Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo's

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van de elektrische eigenschappen van prikkelbare cellen onder niet-invasieve fysiologische omstandigheden, waarbij gebruik wordt gemaakt van zebravissenembryo's in combinatie met een FRET-gebaseerde GEVI. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de biologie van prikkelbare cellen, zoals neuronen. Zo kan deze methode worden gebruikt om de rol van prikkelbaarheid bij de pathogenese van neurologische aandoeningen te analyseren.

Deze aanpak maakt gebruik van transparante zebravisembryo's die FRET-gebaseerde, genetisch gecodeerde spanningsindicatoren tot expressie brengen. Deze methode maakt het mogelijk om de elektrische eigenschappen van cellen in vivo op een niet-invasieve manier te meten. Zo kan deze methode inzicht bieden in de exciteerbaarheid van spinale neuronen in zebravisembryo's.

Het kan ook worden toegepast op andere in-vitro- of in-vivo-systemen die geschikt zijn voor beeldvormingsstudies. Begin deze procedure door het PCR-mengsel voor te bereiden om de coderende sequentie van de Mermaid-biosensor te amplificeren. Verhit het PCR-mengsel gedurende 15 seconden bij 95 °C.

Voer een priming uit gedurende 15 seconden bij 50 °C en elongatie gedurende vier minuten bij 72 °C voor in totaal 35 cycli. Zuiver daarna het specifieke blunt PCR-product via gelpurificatie met behulp van een commerciële gelpurificatiekit. Clone vervolgens het DNA-fragment in de pCMV-SC blunt vector en lineariseer het Mermaid-positieve plasmide met het restrictie-enzym SmaI voor de insertie van de HuC-promotor.

Stel de restrictiereactie op in een totaalvolume van 20 µL en incubeer de reactie gedurende één uur bij 25 °C. Zuiver vervolgens het gedigereerde plasmide via gelfractionering met behulp van een commerciële gelzuiveringskit. Amplificeer daarna de HuC-promotor via PCR met PFU DNA-polymerase en zebravis-genomisch DNA als template.

Stel het PCR-mengsel samen. Na een initiële stap van twee minuten bij 95 °C, wordt het PCR-mengsel 15 seconden verhit bij 95 °C. Voer vervolgens een annealing-stap uit van 15 seconden bij 50 °C en een elongatie-stap van vier minuten bij 72 °C, voor een totaal van 35 cycli.

Zuiver vervolgens het specifieke blunt PCR-product via gelpurificatie. Ligereer een equimolaire hoeveelheid van het gezuiverde pCMV-SC Mermaid- en pHuC-DNA met gebruik van 1 µL T4 DNA-ligase en 1 µL van de specifieke 10x buffer in een totaalvolume van 10 µL. Incubeer de reactie daarna gedurende 16 uur bij 4 °C.

Transformeer een aliquot competente cellen met vijf µL van de ligatiereactie. Selecteer de pHuC-positieve klonen met de promoter in de juiste oriëntatie door middel van een CEL1-EcoRV dubbele digestie. Overbreng de klonen naar 15-ml buisjes en incubeer ze gedurende de nacht bij 37 °C.

Extraheer daarna het plasmide uit de cellen, stel de CEL1-EcoRV dubbele restrictiereactie op en incubeer deze gedurende één uur bij 37 °C. Voer vervolgens de reacties uit op een agarosegel. Breng bij deze procedure de bevruchte eieren, verkregen van volwassen wildtype of sod1G93R zebravisjes, over naar een Petri-schaal van 10 mm.

Spoel de embryo's in koud viswater. Micro-injecteer ze vervolgens onmiddellijk in de dooier met 200 picogram pHuC-Mermaid-plasmide. Breng de embryo's daarna over naar een Petrischaal en incubeer ze in viswater bij 28 graden Celsius totdat ze het gewenste ontwikkelingsstadium voor de volgende analyses hebben bereikt.

Voor een analyse van spontane staartkrulling worden de embryo's overgebracht naar een ronde Petrischaal van 90 millimeter gevuld met viswater dat 0,2% DMSO bevat. De choriën worden vervolgens handmatig verwijderd met behulp van twee pincetten met scherpe punten of naalden. Incubeer de embryo's daarna gedurende vijf minuten bij 28 graden Celsius.

