Isolatie en Verrijking van Liver Progenitor subsets geïdentificeerd door een Novel Surface Marker Combinatie

De algemene doelstellingen van dit leverdigestieprotocol zijn het beoordelen van de verschillende subsets van leverprogenitoren via flowcytometrie en het isoleren van deze cellen met een hoge zuiverheid met behulp van een nieuwe cocktail van oppervlaktemarkers voor verdere downstream-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van diverse vragen over de biologie van leverprogenitorcellen, zoals wat hun subsetspecifieke kenmerken zijn en wat hun verre oorzaak is tijdens leverbeschadiging. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de isolatie van progenitorcellen met een hoge zuiverheid en viabiliteit mogelijk maakt, wat essentieel is voor de in-vitro analyse.

Hoewel deze digestietechniek inzicht biedt in de biologie van progenitorcellen, kan deze ook worden gebruikt voor de isolatie van hematopoëtische en endotheelcelpopulaties. Om een enkelcelpreparaat van een muizenlever te maken, brengt u de lobben over naar een droge petrischaal en gebruikt u een scalpel om het weefsel in homogene blokjes van ongeveer twee millimeter kubiek te snijden. Breng de stukjes over naar twee conische centrifugebuizen van 15 milliliter per lever, die elk 2,5 milliliter digestiebuffer bevatten.

Plaats de monsters in een waterbad van 37 °C met zachte schudding gedurende vijf en 10 minuten. Na 15 minuten digestie worden de leverstukjes voorzichtig getitreerd met een 1 000 µL pipet met een afgeknipt tipje. Plaats de buizen vervolgens terug in het bad en laat de stukjes twee minuten bezinken.

Filter vervolgens twee aliquots van ongeveer 700 µL van het supernatant door een 100 micron zeef die vooraf is bevochtigd met 800 µL opvangbuffer. Vervang het verwijderde supernatant door verse digestiebuffer. Wanneer het leverweefsel niet langer zichtbaar is, wordt al het supernatant uit de digestiebuizen door het filter geleid.

En verzamel al de cellen door middel van centrifugatie. Resuspendeer de pellets in één milliliter ammoniumchloride-kalium lysisbuffer bij kamertemperatuur en stop de lysis na één minuut met vijf milliliter verse opvangbuffer. Verzamel de cellen met een volgende centrifugatie.

Aspire vervolgens voorzichtig het supernatant zonder het losse pellet te verstoren. Resuspendeer de cellen op ijs in vier milliliter verse opvangbuffer. Om het aantal cellen in het levermonster via flowcytometrie te bepalen, mengt u eerst 20 microliter van de leversuspensie met 174 microliter PBS in een polystyreenbuisje van 1,5 milliliter en voegt u zes microliter propidiumjodide toe.

Voeg telkralen toe om celkwantificatie mogelijk te maken en laad het mengsel van kralen en cellen in de flowcytometer. Stel een gate in op de zijdelingse verstrooiing (side scatter) op basis van de parameters voor voorwaartse verstrooiing (forward-scatter) om debris te vermijden. Sluit dubletten uit via een gate voor forward-scatter hoogte versus forward-scatter oppervlakte, evenals de propidiumjodide-positieve dode cellen.

Laad vervolgens een monster van 30 µL op de flowcytometer en registreer de events. Om de levercellen te kleuren voor flowcytometrische analyse van de progenitor-subsets, worden aliquots van 2x10^5 cellen overgebracht naar reactiebuisjes van 1,5 mL. Pellet de cellen vervolgens door middel van centrifugatie.

Resuspendeer de pellets in Fc-blok voor een incubatie van vijf minuten op ijs. Voeg vervolgens 50 µL van de gewenste celoppervlak-kleuringsantistofcocktail toe aan de betreffende buisjes voor een incubatie van 20 minuten op ijs, beschermd tegen licht. Was aan het einde van de incubatie de monsters in 400 µL kleuringsbuffer per monster.

