Fabricage van Driedimensionale Paper-based microfluïdische apparaten voor een immunoassay

Het algemene doel van dit protocol is om ons proces voor het vervaardigen van driedimensionale apparaten op basis van papier te demonstreren, die wij gebruiken als platform voor de ontwikkeling van immunoassays voor point-of-care. Deze methode biedt een papieren microfluïdisch platform met een betrouwbaar productieproces, zodat tijd en inspanning kunnen worden gericht op de ontwikkeling van assays in plaats van op het ontwerpen van apparaten. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat het mogelijk maakt om veel apparaten parallel en in een hoeveelheid te bereiden die wenselijk is voor academische onderzoeksprojecten.

Over het algemeen zullen nieuwe gebruikers moeite hebben met deze methode, omdat er veel variabelen in overweging moeten worden genomen bij het vervaardigen van apparaten, zoals de juiste uitlijning van lagen. Fouten kunnen leiden tot apparaten die niet naar behoren functioneren. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de assemblage moeilijk voor te stellen kan zijn op basis van alleen de details in manuscripten.

Bereid eerst lagen kwalitatief filterpapier voor door een voorraadvel papier op een standaardformaat te snijden om het patroon aanbrengen met een waxprinter te vergemakkelijken. Plaats een gesneden vel papier in het printervak. Print vervolgens de eerder ontworpen lagen.

Snijd vervolgens een voorraadrol nylon membraan in vellen met een tafelmodel papiersnijder, waarbij u uiterst voorzichtig met het nylon membraan omgaat om de integriteit te behouden en scheuren te voorkomen. Bewaar ongebruikt materiaal in een exsiccaatkast, aangezien nylon membranen gevoelig zijn voor vocht. Print met een waxprinter een patroon voor de vanglaag op een vel kopieerpapier en plak dit met tape op een lichtbak om als gids te dienen voor het positioneren van het nylon membraan.

Plaats vervolgens een schoon vel kopieerpapier op het eerder geprinte vel kopieerpapier. Plak het schone vel papier op de lichtbak, maar plak de twee vellen niet aan elkaar vast. Plaats nu een uitgesneden stuk nylonmembraan op het schone vel kopieerpapier, waarbij u ervoor zorgt dat het membraan het geprinte gebied van de onderste laag kopieerpapier bedekt.

Plak alle vier de zijden van het nylon membraan aan het schone vel kopieerpapier. Plaats een vel nylon membraan, ondersteund door het vastgeplakte kopieerpapier, in de handmatige invoervak van de printer. Print vervolgens één nylon membraan per keer.

Plak de geprinte lagen op een acrylaatframe voor een gelijkmatige verhitting boven en onder de laag wanneer deze in een convectieoven met natuurlijke convectie wordt geplaatst. Plaats de lagen vervolgens 30 seconden lang in de oven op 150 °C totdat de was in de dikte van het papier is gesmolten. Controleer na het uitnemen van het papier uit de oven of de was volledig door de dikte van het papier is gedrongen door het papier om te draaien en te controleren op onvolkomenheden in het ontwerp.

Verwijder het papier en het nylon membraan uit het acrylframe. Verwijder vervolgens het nylon membraan van het ondersteuningsvel kopieerpapier met een papiersnijder. Snijd dubbelzijdige vellen adhesiefilm in de gewenste patronen met een robotische snijplotter met behulp van vooraf voorbereide ontwerpbestanden.

Plak daarna een patroonlaag papier die met kleefstof moet worden voorzien, met de bedrukte zijde naar beneden op een lichtbak. Trek de beschermende folie van één zijde van het kleefvel voor het patroon af. Druk het kleefvel voor het patroon en de papierlaag tegen elkaar aan.

Plaats vervolgens het gedeeltelijk geassembleerde apparaat in een beschermende huls. Haal daarna de resulterende tweelaagse assemblage door een automatische lamineermachine om de kleefstof en het papier volledig op elkaar te persen, waarbij eventuele luchtbellen tussen de samengevoegde lagen worden verwijderd. Plak een conjugaatlaag op een acrylframe, zodanig dat de te behandelen hydrofiele zone is opgehangen en geen contact maakt met het frame.

Voeg 2,5 µL BSA en 1X PBS toe aan de hydrofiele zone op de conjugaatlaag. Laat het monster twee minuten drogen bij kamertemperatuur en droog het vervolgens vijf minuten bij 65 °C. Voeg daarna vijf µL van de 5 OD colloïdale goudnanodeeltjes geconjugeerd aan anti-beta hCG-antilichamen toe en herhaal het droogproces.

