Name: Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer T-cel alloreactiviteit meten voor transplantatie-immunologie met behulp van imaging flowcytometrie. Deze methode analyseert individuele immuunsynapsen en helpt bij het voorspellen van transplantatie-uitkomsten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SCJ werd ondersteund door een Internationale Vereniging voor Hart-en Lung Transplantation Research Fellowship en een Royal College of Physicians en Chirurgen van Canada Detweiler Reizen Fellowship.SM werd mede ondersteund door een International Society for Heart and Lung Transplantation Career Development Award (tot SCJ). SS werd gesteund door de National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.JH is de ontvanger van een Kidney Research UK Senior Non-Clinical Fellowship. Dit werk werd gefinancierd door de volgende subsidies aan AB en KW: een Wellcome Trust Program Grant (082519Z07Z), een British Heart Foundation Program Grant (PG / 10 / 62,28504), en het EU-kaderprogramma 7 (een studie; BioDRIM). De auteurs willen Michael Parsons en de Flow Cytometry Core Facility op de Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, Toronto bedanken voor het verlenen van toegang tot en ondersteuning bij de ImageStream Mark X instrument.

<ol><li>Cravedi, P., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+monitoring+in+transplantation+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Immunologic monitoring in transplantation revisited.</a> Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Pearson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assessment+of+transplantation+tolerance+induced+by+anti-CD4+monoclonal+antibody+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model.</a> Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).</li>
<li>Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+tolerance+twelve+years+after+prospective+withdrawal+of+immunosuppressive+drugs%3A+studies+of+chimerism+and+anti-donor+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity.</a> Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).</li>
<li>Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+precursor+frequency+does+not+correlate+with+either+the+incidence+or+severity+of+graft-versus-host+disease+after+matched+unrelated+donor+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation.</a> Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).</li>
<li>Roelen, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+cytotoxic+alloreactivity+under+different+immunosuppressive+regimens+in+clinical+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation.</a> Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).</li>
<li>VanBuskirk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+allograft+acceptance+is+associated+with+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human allograft acceptance is associated with immune regulation.</a> J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).</li>
<li>Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panel+of+reactive+T+cells+as+a+measurement+of+primed+cellular+alloimmunity+in+kidney+transplant+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).</li>
<li>Zitzner, J. R., Tambur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ELISPOT+Assays+in+Risk+Assessment+Pre-+and+Post-Kidney+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation.</a> Cells. 1 (2), 100-110 (2012).</li>
<li>Newell, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+B+cell+signature+associated+with+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).</li>
<li>Brouard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+peripheral+blood+transcriptional+biomarker+panel+associated+with+operational+renal+allograft+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).</li>
<li>Sagoo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cross-platform+biomarker+signature+to+detect+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).</li>
<li>Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assessment+of+disease+states+in+kidney+transplant+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples.</a> Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+blood+gene+signatures+for+the+diagnosis+of+renal+and+cardiac+acute+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection.</a> PLoS One. 8 (12), e82153(2013).</li>
<li>Khatri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+rejection+module+%28CRM%29+for+acute+rejection+across+multiple+organs+identifies+novel+therapeutics+for+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation.</a> J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).</li>
<li>Halloran, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+diagnosis+of+antibody-mediated+rejection+in+kidney+transplant+biopsies%3A+an+international+prospective+study+%28INTERCOM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM).</a> Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).</li>
<li>Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biomarkers+and+functional+assays+to+monitor+cell-therapy-induced+tolerance+in+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).</li>
<li>Miqueu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peripheral+T-cell+repertoire+in+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients.</a> Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).</li>
<li>Morris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+donor-reactive+T+cells%3A+Evidence+for+clonal+deletion+in+tolerant+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients.</a> Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210(2015).</li>
<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+engagement+delivers+a+stop+signal+to+migrating+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).</li>
<li>Goldsmith, M. A., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+signal+transduction+by+the+antigen+receptor+without+commitment+to+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation.</a> Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes.</a> Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).</li>
<li>Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+CD4%28%2B%29+T+Cell+Alloreactivity+and+Its+Control+by+Regulatory+T+Cells+Using+Time-Lapse+Microscopy+and+Immune+Synapse+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection.</a> Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).</li>
<li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+matter%3A+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).</li>
<li>Burbach, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regulation+of+integrin-dependent+T+cell+conjugate+formation+and+NF-kappa+B+activation+by+the+adapter+protein+ADAP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP.</a> J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).</li>
