes door elektro vorming en meting van hun mechanische eigenschappen door micropipet aspiratie

Dit artikel introduceert een eenvoudige methode voor snelle productie van gigantische unilamellaire blaasjes met ingekapselde cytoskeletale eiwitten. De methode blijkt nuttig te zijn voor bottom-up reconstitutie van cytoskeletstructuren in opsluiting en cytoskelet-membraaninteracties.

Snelle inkapseling van gereconstitueerd cytoskelet in gigantische unilamellaire blaasjes

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

We presenteren een protocol voor het reconstitueren van membraaneiwitten en het inkapselen van enzymen en andere in water oplosbare componenten in lipideblaasjes van submicrometer en micrometer grootte.

Constructie van metabolische netwerken uit evenwicht in blaasjes ter grootte van nano- en micrometer

Deze beginnershandleiding presenteert een algemeen protocol voor de bereiding van Giant Unilamellaire blaasjes (GUV's) via de druppeloverdrachtsmethode, bespreekt de kritieke stappen en biedt inzichten om mogelijke aanpassingen te helpen die nodig zijn voor verschillende toepassingen, waaronder synthetische biologie en microrobotica.

De druppeloverdrachtsmethode gebruiken om op betrouwbare wijze gigantische unilamellaire blaasjes te bereiden

Dit artikel introduceert een eenvoudige reconstitutie in één pot van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden reuzenblaasjes. De methode kan worden veralgemeend en toegepast op inkapseling of opsluiting van een breed scala aan biomoleculen.

In vitro Reconstitutie van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's)

Leer hoe je reuzenblaasjes bereidt met een water-in-olie emulsie centrifugatiemethode voor synthetische biologie. Deze techniek maakt kunstmatige celmodellen met geëncapsuleerde materialen.

Bereiding van Giant blaasjes inkapselen Microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie

Meer video's verkennen