Name: Met behulp van synthetische biologie levende cellen Engineer die interface met programmeerbare Materials (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer hoe je E. coli genetisch kunt modificeren om programmeerbare materiaaloppervlakken te manipuleren. Deze methode combineert synthetische biologie met oppervlakfunctionalisatie voor toepassingen in moleculaire geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs dankbaar steun van award FA9550-13-1-0108 uit de Air Force Office van Wetenschappelijk Onderzoek van de Verenigde Staten te erkennen. De auteurs bovendien steun van award N00014-15-1-2502 erkennen van het Office of Naval Research van de Verenigde Staten, de financiering van het Instituut voor Technologie en kritische Applied Science aan de Virginia Polytechnic Institute and State University, en van de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, award nummer 1.607.310.

<ol><li>Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+Surface+Chemistry+with+Engineered+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Programming Surface Chemistry with Engineered Cells.</a> ACS Synth. Biol. , (2016).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+graphene+oxide+films+used+as+matrix+of+MALDI-TOF-MS+for+detection+of+octachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165, 1255-1266 (2016).</li>
<li>Bähring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Sensing+Properties+of+a+Self-Assembled+Supramolecular+Oligomer%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer.</a> Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).</li>
<li>Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+persistence+and+the+optimality+of+run-and-tumble+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis.</a> Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).</li>
<li>Du, J., Shao, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbial+factories+for+synthesis+of+value-added+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering microbial factories for synthesis of value-added products.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).</li>
<li>Kim, H., Kim, M. J. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7365478/">Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm.</a> IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).</li>
<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li>
<li>Heyde, K. C., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Host-Microbiome+Interactions+using+an+in+Silico+Model+of+Biomimetic+Robots+and+Engineered+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells.</a> Sci. Rep. 5, 11988(2015).</li>
<li>Rice, M. K., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+biological+nanomaterials+using+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tech.+Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Creating biological nanomaterials using synthetic biology.</a> Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401(2014).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem. J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Mesulam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramethyl+benzidine+for+horseradish+peroxidase+neurohistochemistry%3A+a+non-carcinogenic+blue+reaction+product+with+superior+sensitivity+for+visualizing+neural+afferents+and+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents.</a> J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).</li>
<li>Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+plug-and-play+methodology+for+constructing+and+modifying+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks.</a> Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Chemical+Synthesis%2C+Assembly%2C+and+Cloning+of+a+Mycoplasma+genitalium+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome.</a> Science. 319, 1215-1220 (2008).</li>
<li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biotin-%28strept%29avidin+system%3A+principles+and+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).</li>
<li>Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob,, Lee, A. J., Sever, Y. J., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+use+of+capture+biotin-streptavidin+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Micro%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay.</a> J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).</li>
<li>Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+Nanosensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Biological+and+Chemical+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species.</a> Science. 293, 1289-1292 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben een nieuwe strategie voor het koppelen van gemodificeerde levende cellen met een gefunctionaliseerd materiaaloppervlak gepresenteerd. Dit werd bereikt door de ontwikkeling van een cellijn die in staat synthetiseren verhoogde biotine wanneer geïnduceerd met IPTG. De verhoogde niveaus van biotine kan dan worden gebruikt om het gefunctionaliseerde oppervlak wijzigen. De protocollen gedetailleerd hoe de E. coli cellijn ingenieur en hoe u twee verschillende gefunctionaliseerde oppervlakken te creëren. ...