<li>Markey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-dressing+by+donor+dendritic+cells+after+allogeneic+bone+marrow+transplantation+contributes+to+formation+of+the+immunological+synapse+and+maximizes+responses+to+indirectly+presented+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen.</a> J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).</li>
<li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
<li>Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cellular+events+in+a+systemic+graft-vs.-host+reaction.+II.+Autoradiographic+estimates+of+the+frequency+of+donor+lymphocytes+which+respond+to+each+Ag-B-determined+antigenic+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex.</a> J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).</li>
<li>Macedo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+naive+and+memory+T-cell+populations+to+the+human+alloimmune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response.</a> Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).</li>
<li>Noorchashm, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+method+for+the+calculation+of+alloreactive+CD4%2B+T+cell+precursor+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency.</a> Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).</li>
<li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo%3A+new+answers+to+an+old+question%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+recognition+of+allopeptides+promotes+the+development+of+cardiac+allograft+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).</li>
<li>Pickl, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characteristics+of+dendritic+cells+generated+from+highly+purified+CD14%2B+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes.</a> J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Francis, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transplantation+tolerance+converts+potential+effector+T+cells+into+graft-protective+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).</li>
<li>Faust, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T+cell+TGFbeta+signaling+and+IL-17+in+allograft+acceptance+and+fibrosis+associated+with+chronic+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection.</a> J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+CD4+Th17+cells+in+mediating+cardiac+allograft+rejection+and+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy.</a> J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).</li>
<li>Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+alloreactive+T+cell+repertoire+using+high-throughput+sequencing+of+mixed+lymphocyte+reaction+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture.</a> PLoS One. 9 (11), e111943(2014).</li>
<li>Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+indirect+allorecognition+in+lung+transplant+recipients+with+obliterative+bronchiolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis.</a> Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).</li>
<li>Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+direct+and+indirect+T+cell+alloreactivity+during+allograft+rejection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice.</a> J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+direct+and+indirect+recognition+pathways+to+T+cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity.</a> J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Imaging flowcytometrie is gebruikt om immune synapsvorming tussen monoklonale T-cellen en APC&#39;s of bij aanwezigheid van superantigenen 24, 25, 26, 27, 28 tonen. Deze methode maakt gebruik van het feit dat na een productieve T-cel-APC contact, de T-cel herschikt het actine cytoskelet polariserende deze naar het contactoppervlak 21. Deze herrangschikking treedt niet zonder TCR-signalering, en daarom is een vroege correlaat van T-celactivering 19, 20, 21. De hier gepresenteerde methode past deze benadering voor de meting van alloreactieve T-cel frequentie polyklonale T-celpopulaties. Als zodanig kan het in de toekomst dienen als basis voor de ontwikkeling van assays voor donor reactivi<html> ty in klinische transplantatie. Hoewel directe vergelijkingen nog niet zijn gedaan, wordt de detectie van alloreactieve immunologische synapsen superieure voorspellende waarde dan de conventionele MLR hebben. Zo heeft voorgaand werk aangetoond dat het tolerant makende hierboven beschreven protocol, de resultaten van de MLR niet betrouwbaar correleren met transplantaat uitkomst 2. Een aantal tests zijn ontwikkeld voor het operationeel tolerant staat bij de mens 9, 10, 11, hoewel deze niet effector celfunctie te meten in reactie op allo-antigeen. Daarentegen IFNy ELISPOT-assays 8 handeling effector T-celfunctie, maar kan het volledige spectrum van cytokine secretie acute en chronische transplantaatafstoting relevant kunnen zijn, zoals IL-17 38 niet vangen,&gt; 39. De beperkende verdunning assay 4, hetgeen arbeidsintensief, en de trans-vivo bepaling 6, waarbij muizen vereist aanzienlijke praktische beperkingen die hun toepassing in een klinische omgeving zou belemmeren. Recente verbeteringen van de analyse van prolifererende cellen gebruik TCR sequentieanalyse van T-cellen reageren in de MLR kunnen waardevol zijn, maar net als de test hier gepresenteerde verder geldig worden in klinische studies 18, 40. Verdere ontwikkeling van het immuunsysteem synaps detectie-assay vereist dat een aantal belangrijke vragen worden beantwoord. Ten eerste, de assay zoals ontwikkeld meet alleen rechtstreekse alloreactiviteit. De directe weg omvat de presentatie van allogene MHC / peptidecomplexen op APC-afgeleide donor. Deze worden meestal snel geëlimineerd na transplantatie en na allo-antigen presentatie is Carried door APCs ontvanger presenteren intact donor MHC (semi-directe route) of verwerkt donorantigenen op zelf MHC (indirecte route). De indirecte route is een belangrijke factor van chronische allograftafstoting 33, 41. In principe zou het mogelijk zijn indirecte immunologische synapsen detecteren met deze test, maar indirect alloreactieve T-cellen een veel lagere frequentie dan directe 42, 43, zodat de analyse van een groter aantal gebeurtenissen vereist. Een tweede overweging is dat we in deze assay getest met behulp van CD4 + -T-cellen, terwijl CD8 + T-cellen ook een belangrijk onderdeel van het anti-donor respons. Wederom moet het mogelijk zijn om CD8 + T-cel-APC synapsen met deze werkwijze gedetecteerd. Een andere beperking is dat de methode vereist de handmatige controle en analyse van cel-beelden in de laatste membrane contact gate, en we zijn momenteel bezig met de automatisering van deze stap. Ten slotte is de methode vereist het testen en ontwikkeling bij de mens, en voorstudies met menselijke monsters worden momenteel uitgevoerd. Verdere fenotypische T-cel subgroep analyse (dat wil zeggen, effector, geheugen, regelgeving, enz.) In combinatie met de detectie van immunologische synapsen in transplantatie ontvangers zou een krachtige aanpak vormen voor het karakteriseren van de alloreactieve T-cel repertoire en zal een belangrijk aandachtspunt zijn voor toekomstwerk.

