Polydimethylsiloxaan-polycarbonaat microfluïdische apparaten voor mobiele Migration Studies Onder Perpendicular Chemical en zuurstof verlopen

Het algemene doel van dit experiment is om een polydimethylsiloxaan-polycarbonaat microfluïdisch apparaat te ontwikkelen voor migratie van zoogdiercellen onder verschillende combinaties van loodrecht chemische en zuurstofgradienten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in onderzoek naar migratie van zoogdiercellen, inclusief de effecten van deze gradienten op de migratie van verschillende celtypen of cellen met ote-genen. Het grote voordeel van deze techniek is dat de hele experimentele setup kan worden uitgevoerd in een conventionele incubator voor optimale celkweekcondities zonder omslachtige instelling en omvangrijke instrumentatie.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van de metastasecapaciteit van kankercellen, aangezien de celmobiliteit en de verschillende fysiologisch gerelateerde gradienten kunnen worden gekenmerkt met behulp van het microfluïdische apparaat. Deze methode kan inzichten bieden in de migratie van zoogdiercellen. Het kan ook worden toegepast op andere celstudies, zoals in vitro cel-gebaseerde medicijntesten op combinaties van medicijnconcentraties en zuurstofspanningen.

Breng twee gram polydimethylsiloxaan, of PDMS-pre-polymeer, aan op de mal met de patroon van de vloeistofkanaal in de bovenste laag om een dunne laag PDMS te maken. Plaats vervolgens de mal in een exsiccator-setup om het PDMS gedurende 60 minuten te ontgassen. Na ontgassing plaats je de mal een nacht in een oven van 60 graden Celsius voor het uitharden van PDMS.

Zorg ervoor dat de mal in een horizontale vlak staat. Nadat de mal is afgekoeld tot kamertemperatuur, giet je nog eens 13 gram PDMS-pre-polymeer op de mal en ontgas je het PDMS in de exsiccator-setup gedurende 60 minuten. Laat vervolgens langzaam een dun polycarbonaat of PC-film van één millimeter dik in de verse PDMS-laag inbedden als gasdiffusie-barrière.

Verwijder eventuele luchtbellen die aanwezig zijn. Plaats vervolgens de mal een nacht in de oven van 60 graden Celsius. Zorg ervoor dat de mal op een horizontaal vlak staat.

Nadat de uitgeharde PDMS is afgekoeld tot kamertemperatuur, snijd je het apparaat met een scalpel tot een oppervlakte van ongeveer 5,5 bij vijf vierkante centimeter die alle kanaalpatroon kan bedekken. Schil vervolgens het PDMS-lab van de mal. Boor vervolgens gaten voor inlaten en uitlaten met een biopsiepomp met een diameter van twee millimeter.

Bewaar de gefabriceerde bovenste PDMS-PC-laag ver weg van omgevingsstof voor latere assemblage. Om het apparaat samen te stellen, plaats je eerst de gefabriceerde PDMS-PC bovenlaag en de wafer met de spin-gecodeerde PDMS-membraan in een zuurstofplasma-oppervlaktebehandelingsmachine met de hechtoppervlakken naar boven. Behandel de PDMS-oppervlakken met 90 watt zuurstofplasma gedurende 40 seconden.

Hecht de bovenste laag onmiddellijk na de zuurstofplasma-oppervlaktebehandeling aan de PDMS-membraan. Plaats een gewicht op de bovenkant van de gebonden lagen en plaats ze een nacht in een oven van 60 graden Celsius om de binding te bevorderen. Zodra de gebonden lagen zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, snijd je het membraan dat aan de bovenlaag is gebonden met een scalpel tot een oppervlakte van ongeveer 5,5 bij vijf vierkante centimeter.

Schil de gebonden structuur van de siliciumwafer en maak gaten bij de inlaten en uitlaten van het chemische gradiëntkanaal met een biopsiepomp met een diameter van twee millimeter. Plaats vervolgens de membraangebonden bovenlaag en de gefabriceerde PDMS-onderlaag in de zuurstofplasma-oppervlaktebehandelingsmachine met de hechtoppervlakken naar boven. Gebruik de plasma op 90 watt gedurende 40 seconden om de PDMS-oppervlakken te activeren.

Voeg de bovenste en onderste lagen onmiddellijk na de oppervlaktebehandeling samen voor binding. Plaats het gewicht op de bovenkant van het gehele gebonden apparaat en laat het een nacht in een oven van 60 graden Celsius. De volgende dag haal je het gehele gefabriceerde apparaat uit de oven en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.

Begin de microfluïdische celmigratietest met de voorbereiding van de cellen in het apparaat zoals beschreven in het tekstprotocol. Op dag twee, zuig het medium uit de cellen die sinds dag nul zijn gekweekt en was de cellen twee keer met vijf milliliter DPBS. Zuig het DPBS en voeg twee milliliter Trypsin-EDTA toe, vervolgens incubeer de cellen in de incubator gedurende vijf minuten om de cellen los te maken van het flesoppervlak.

Zodra de cellen los zijn gemaakt en gesuspendeerd in de oplossing, voeg je acht milliliter serumvrij medium toe aan de fles. Breng alle vloeistoffen over in een 15-milliliter conische buis en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 140 keer G op kamertemperatuur. Na de centrifugatie zuig je het supernatant en voeg je een geschikte hoeveelheid serumvrij medium toe voor een eindceldichtheid van één miljoen cellen per milliliter.

Neem vervolgens het microfluïdische apparaat dat op dag een is voorbereid, zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik een ene-milliliter spuit met een stompe 14-gauge naald om het serumvrije medium door de uitlaat van het chemische gradiëntkanaal te injecteren totdat het medium uit beide naalden bij de inlaten stroomt. Injecteer vervolgens 200 microliter van de celsuspensie vanuit de uitlaat van het chemische gradiëntkanaal.

Bekijk de celkweekkamer in het apparaat onder een microscoop om te bevestigen dat de cellen zijn geïntroduceerd in het microfluïdische kanaal. Plaats vervolgens het apparaat in een vochtige container en bewaar het in een celkweekincubator gedurende vijf uur om de hechting van de cellen aan het apparaatoppervlak te bevorderen. Bereid ondertussen het chemisch middel in de gewenste concentratie in serumvrij medium voor.

Zuig het serumvrije medium met en zonder het chemisch middel op in twee afzonderlijke drie-milliliter spuiten die zijn verbonden met de hoge-zuiverheidsgraad buis. Stel vervolgens de spuiten in op een spuitpomp met een stromingssnelheid van één microliter per minuut voor later gebruik. Maak