Polydimethylsiloxaan-polycarbonaat microfluïdische apparaten voor mobiele Migration Studies Onder Perpendicular Chemical en zuurstof verlopen

Het algemene doel van dit experiment is het opzetten van een microfluïdisch apparaat van polydimethylsiloxaan-polycarbonaat voor de migratie van zoogdiercellen onder verschillende combinaties van loodrechte chemische gradiënten en zuurstofgradiënten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in studies naar de migratie van zoogdiercellen, waaronder de effecten van deze gradiënten op de migratie van verschillende celtypen of cellen met andere genen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de gehele experimentele opstelling kan worden uitgevoerd in een conventionele incubator voor optimale celkweekcondities, zonder tijdrovende installatie en omvangrijke instrumentatie.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van het metastasevermogen van kankercellen, aangezien celmotiliteit en diverse fysiologisch gerelateerde gradiënten gekarakteriseerd kunnen worden met behulp van het microfluidische apparaat. Deze methode kan inzicht verschaffen in de migratie van zoogdiercellen. Daarnaast kan deze worden toegepast op andere celstudies, zoals in vitro celgebaseerde drugstesten op combinaties van drugconcentraties en zuurstofspanningen.

Breng twee gram polydimethylsiloxaan, of PDMS-prepolymeer, aan op de mal met de vloeistofkanaalpatronen van de bovenlaag om een dunne laag PDMS te vormen. Plaats de mal vervolgens in een desiccator-opstelling om het PDMS gedurende 60 minuten te ontgassen. Plaats de mal na het ontgassen overnacht in een oven op 60-graden Celsius voor het uitharden van het PDMS.

Zorg ervoor dat de mal in een horizontaal vlak staat. Nadat de mal is afgekoeld tot kamertemperatuur, giet u nog eens 13 gram PDMS-prepolymeer op de mal en ontgast u de PDMS gedurende 60 minuten in de desiccator-opstelling. Bedrijf langzaam een één millimeter dikke polycarbonaat- of PC-folie in de verse PDMS-laag als gasdiffusiebarrière.

Verwijder eventuele aanwezige luchtbellen. Plaats de mal vervolgens gedurende de nacht in de oven op 60 °C. Zorg ervoor dat de mal op een horizontaal vlak staat.

Nadat het uitgeharde PDMS is afgekoeld tot kamertemperatuur, snijdt u het apparaat met een scalpel bij tot een oppervlakte van ongeveer 5,5 bij vijf vierkante centimeter, zodat alle kanaalpatronen bedekt zijn. Pel vervolgens de PDMS-laag van de mal. Maak daarna gaten voor de in- en uitlaten met een biopsietang met een diameter van twee millimeter.

Bewaar de vervaardigde bovenste PDMS-PC-laag stofvrij voor latere assemblage. Om het apparaat te assembleren, plaatst u eerst de vervaardigde PDMS-PC-bovenlaag en de wafer met het spin-gecoate PDMS-membraan in een zuurstofplasmamachine voor oppervlaktebehandeling, waarbij de verbindingsoppervlakken naar boven zijn gericht. Behandel de PDMS-oppervlakken gedurende 40 seconden met 90 watt zuurstofplasma.

Hecht de bovenste laag onmiddellijk na de zuurstofplasmapreparatie van het oppervlak aan het PDMS-membraan. Plaats een gewicht bovenop de gehechte lagen en plaats deze gedurende de nacht in een oven op 60 °C om de hechting te bevorderen. Zodra de gehechte lagen zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, snijdt u met een scalpel het membraan dat aan de bovenste laag is gehecht uit tot een oppervlak van ongeveer 5,5 bij 5 vierkante centimeter.

Pel de gebonden structuur van de siliciumwafer en pons gaten bij de in- en uitlaten van het chemische gradiëntkanaal met een biopsiepons van twee millimeter diameter. Plaats vervolgens de membraangebonden bovenlaag en de gefabriceerde PDMS-onderlaag in de zuurstofplasmabehandelingsmachine met de bondingsvlakken naar boven gericht. Gebruik om de PDMS-oppervlakken te activeren het plasma bij 90 watt gedurende 40 seconden.

Bevestig de boven- en onderlaag direct na de oppervlaktebehandeling aan elkaar voor de bonding. Plaats het gewicht bovenop het gehele gebonde apparaat en laat dit een nacht in een oven van 60-degree Celsius staan. Haal de volgende dag het volledige gefabriceerde apparaat uit de oven en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.

Start de microfluïdische celmigratie-assay met de preparatie van de cellen in het apparaat, zoals beschreven in het tekstprotocol. Aspireer op dag twee het medium van de cellen die sinds dag nul zijn gekweekt en was de cellen twee keer met vijf milliliter DPBS. Aspireer de DPBS en voeg twee milliliter Trypsin-EDTA toe, en incubeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten in de incubator om de cellen van het flaskoppervlak los te maken.

Zodra de cellen zijn losgekoppeld en in de oplossing zijn gesuspendeerd, voegt u acht milliliters serumvrij medium toe aan de kolf. Draag alle vloeistoffen over naar een 15-milliliter conische buis en centrifugeer deze 5 minuten bij 140 ×g bij kamertemperatuur. Aspireer na centrifugatie het supernatant en voeg een passende hoeveelheid serumvrij medium toe voor een uiteindelijke celdichtheid van één miljoen cellen per milliliter.