Solid orgaantransplantatie heeft de zorg voor patiënten in het eindstadium van ziekten van de nieren, de lever, het hart en de longen getransformeerd. Als gevolg van verschillen in grote en kleine histocompatibiliteitantigenen echter allogene worden onmiddellijk verworpen door de ontvanger T-cellen als immunosuppressieve geneesmiddelen alleen worden gebruikt. Deze agenten hebben tal van bijwerkingen, waaronder risico&#39;s voor kanker en orgaanfalen. Een belangrijk klinisch doel is derhalve de dosis immunosuppressie te verlagen tot het minimum dat vereist is om allograft afstoting te voorkomen. Dit niveau kan variëren afhankelijk van de mate van activering van het aangeboren immuunsysteem; de mate van donor-ontvanger allo mismatch; en interindividuele verschillen in het immuunsysteem, farmacokinetiek en farmacodynamiek. Helaas, transplantatie artsen hebben geen instrumenten hebben om nauwkeurig te kunnen beoordelen donor reactiviteit bij individuele patiënten 1. de gemengdeleukocyt reactie (MLR) kunnen donor reactiviteit detecteren, maar niet aan transplantaat uitkomst 2, 3 betrouwbare voorspelling. Beperkende verdunning assays, cytokine ELISPOTs en trans-vivo assay ofwel meten een beperkt aantal reacties of niet praktisch 4, 5, 6, 7, 8 .Gene expressieprofielen gebleken handtekeningen voortvloeien uit operationele tolerantie 9, 10, 11, 12 en afwijzing 13, 14, 15, maar deze zijn niet altijd generalizable in populaties 16 en kan uiteindelijk beperkt nut bij individuele patiënten. Sequentie-gebaseerde analyses van de T-celreceptor (TCR) van T-cellen in het perifere bloed 17 of prolifererende in de MLR 18 zijn ontwikkeld maar vereisen verdere validatie. Conceptueel zou het wenselijk zijn om een ​​test waarmee de eerste noodzakelijke stappen ontvangende T-celactivering detecteert door een donor antigeen. Aangezien het kweken van cellen in dagen (zoals in de MLR) kunnen artefacten introduceren dergelijke test zou idealiter niet het meten van stroomafwaartse gebeurtenissen zoals proliferatie of effectorfunctie vereist. Ook zou het echter wenselijk zijn om de test af te hangen van een element van T-celfunctie, aangezien louter beschrijvend evaluaties (Bijvoorbeeld TCR sequentie) kan geen onderscheid maken tussen anergic functionele T-cellen. Talrijke studies hebben aangetoond dat langdurige T-APC contact is nodig voor de vorming van een immuun synaps, dat een essentieel eerstebetreedt de T-celrespons 19, 20, 21, 22. We hebben onlangs gemeld dat tijdens dynamiek in vitro time lapse imaging, ongeveer 5-10% muizen- CD4 + T cellen vormen langdurig contact met allogene beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDCs) 23. De frequentie van langdurig contact was verhoogd bij dieren die een ent verworpen, terwijl muizen die eerder tolerant dezelfde antigenen gesmolten, bleef op niveaus waargenomen in muizen untransplanted 23. Langdurige interacties gereduceerd in aanwezigheid van Tregs ontvanger en meer in hun afwezigheid en we waarnamen soortgelijke verschijnselen met menselijke T-cellen en allogene monocyten afgeleide DCs (MoDCs) 23. Echter, de opsomming van langdurige contacten binnen een polyklonale T-cel population is tijdrovend en arbeidsintensief. We hebben daarom gebruik gemaakt van beeldvorming flowcytometrie aan allogene immuun synaps formatie te onderzoeken. Beeldvorming doorstroomcytometrie omvat de multiparametrische data acquisitie en analyse mogelijkheden van conventionele flowcytometrie met de single-cell imaging mogelijkheden van fluorescentiemicroscopie. Deze techniek is gebruikt door andere onderzoekers om immune synapsvorming bestuderen door monoklonaal T-cellen 24, 26, 27 of bij aanwezigheid van superantigenen 28. Bij dergelijke instellingen is echter de frequentie reageren T-cellen varieert 30-100%, terwijl alloreactieve T-cellen in het algemeen worden geschat op 5-15% van de totale T-cel repertoire 29, 30, 31, 32 representeren. Belangrijk is dat we laten zien dat imaging stroom kan cytometrie av producerenery vergelijkingsmaatstaf voor alloreactieve T-celfrequentie 23 en dat veranderingen in de synaps frequentie binnen een polyklonale T-cel populatie zijn voorspellend transplantaat uitkomst 23. Op dit moment is deze aanpak is geoptimaliseerd om de directe alloreactiviteit van CD4 + T-cellen te meten, maar in principe kan het ook worden ontwikkeld om CD8 + T-cellen en de indirecte route te onderzoeken. Indirect alloreactiviteit wordt aangenomen dat het in toenemende mate relevant zijn op langere tijden na transplantatie 33 geworden. Momenteel ontwikkelen we deze methode om menselijke cellen, waardoor voor het testen van patiënten te gebruiken. Dus in de toekomst, de algemene benadering kan nuttig zijn voor de functionele evaluatie van T-cel responsen in transplantatie ontvangers voor transplantatie; direct na transplantatie; en op de lange termijn, wanneer drug minimalisering wordt een belangrijk doel.