Hier melden wij procedures voor de ontwikkeling van een programmeerbare substraat kan reageren op een chemisch signaal van een gemodificeerde cellijn. 1 Wij doen dit door het creëren van een biotine-streptavidine-interface die reageert op biotine geproduceerd door synthetisch gemanipuleerde Escherichia coli (E. coli) cellen. Eerder hebben programmeerbare oppervlakken is ontworpen voor een breed scala aan toepassingen van toxine detectie 2 en point-of-care diagnostiek 3 defensie en veiligheid. 4 Terwijl programmeerbare oppervlakken bruikbaar als sensoren en actuatoren kunnen zijn, kunnen ze &quot;slimmer&quot; worden gemaakt door ze te begiftigen met het vermogen tot aanpassing aan verschillende milieuproblemen. Daarentegen, zelfs eenvoudige micro-organismen, zoals E. coli, inherente flexibiliteit en kunnen reageren op uitdagingen geavanceerde en vaak onverwachte oplossingen. Dit aanpassingsvermogen heeft ingeschakeld E.coli bevolking, bestuurd door hun complexe gen-netwerken, op een kosteneffectieve manier te zoeken middelen, 5 creëren producten met toegevoegde waarde, 6 en zelfs de macht micro-schaal robotica. 7 Door het koppelen van de adaptieve voordelen van levende cellen met behulp van programmeerbare oppervlakken, kunnen we een slimme substraat kan reageren op verschillende omgevingsomstandigheden maken. Synthetische biologie onderzoekers nieuwe mogelijkheden gegeven om het gedrag van levende organismen programmeren. Door engineering van cellen om nieuw gen regulerende netwerken bevatten, kunnen onderzoekers cellen die een reeks van geprogrammeerde gedrag vertonen ontwerpen. 8, 9 voorbij basisonderzoek, kan dit gedrag worden gebruikt voor toepassingen zoals regelend materiaal montage en biologisch produceren van producten met toegevoegde waarde. 10 Hierin we detail hoe we gebruik gemaakt van de instrumenten van de synthetische biologie tot engineer een E. coli-stam die biotine synthetiseert na inductie. Deze stam werd ontwikkeld door gebruikmaking van restrictie-enzym kloneringswerkwijzen een plasmide, pKE1-lad-bioB monteren. Dit plasmide, wanneer getransformeerd in E. coli stam K-12 MG1655, begiftigt cellen met het vermogen om verhoogde niveaus van bioB, een enzym voor biotine synthese drukken. Wanneer getransformeerde cellen werden geïnduceerd met isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en voorzien van een biotine precursor, desthiobiotine (DTB), werden verhoogde niveaus van biotine geproduceerd. De bindingsinteractie biotine met streptavidine is een van de sterkste niet-covalente bindingen in de natuur. Als zodanig, de biotine-streptavidine interactie zowel goed gekarakteriseerd en zeer gebruikt in biotechnologie. 11 Binnen dit manuscript, presenteren we twee strategieën in dienst van de biotine-streptavidine interactie aan te voelen en op te sporen cel geproduceerd biotine met een gefunctionaliseerd oppervlak. Wijverwijzen naar deze contrasterende oppervlakken als &quot;indirecte&quot; en &quot;direct&quot; control regelingen. In de besturing indirecte cel geproduceerd biotine concurreert met biotine dat is geconjugeerd en geïmmobiliseerd op een polystyreen oppervlak voor streptavidine bindingsplaatsen. Bovendien wordt de streptavidine geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP). HRP wijzigt 3, 3 &#39;, 5, 5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB), een optisch signaal, 12 dat kan worden gevolgd door kwantificeren van de spectrale absorptie (dwz optische dichtheid) bij 450 nm (OD 450) te produceren. Zo is de besturing indirect stelt onderzoekers in staat om cellen geproduceerd biotine te meten door het bewaken van de attentuation van de OD 450 signaal. De directe besturing maakt gebruik van de streptavidine-biotine event door immobiliseren streptavidine rechtstreeks op een materiaaloppervlak en waardoor cellen geproduceerd biotine en gebiotinyleerde HRP om te concurreren voor streptavidine bindingsplaatsen. Nogmaals, derelatieve niveaus van cel geproduceerde biotine worden gevolgd door het meten van een OD 450 signaal. Samengevat, de gemanipuleerde cellen en gefunctionaliseerde oppervlakken kunnen we de eigenschappen van een programmeerbare oppervlaktebesturingseenheid door het induceren netwerken in levende cellen. Met andere woorden, hebben we een systeem dat gebruik maakt van het aanpassingsvermogen van levende organismen en de betrouwbaarheid en de specificatie van een aangelegde materiaal-interface door het koppelen van deze systemen gemaakt.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, Minimimal Salts, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Casamino Acids&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate, Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB Turbo Cell Line</td><td>New England Biolabs</td><td>C2984l</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide Primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>25N synthesis, DSL purification</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide, 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Gel Extraction Kits</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle Glass Plating Beads&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Desthiobiotin (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase (HRP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (SA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators&nbsp;</td><td>Viva Products</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate, Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Polystyrene Plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van synthetische biologie levende cellen engineer die interface met programmeerbare materials