Detect met een digitale camera die op een stereomicroscoop is gemonteerd de staartkrulling bij kamertemperatuur gedurende een video-opname van één minuut. Verwerf vervolgens de tijdreeks met een tijdsresolutie van 30 frames per seconde. Bereken daarna de frequentie van spontane staartkrullingen door het aantal buigingen per tijdseenheid te tellen.

Om het effect van het geneesmiddel riluzol te evalueren, worden de embryo's overgebracht naar een nieuwe Petri-schaal van 90 millimeter, gevuld met viswater dat vijf micromolar riluzol bevat. Incubeer de embryo's vervolgens gedurende vijf minuten bij 28 °C voordat er een video van één minuut wordt opgenomen en de gedragsanalyse wordt uitgevoerd. Monteer vervolgens de embryo's van 20 tot 24 hpf in één procent laagsmeltende agarose in viswater in een imaging-schaal van 35 millimeter met glazen bodem bij 37 °C.

Plaats de embryo's op hun zijkant en wacht tot de agarose op kamertemperatuur is gestold. Plaats vervolgens de imaging-schaal op de tafel van een confocale microscoop. Identificeer de motorneuronen die de biosensor tot expressie brengen door monomere Umikinoko-Green te exciteren met een argonlaser van 488 nanometer.

Stel vervolgens de emissie in tussen 495 en 525 nanometer en druk op opnemen. Voor een FRET-meting wordt mUKG, de donor van het FRET-paar, geëxciteerd met de 488 nanometer laser. Detecteer gelijktijdig met behulp van twee fotomultipliers de fluorescentie die door de donor wordt uitgezonden en de fluorescentie die door de monomerische Kusibira-Orange-acceptor wordt uitgezonden.

Optimaliseer aan het begin van het experiment de gain en offset van fotomultiplikator één, waar de mUKG-fluorescentie wordt geregistreerd, en houd deze gedurende de hele sessie constant. Om de offset in te stellen, verandert u de kleur van de afbeelding naar intensiteitswaarden door de Q-opzoektabel te gebruiken. Gebruik tijdens het scannen met de laser uit de offset-schuifregelaar zodat de achtergrondpixels een intensiteit hebben die iets hoger is dan nul.

Schakel de laser in met behulp van dezelfde opzoektabel. Gebruik tijdens het scannen de gain-schuifregelaar om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren, waarbij u er alert op bent verzadigde pixels te vermijden. Selecteer in het acquisitievenster van de software de xyt-acquisitiemodus en een beeldveldformaat van 512 bij 64 pixels uit het vervolgkeuzemenu.

Stel vervolgens de registratie van de spanningsveranderingen in de spinale neuronen van het embryo in om gedurende één minuut elke 30 milliseconden een enkel XY-vlak vast te leggen. Om het effect van de toediening van riluzol op de membraandepolarisatie in hetzelfde neuron te evalueren, wordt een nieuwe dataset verkregen vijf minuten na toevoeging van viswater dat vijf micromolair riluzol bevat. In deze film werden spontane coilings — motorische reacties die uitsluitend bestaan uit een volledige lichaamscontractie waarbij de punt van de staart naar de kop wordt gebracht — geregistreerd in de fase van 20 tot 24 hpf in regulair vismedium.

Deze film toont de spontane krullingen van een embryo na incubatie in vijf micromolair riluzol. Om te testen of veranderingen in de elektrische activiteit van de spinale motorneuronen de basis vormden voor de door riluzol geïnduceerde veranderingen in de frequentie van de spontane krullingen, werd het membraanpotentiaal in spinale motorneuronen van het embryo op een volledig niet-invasieve wijze bestudeerd door de fluorescentie-intensiteitsverhouding van het donor-acceptor FRET-paar van de Mermaid-biosensor te meten. Primaire spinale motorneuronen die de biosensor tot expressie brachten, werden geïdentificeerd en hun basale spontane depolarisatieactiviteiten werden geregistreerd.

Samen met de afname in de frequentie van staartkrulbewegingen verminderde de toediening van riluzol de frequentie van spontane depolarisatiegebeurtenissen. Zodra deze methode onder de knie is, stelt deze onderzoekers in staat om de elektrische eigenschappen van de neurale netwerken van intacte embryo's te bestuderen, waarbij de complexiteit van interacties tussen cellen in het ontwikkelende functionele systeem volledig behouden blijft. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de elektrische activiteit van de spinale neuronen correleert met de frequentie van de spontane staartkrulbewegingen.