<table><tbody><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td><td>Verschillend</td><td>Variest</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediameentetra-azijnzuur, 0,5 M oplossing</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 niet-ionogene detergent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Oplossing is 37% formaldehyde en moet dus 25 keer worden verdund voor 1,5% oplossing</td></tr><tr><td>Celstrainers, 70 &mu;m poriegrootte</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-fluoresceïne-isothiocyanaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoactinomycine D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1310</td><td>Reconstitueer in DMSO</td></tr><tr><td>Allofycocyanine-geconjugeerd anti-muis CD90.2</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>Pacific blue-geconjugeerd anti-muis CD11b</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>Pacific blue is vervangen door eFluor 450</td></tr><tr><td>Gebiotinileerd anti-muis CD3</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>Gebiotinileerd anti-muis MHC klasse II</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>Gebiotinileerd anti-muis B220</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>Gebiotinileerd anti-muis CD8</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>Gebiotinileerd anti-muis CD19</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>Anti-biotine microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>LS kolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS magnetische celscheider</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant muis GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan TGF&beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>Humaan TGF&beta;1 heeft activiteit op muizencellen</td></tr><tr><td>Amnis ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Beeldvormende flowcytometer; details beschikbaar op http://www.emdmillipore.com/</td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Gratis downloaden (registratie vereist): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td></tr><tr><td>Celkweekmedium</td><td>Verschillend</td><td>Variest</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Verschillend</td><td>Variest</td><td></td></tr><tr><td>Celkweek platen</td><td>Verschillend</td><td>Variest</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van de t-cel alloreactiviteit met behulp van imaging flowcytometrie