Plak een laterale kanaallaag op een acrylframe zodanig dat de te behandelen hydrofiele zone is opgehangen en geen contact maakt met het frame. Voeg 10 µL blokkeringsmiddel toe om het laterale kanaal te behandelen en herhaal vervolgens hetzelfde droogproces als gebruikt voor de conjugaatlaag. Plak daarna een vangstlaag op een acrylframe zodanig dat de te behandelen hydrofiele zone is opgehangen en geen contact maakt met het frame.

Behandel de captuurlaag met vijf µL anti-alfa hCG-antilichaam. Laat het monster twee minuten drogen bij kamertemperatuur en droog het vervolgens acht minuten bij 65 °C. Voeg twee µL blokkeringsmiddel toe en herhaal daarna hetzelfde droogproces als voor de captuurlaag.

Plak de wasslaag op de lichtbak met de bedrukte zijde naar boven gericht. Indien er uitlijningsgaten worden gebruikt, moeten deze uit volgende lagen worden verwijderd met een handmatige pons. Verwijder de beschermfolie op de achterzijde van de vanglaag om de kleefstof bloot te leggen.

Lijn de capturelaag boven de waslaag uit met de uitlijningsgaten als gids, druk vervolgens de twee lagen tegen elkaar en vermijd contact met de hydrofiele zones om contaminatie of beschadiging van het device te minimaliseren. Verwijder daarna de beschermende folie op de achterzijde van de incubatielaag om de kleefstof bloot te leggen. Lijn de incubatielaag boven de capturelaag uit en druk ze tegen elkaar.

Ga op deze manier door met het toevoegen van lagen totdat alle actieve lagen zijn samengesteld. Plaats het gedeeltelijk geassembleerde apparaat nu in een beschermhoes en bevestig de lagen stevig aan elkaar met een lamineermachine. Verwijder de beschermende folie aan de achterzijde van de waslaag en bevestig de blotlaag aan de onderkant van het apparaat.

Nadat het lamineren is voltooid om de assemblage van het driedimensionale papieren microfluïdische apparaat af te ronden, knipt u met een schaar het gewenste aantal apparaten uit de vellen van volledig geassembleerde apparaten. Voeg 20 µL van een positieve controlemonster van hCG-buffer toe aan de hydrofiele zone bovenop het apparaat. Zodra het monster volledig in het apparaat is ingetrokken, voegt u 15 µL wasbuffer toe.

Nadat de eerste aliquot wasbuffer volledig in het apparaat is ingetrokken, wordt een tweede aliquot van 15 microliter wasbuffer toegevoegd. Om de resultaten van de assay zichtbaar te maken, worden de drie bovenste lagen van het apparaat met een pincet verwijderd om de captuurlaag bloot te leggen. De methode van waxprinting kan worden gebruikt om hydrofobe barrières in papieren microfluïdische apparaten te vormen en produceert vloeistofpaden met reproduceerbare afmetingen, wat essentieel is voor assays met reproduceerbare prestaties en duurstijden.

De prestaties van de hCG papier-gebaseerde immunoassay werden aangetoond door 35 positieve en 35 negatieve assays parallel uit te voeren. De variatiecoëfficiënt voor elke dataset werd bepaald op 1% voor assays uitgevoerd met negatieve monsters en 3% voor assays uitgevoerd met positieve monsters. Een verkeerde uitlijning tussen de lagen die het incubatiekanaal en de vangzone vormen, kan leiden tot de ontwikkeling van een onregelmatig patroon in het positieve signaal, wat kan resulteren in een verkeerde interpretatie van het kwalitatieve signaal.

Indien de was niet in voldoende hoeveelheid wordt geprint of niet volledig door de dikte van het papier wordt gesmolten, kan de integriteit van de resulterende hydrofobe barrières worden aangetast, wat kan leiden tot lekken binnen het apparaat. Assays die langer duren dan verwacht, kunnen duiden op een defect in de fabricage van een apparaat. Op papier gebaseerde microfluïdische apparaten bieden onderzoekers een veelzijdig platform voor de ontwikkeling van betaalbare analytische point-of-care-tests.

Hoewel er verschillende toepassingen bestaan, resulteert de hier gedemonstreerde aanpak in een algemene apparaatarchitectuur voor het uitvoeren van immunoassays, die cruciaal zijn in de gezondheidszorg. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te controleren op imperfecties tijdens het fabricatieproces en voordat de lagen worden behandeld met kostbare biochemische reagentia. Zodra deze methode, van het printen van lagen tot het assembleren van behandelde lagen, onder de knie is, kan deze worden gebruikt om binnen twee uur een vel functionele immunoassays voor te bereiden.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in het vervaardigen van driedimensionale apparaten op papierbasis, en bent u bekwaam genoeg om dit platform aan te passen voor andere relevante assay-typen.