Resuspendeer de pellets gedurende 20 minuten op ijs, beschermd tegen licht, in 100 µL van de geschikte secundaire antilichaamcocktail. Was de cellen vervolgens met nog eens 400 µL kleuringsbuffer. Resuspendeer de pellets in 300 µL kleuringsbuffer die propidiumjodide bevat.

Meet het monster met een flowcytometer. Om de progenitorcelpopulatie te verrijken via magnetische microbead-gebaseerde scheiding, brengt u 1,5-2x10^6 cellen over naar het juiste aantal conische buisjes van 15 milliliter en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Resuspendeer de pellets in 400 microliters HBSS aangevuld met BSA.

Voeg vervolgens 40 µL anti-CD31 Microbeads en 30 µL anti-CD45 Microbeads toe voor een incubatie van 15 minuten bij 4 °C. Was daarna de cellen in 5 mL HBSS plus BSA. Resuspendeer de pellets in 100 µL dead cell removal beads voor een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur.

Terwijl de cellen incuberen, wordt er per lever één positieve selectiekolom van passende grootte geëquilibreerd met drie milliliter HBSS plus BSA. Voeg vervolgens 900 microliter HBSS plus BSA toe aan de cellen en filtreer de cellen door een polyamiden filtergaas van 100 micron. Breng de gefilterde, met beads geïncubeerde cellen over op de kolommen en vang het eluaat op in de centrifugebuis.

Wanneer alle cellen door de kolom zijn gestroomd, was de kolommen drie keer met drie milliliter HBSS plus BSA. Pellet de cellen door centrifugatie en resuspendeer de celpellet in 100 microliter spoelbuffer en Fc-block. Neem de celpellets van vier tot zes levers of tot minder dan 1x10^6 negatief geselecteerde cellen.

Label de cellen na vijf minuten gedurende 10 minuten op ijs met anti-GP38 gebiotineerd antilichaam. Verzamel de cellen aan het einde van de incubatie door centrifugatie voor resuspensie in 400 microliters spoelbuffer en vijf microliters Anti-Biotin Microbeads. Was de cellen na 15 minuten bij vier graden Celsius onmiddellijk in vijf milliliters spoelbuffer.

Resuspendeer het pellet vervolgens in één milliliter vers spoelbuffer. Plaats de geresuspendeerde cellen in een gekoeld 15-rack en start de automatische magnetische scheiding. Centrifugeer daarna het doorstroomvolume en resuspendeer de pellets in de juiste oplossing voor de geplande downstream experimentele analyse.

Door gating op cellen die negatief zijn voor CD45, CD31 en asialoglycoproteïne receptor één, worden de leverprogenitorcellen geselecteerd, die vervolgens kunnen worden gegroepeerd op basis van hun expressie van glycoproteïne 38 en CD133. De gp38-positieve CD133-positieve en de gp38-negatieve CD133-positieve cellen vormen de meest abundante celpopulaties onder de CD45-negatieve CD31-negatieve ASGPR1-negatieve cellen in de lever van een gezonde volwassen muis, met duidelijke verschillen in hun expressie van diverse oppervlaktemarkers die eerder met progenitorcellen werden geassocieerd. De isolatie van deze progenitorcellen op basis van magnetische microbeads, zoals zojuist gedemonstreerd, resulteert in een zuiverheid van de levercellen van meer dan 90% met een hoge mate van viabiliteit.

Bij het isoleren van deze zeldzame cellen is het belangrijk om rekening te houden met de enzymen die tijdens de stappen voor leverdigestie worden gebruikt, aangezien verschillende enzymen bij voorkeur specifieke progenitor-subpopulaties kunnen opleveren en de expressieniveaus van CD133 sterk kunnen verminderen. Het is belangrijk om te onthouden dat de celzuiverheid en opbrengst afhankelijk zijn van de zorgvuldige bereiding van de enkelcel-suspensies van de lever. Daarnaast kan een grote hoeveelheid cellulair debris en contaminatie door afstervende cellen het succes van dit protocol negatief beïnvloeden.