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Het meten van immunologische reactiviteit voor donorantigenen bij transplantatiepatiënten is waarschijnlijk essentieel voor de succesvolle vermindering of stopzetting van immunosuppressie zijn. De gemengde leukocyt reactie (MLR) beperkende verdunning assays en trans-vivo vertraagde hypersensitiviteit (DTH) test zijn allemaal toegepast op deze vraag, maar deze methoden zijn voorspellend vermogen en / of belangrijke praktische beperkingen die de bruikbaarheid ervan beperken beperkt. Imaging flowcytometrie is een techniek die de Multiparametrische kwantitatieve bevoegdheden van de stroming combineert cytometrie met de grafische mogelijkheden van fluorescentie microscopie. We hebben onlangs maakten gebruik van een imaging flowcytometrie benadering van het aandeel van de ontvanger T-cellen die in staat tot het vormen van volwassen immuun synapsen met donor-antigeen presenterende cellen (APC) te definiëren. Gebruik een goed gekarakteriseerde muizen harttransplantatiemodel hebben we aangetoond dat de frequentie van in vitro immunologische synapsen tussen T-APC Membrane contact gebeurtenissen sterk voorspeld allograft uitkomst in afstoting, verdraagzaamheid, en een situatie waarin transplantatie voortbestaan ​​afhankelijk is van geïnduceerde regulatoire T-cellen. De frequentie van T-APC contacten verhoogd met T-cellen uit muizen tijdens acute afstoting en verminderd met T-cellen uit muizen gesmolten reageren op alloantigeen. De toevoeging van regulatoire T cellen in vitro systeem verlaagd langdurige T-APC contacten. Kritisch, werd dit effect ook waargenomen met menselijk polyklonaal geëxpandeerd natuurlijk voorkomende regulatoire T-cellen, waarvan bekend is dat de afwijzing van menselijke weefsels in gehumaniseerde muismodellen regelen. De verdere ontwikkeling van deze aanpak kan zorgen voor een diepere karakterisering van de alloreactieve T-cel compartiment in transplantatie ontvangers. In de toekomst kan de verdere ontwikkeling en evaluatie van deze methode met behulp van menselijke cellen de basis voor assays gebruikt om patiënten voor immunosuppressie minimalisering selecteren vormen, en het kan worden gebruikt om de impact van tolerogeen metenic therapieën in de kliniek.