Haal vervolgens het microfluïdische apparaat eruit dat op dag één is voorbereid, zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik een spuit van 1 ml met een stompe 14-gauge naald om het serumvrije medium via de uitlaat van het chemische gradiëntkanaal te injecteren, totdat het medium uit beide naalden bij de inlaatten stroomt. Injecteer vervolgens 200 µL van de celsuspensie via de uitlaat van het chemische gradiëntkanaal.

Observeer de celkweekkamer in het apparaat onder een microscoop om te bevestigen dat de cellen in het microfluïdische kanaal zijn gebracht. Plaats het apparaat vervolgens in een bevochtigde container en bewaar het gedurende vijf uur in een celkweekincubator om de adhesie van de cellen op het oppervlak van het apparaat te bevorderen. Bereid ondertussen de chemische stof voor in de gewenste concentratie in serumvrij medium.

Trek het serumvrije medium met en zonder de chemische stof op in twee aparte spuiten van drie milliliter die zijn verbonden met de hoogzuivere slang. Plaats vervolgens de spuiten op een spuitpomp met een stroomsnelheid van één microliter per minuut voor later gebruik. Maak daarna 15 milliliter van een een-molaire natriumhydroxide-oplossing en 15 milliliter van een pyrogallol-oplossing van 200 milligram per milliliter.

Zuig de natriumhydroxide-oplossing op in een spuit van 15 milliliter die is verbonden met een PTFE-slang van hoge zuiverheid en zuig de pyrogallol-oplossing op in een spuit van 15 milliliter die is verbonden met een slang van hoge zuiverheid. Plaats de spuiten op een spuitenpomp met een stroomsnelheid van vijf microliters per minuut voor later gebruik. Haal na de incubatie van vijf uur het volledige apparaat eruit en plaats het op een Petri-schaal met een diameter van 15 centimeter.

Bevestig het apparaat in de Petrischaal met kneedbaar plakmiddel en plaats de Petrischaal vervolgens in een live-cell imaging microscoop in een incubator. Verbind de slangetjes van de spuiten met de inlaatopeningen van het chemische gradiëntenkanaal voor het genereren van de chemische gradiënt. Verbind vervolgens de uitlaat met het slangetje dat naar een afvalreservoir leidt.

Zet de spuitenpomp met de spuiten voor het genereren van de chemische gradiënt aan. Sluit vervolgens de hoogzuivere slangetjes van de spuiten met natriumchloride en pyrogallol aan op de inlaatopeningen van het zuurstofgradiëntkanaal. Sluit de slang aan op de uitlaat om het afval op te vangen en zet de spuitenpomp met de spuiten voor het genereren van de zuurstofgradiënt aan.

Voeg ongeveer 15 milliliter dubbel gedestilleerd water toe aan de Petrischaal om het apparaat vochtig te houden. Stel vervolgens de live-cell imaging microscoop in voor time-lapse beeldopname en maak elke 15 minuten een opname. Voer de gegevensverzameling en analyse, evenals de karakterisering van gradiënten, uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

Hier worden representatieve resultaten getoond van chemische gradiënten die zijn gegenereerd in het microfluïdische apparaat voor celmigratie. Het resultaat van de numerieke simulatie komt goed overeen met de experimentele karakterisering waarbij een fluoresceïne-oplossing als chemische stof is gebruikt. De gradiënten van andere chemische stoffen, zoals het chemokine SDF-1 alpha, kunnen vooraf worden geschat met behulp van de simulatie.

Zuurstofgradiënten die in het apparaat worden opgewekt, kunnen experimenteel worden gekarakteriseerd met behulp van een zuurstofgevoelige fluorescentiekleurstof. Doorgaans kunnen zuurstofgradiënten van 1% stroomopwaarts tot 16% stroomafwaarts stabiel worden vastgesteld binnen het apparaat. Hier worden typische time-lapse beelden getoond die tijdens de experimenten zijn verzameld met een live-cell imaging microscoop.

Na de beeldanalyse kunnen de migratietrajecten van A549-cellen en hun gemiddelde bewegingen worden berekend. In afwezigheid van gradiënten vertonen de cellen een willekeurige migratie en ligt de gemiddelde beweging dicht bij nul. Bij een gradiënt van uitsluitend SDF-1 alpha chemokine vertonen de cellen chemotactisch gedrag en migreren ze, zoals verwacht, in de richting van de hoge chemokinegradiënt.

Bij een uitsluitend zuurstofgradiënt bewegen de cellen zich in de richting van de lage zuurstofconcentratie, wat wijst op een aerotactisch gedrag dat bij zoogdiercellen nog onvoldoende is bestudeerd. Interessant is dat de cellen bij de aanwezigheid van zowel een chemokine- als een zuurstofgradiënt zich in de richting van de lage zuurstofgradiënt bewegen, wat aantoont dat de zuurstofgradiënt dominante effecten heeft. Deze waarneming vereist verder onderzoek.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het apparaat tijdens de fabricage goed waterpas moet worden gezet en dat luchtbellen in de opstelling van het microfluïdische apparaat tijdens het celmigratie-experiment moeten worden geëlimineerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een PDMS-PC microfluïdisch apparaat prepareert en de experimenten opstelt om de migratie van zoogdiercellen onder combinaties van chemische en zuurstofgradiënten te bestuderen.