Deze methode werd gebruikt om te onderzoeken CD4 + T-cellen bij muizen alloreactiviteit rendered tolerant donor allo-antigenen voor heterotopische harttransplantatie. CBA-muizen (H-2k) kregen een toleriserende protocol bestaat uit een donor-specifiek (B6, H-2b) bloedtransfusie gecombineerd met een niet-afbrekende CD4 antilichaam één maand voorafgaand aan het ontvangen van een B6 harttransplantatie. Dit protocol leidt tot langdurige allograftoverleving die afhankelijk Foxp3 + regulatoire T-cellen 36, 37. Zeven dagen na de transplantatie, werden milt CD4 + T-cellen verkregen uit tolerant en niet tolerant ontvangers van allotransplantaten en cardiale B6 werden samen geïncubeerd met B6 beenmerg afgeleide DC&#39;s volgens dit protocol. Figuur 2 toont representatieve gegevens van dit experiment. Het membraan contact poort is getoond in figuur 2Een met groene crosshairs geplaatst op een synaptisch gebeurtenis (linker panel, 1) en op niet-synaptische event (rechter paneel). Figuur 2B toont de helderveld en fluorescentie kanalen voor dit evenement. Om vertekening te verminderen, werden de gegevens geanalyseerd door een waarnemer geblindeerd voor de behandeling opdracht 23. Zoals aangetoond in verschillende voorbeelden in figuur 3, zowel van niet-tolerant (Figuur 3A-B) en tolerant (Figuur 3C-D) CBA ontvangers van B6 harten, synapsen zijn gemakkelijk te onderscheiden van niet-synaptische contacten door de aanwezigheid van een dichte FITC-positieve nok van het T-APC interface. Deze resultaten tonen dat visuele detectie van immunologische synapsen door ontvanger T-cellen meeloopt met de mate van alloreactiviteit in de ontvanger. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" /> Figuur 2. Identificatie van T-APC wambuizen met membraanContact en Immune Synapse Formation. Gebeurtenissen in de laatste doublet poort (Figuur 1F) geanalyseerd. A. T-cel marker fluorescentie in het APC object masker is uitgezet tegen APC marker fluorescentie in het DC object masker. Sommige doublet evenementen hebben een APC en een T-cel zonder cel-cel contact en verschijnen in de linker benedenhoek van het perceel (beelden niet getoond). Een membraan contact hek kan dus worden geconcludeerd dat alleen doubletten waarbij T-cellen en APC&#39;s in contact omvat. Beelden van elke gebeurtenis in deze poort worden beoordeeld op tekenen van actine cytoskelet omlegging in de falloïdine-FITC kanaal en kan worden gelabeld met de analysesoftware. Het linkerpaneel toont een immuun synaps gebeurtenis (label 1 en via groene dradenkruis), terwijl het rechter paneel toont een membraan contact gebeurtenis zonder immuno synapsvorming (label 2 en via groene dradenkruis). De bepaling de vorming van synapsen moet handmatig herziening van dezebeelden, getoond in B. B. De bovenste rij toont helderveld en fluorescentie kanaal afbeeldingen voor een doublet met een immunologische synaps (komt overeen met 1 event in A); de onderste rij toont een doublet met membraan contact, maar ontbreekt vorming synaps (komt overeen met 2 event in A). De gegevens werden geanalyseerd op een blinde wijze met betrekking tot toegewezen behandeling en komen uit een eerder gepubliceerde 23 experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" /> Figuur 3. Voorbeelden van T-APC Synapse Formation. CBA muizen ontvingen cardiale allotransplantaten van B6 donoren na ofwel geen voorbehandeling (AB) of na inductie met B6 volbloed onder geleide van een niet-afbrekende anti-CD4-antilichaam ( <st<html> rong&gt; CD). Na 7 dagen werden de milt CD4 + T-cellen getest op synaps formatie met B6 DCs. A. Drie voorbeelden van niet-synaptische doubletten met membraan contact van een niet-tolerant gemaakte dier. B. Drie voorbeelden van immunologische synapsen van een niet-tolerant gemaakte dier. C. Drie voorbeelden van niet-synaptische doubletten met membraan contact van een tolerant gemaakte dier. D. Drie voorbeelden van immunologische synapsen van een tolerant gemaakte dier. synapsvorming wordt aangegeven door de aanwezigheid van een heldere, FITC-positieve nok van het T-APC interface (CH03). De gegevens werden geanalyseerd op een blinde wijze met betrekking tot toegewezen behandeling en komen uit een eerder gepubliceerde 23 experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> ays &quot;&gt; <tbody><tr><td> Antilichaam / Dye </td><td> fluorochrome </td><td> Kanaal </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> eF450 </td><td> CH02 </td><td> 5 ug / ml Titreer empirisch </td></tr><tr><td> CD90.2 </td><td> APC </td><td> CH06 </td><td> 5 ug / ml Titreer empirisch </td></tr><tr><td> phalloidin </td><td> FITC </td><td> CH03 </td><td> 0,05-0,5 gg / mL </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> - </td><td> CH05 </td><td> 25 ug / ml </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Antilichamen en kleurstoffen gebruikt in deze studie. Fluorochroom-geconjugeerde antilichamen, kleurstoffen, leveranciers, en de aanbevolen concentraties zijn weergegeven in de tabel. De beeldvormende flowcytometer kanaal werd gebruikt om elk fluorochroom detecteren wordt ook getoond in de tabel.

Dit document beschrijft een werkwijze voor het meten van alloreactiviteit in een gemengde populatie van T-cellen met behulp van beeldvorming flowcytometrie.

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de alloreactiviteit van T-cellen met behulp van imaging flowcytometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de transplantatie-immunologie, zoals welk percentage van de T-cellen van een ontvanger reactief is voor donor-alloantigenen. Deze techniek combineert de multiparametrische kwantitatieve mogelijkheden van flowcytometrie met de beeldvormingscapaciteiten van fluorescentiemicroscopie om high-throughput onderzoek van individuele synapsen tussen T-cellen en antigeen-presenterende cellen mogelijk te maken.De procedure wordt gedemonstreerd door Sajad Moshkelgosha, een postdoc uit mijn laboratorium. Begin met het zaaien van 0,5 × 10⁶ dendritische cellen in elke put van een 96-wells celkweekplaat, gevolgd door 1 × 10⁶ T-cellen, tot een totaal eindvolume van 50 µL kweekmedium per put.Incubeer de koude culturen gedurende vier uur bij 37 °C en vijf procent kooldioxide. Voeg vervolgens aan elke put drie maal het cultuurvolume aan 1,5% formaldehye in PBS toe gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Breng na afloop van de fixatie de cellen uit elke put over naar een overeenkomstige polystyreenbuis van vijf milliliter.Kleur de cellen met de geschikte fluorochroom-geconjugeerde antilichamen in 100 µL wasbuffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was de cellen vervolgens in 1 mL wasbuffer en resuspendeer de pellets in perm/wasbuffer met phalloïdine FITC. Na nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, worden de cellen gewassen in 1 mL verse perm/wasbuffer.Resuspendeer de pellets in de gewenste kernkleurstof in perm/wash-buffer voor een laatste incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was de cellen in één milliliter perm/wash-buffer, gevolgd door één wasbeurt in enkel wash-buffer. Resuspendeer de cellen vervolgens in 50 tot 100 µL verse wash-buffer.Breng de cellen over in kleine microcentrifugebuisjes met dop. Om de cel-celinteracties te analyseren, reserveert u eerst één kanaal voor de acquisitie van brightfield-beelden en laadt u het eerste controlebuisje. Terwijl het brightfield-kanaal is uitgeschakeld, maakt u in het workspace-venster voor elk gebruikt kanaal een nieuwe scatterplot aan voor de aspect ratio ten opzichte van het oppervlak.Stel de gates in voor de singlets waarbij de aspectratio dicht bij één ligt. Controleer voor elk fluorochroom de positieve populatie en pas indien nodig de laserspanning in het vak voor belichting aan. Selecteer in het kanalenvak de juiste kanalen voor de fluorochromen die bij de kleuring zijn gebruikt.Klik vervolgens op record. Wanneer het aantal events de opgegeven drempel bereikt, stopt de acquisitie automatisch. Nadat alle controls voor enkelvoudige kleuring zijn geacquireerd, laadt u de eerste experimentele monsterbuis en acquireert u enkele tienduizenden events via de juiste analysekanalen, inclusief het brightfield-kanaal.Om een compensatiematrix te genereren, laadt u de databestanden van de enkelvoudige kleuringscontroles in de compensatiewizard en selecteert u de juiste fluorescentiekanalen voor het experiment. Nadat is bevestigd dat de juiste positieve populaties zijn geselecteerd, dubbelklikt u op een waarde in de matrix en voegt u de grafiek voor elk kanaal toe aan het analysegebied. Klik op voltooien om de compensatiematrix op te slaan als een CTM-bestand.Laad het RIF-bestand in de betreffende analyse-software. Converteer het RIF-bestand naar een DAF-bestand voor data-analyse. Open het bestand van de eerste monster.Zet de root-mean-square van de veranderingssnelheid van de beeldintensiteit in het brightfield-kanaal uit. Zet vervolgens de aspectratio uit tegen het oppervlak voor de marker voor antigeen-presenterende cellen. Gate de doubletten die één enkele antigeen-presenterende cel bevatten.Zet de aspectratio uit tegen het oppervlak voor de T-celmarker. Selecteer de doubletten die een enkele T-cel bevatten. Om de cellen te identificeren die contact met elkaar hebben, gebruikt u onder het analysemenu de optie maskers om de maskerbeheerder te openen en benoemt u het nieuwe masker als T-cel objectmasker.Klik op de functieknop en selecteer in het dialoogvenster 'object'. Selecteer het kanaal waarin de T-celmarker wordt gedetecteerd en klik op OK. Maak op dezelfde manier een masker voor de marker van de antigeenpresenterende cel in het juiste kanaal. Plot de fluorescentie-intensiteit van de T-celmarker in het objectmasker van de antigeenpresenterende cel tegenover de fluorescentie-intensiteit van de antigeenpresenterende cel in het objectmasker van de T-cel.Teken vervolgens een gate die alleen de cellen bevat die met elkaar in contact staan. Beoordeel tenslotte handmatig de phalloïdine FITC-beelden van de events binnen deze gate om de volwassen immuunsynapsen te onderscheiden van eenvoudige cel-celcontacten, waarbij de functie voor het taggen van beelden wordt gebruikt om deze beelden te markeren. Hier wordt de gate voor membraancontact getoond voor splenische CD4-positieve T-cellen, verkregen van getoleriseerde en niet-getoleriseerde ontvangers van B6 cardiac allografts zeven dagen na transplantatie en gecocubeerd met B6 bone marrow-afgeleide dendritische cellen, zoals gedemonstreerd.Met de synaptische en nonsynaptische gebeurtenissen aangegeven door de groene kruisdraad. Analyse van het helderveld en de fluorescentiekanalen maakt ook visualisatie van de individuele synaptische en nonsynaptische gebeurtenissen mogelijk. Inderdaad zijn synapsen van zowel niet-getolereerde als getolereerde CDA-recipients van B6-harten gemakkelijk te onderscheiden van nonsynaptische contacten door de aanwezigheid van dichte FITC-positieve ribbels op de interface tussen de T-cel en de antigeenpresenterende cel.Na verdere ontwikkeling kan deze techniek mogelijk worden toegepast in klinische settings, zoals bij de reductie of het stopzetten van immunosuppressie of bij het voorspellen van het transplantaatresultaat bij menselijke transplantatieontvangers.

measurement-of-t-cell-alloreactivity-using-imaging-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Tregs zijn krachtige onderdrukkers van het immuunsysteem. Er is een gebrek van unieke oppervlakte markers om ze te definiëren, dus, de definities van Tregs zijn vooral functioneel. Hier beschrijven we een...

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Succesvol gebruik van cell tracking kleurstoffen aan immuun cel functie en proliferatie monitoren omvat verschillende kritische stappen. We beschrijven werkwijzen voor: 1) het verkrijgen helder, uniform en reproduceerbaar label-ing met membraan kleurstoffen, 2) het selecteren fluorochromen en data acquisitie niet, en 3) het kiezen van een model gebaseerd op celproliferatie kleurstof verdunning kwantificeren.

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

This video demonstrates a method for assessing alloreactivity in mixed T cell populations by observing interactions with alloantigen-carrying dendritic cells, leading to the formation of immunological synapses. Differential staining and quantification of synapse-containing doublets via flow cytometry reveal T cell alloreactivity.

Measuring Alloreactivity in a Mixed Population of T Cells

The video demonstrates an immunological method to monitor in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte or CTL production. A mouse is pre-injected with genetically engineered, proliferative dye-stained donor CD8+ T lymphocytes. Subcutaneous injection of ovalbumin with adjuvants generates cytotoxic CD8+ T lymphocytes that are identified post-harvesting through immunostaining and flow cytometry.

An Immunological Technique to Monitor Adjuvant-Mediated Cytotoxic T Lymphocyte Generation

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Hier beschrijven we een hoogwaardige vloeistofchromatografie-gekoppelde massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) test om het immunosuppressivum tacrolimus in gedroogde bloedvlekken te kwantificeren met behulp van een eenvoudige handmatige eiwitprecipitatiestap en online kolomextractie.

Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS

Macrofagen zijn plastic cellen van het hematopoietische systeem die een cruciale rol spelen in beschermende immuniteit en homeostase. In dit rapport beschrijven we geoptimaliseerde in vitro technieken voor het fenotypisch en functioneel karakteriseren van transplantatie-infiltrerende regulerende macrofagen die zich in het getransplanteerde orgaan verzamelen onder tolerogene omstandigheden.

Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen

Hier presenteren we een protocol bij het opwekken van tolerantie in transplantatie, en beoordelen van in vitro en in vivo de onderdrukkende capaciteit van afzonderlijke cel subsets van de ontvanger en de immuunstatus van de ontvanger naar donor of exogene antigenen.

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

Hier presenteren we een stroom cytometrische protocol ter identificatie van CD4+ en CD8+ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten in perifere bloed met behulp van slechts twee fluorochromes in plaats van zeven. Met deze aanpak, kunnen vijf extra markeringen op de meeste flow cytometers worden opgeslagen.

Discriminatie van zeven immuun cel deelverzamelingen door twee-fluorescerende Stroom Cytometry

Calciuminflux, een maat voor T-celsignalering, is een effectieve manier om reacties op T-celreceptorstimulatie te analyseren. Dit protocol voor het multiplexen van Indo-1 met panelen van antilichamen gericht op celoppervlakmoleculen maakt gebruik van de zeer flexibele mogelijkheden van volledige spectrum flowcytometrie.

Analyse van T-celreceptor-geïnduceerde calciuminstroom in primaire muizen T-cellen door full spectrum flow cytometrie

Het huidige protocol beschrijft een experimentele workflow die de ex vivo analyse van menselijke T-celstimulatie mogelijk maakt in een allogene...

Analyse van menselijke T-celactiviteit in een allogene co-cultuursetting van voorbehandelde tumorcellen

Leer T-cel alloreactiviteit meten voor transplantatie-immunologie met behulp van imaging flowcytometrie. Deze methode analyseert individuele immuunsynapsen en helpt bij het voorspellen van transplantatie-uitkomsten.

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

Meer video's verkennen