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We hebben een abiotische-biotische interface waarmee gemodificeerde cellen aan de materiaaleigenschappen van een gefunctionaliseerd oppervlaktebesturingseenheid ontwikkeld. Dit systeem bestaat, door twee modules: een synthetisch gemodificeerde stam van E. coli cellen en een gefunctionaliseerd materiaal interface. In dit document, we detail een protocol voor genetisch manipuleren geselecteerde gedrag in een stam van E. coli met behulp van moleculaire klonering strategieën. Eenmaal ontwikkeld, dit soort produceert hoge gehalten aan biotine bij blootstelling aan een chemische inductor. Daarnaast hebben we detail protocollen voor het maken van twee verschillende gefunctionaliseerde oppervlakken, waarvan elk kan inspelen op cel gesynthetiseerd biotine. Samengevat presenteren we een methode voor het maken van een gekoppelde, abiotische-biotische systeem waarmee gemanipuleerde cellen materiaalsamenstelling en montage controleren op niet-levende substraten.

Representatieve resultaten zijn weergegeven in de bijgaande vijf figuren. Eerst geven we het klonen grafisch (figuur 1), zodat de lezer visueel kan volgen de kritische stappen voor het creëren van synthetisch gemodificeerde E. coli-stam. Om de populatie dynamiek van de cellen te karakteriseren, bieden we een groeicurve (figuur 2) gegenereerd door de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van de bevolking. Vervolgens tonen we hoe de re...

Dit artikel presenteert een reeks protocollen voor het ontwikkelen van gemanipuleerde cellen en gefunctionaliseerde oppervlakken die het mogelijk maken synthetisch gemanipuleerde E. coli te beheersen en te manipuleren programmeerbare materiaal oppervlakken.

Met behulp van synthetische biologie levende cellen Engineer die interface met programmeerbare Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Het algemene doel van deze procedures is om synthetisch gemodificeerde E.coli te gebruiken om programmeerbare materiaaloppervlakken te beheersen en te manipuleren door genetische modificatie te combineren met strategieën voor oppervlaktefunctionalisering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in vakgebieden zoals de moleculaire geneeskunde en milieumonitoring. Door genetisch geprogrammeerde cellen te gebruiken om een lokale omgeving te interpreteren en een gefunctionaliseerd materiaal dienovereenkomstig aan te passen, bieden we een modulaire tool voor een breed scala aan toepassingen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat levende cellen kunnen fungeren als dynamische sensoren die in staat zijn om de omgevingsomstandigheden via gefunctionaliseerde interfaces te lezen, te verwerken en vast te leggen. Nadat de oplossingen zijn bereid en het biotine-verrijkte supernatant van biotine-producerende E.coli is verzameld volgens het tekstprotocol, worden 1,4 microliters SPDP-oplossing toegevoegd aan 20 microliters streptavidine- of SA-oplossing. Wikkel de buis in aluminiumfolie en incubeer deze gedurende anderhalf uur bij kamertemperatuur, zodat de SPDP-crosslinker zich via een aminogroep aan SA kan binden, waardoor een pyridyldithio-geactiveerde SA wordt gevormd. Voeg na de incubatie 2,4 microliters DTT-oplossing toe aan de buis en incubeer het monster gedurende één uur bij kamertemperatuur om een pyridine-2-thion splitsing mogelijk te maken, resulterend in een sulfhydryl-geactiveerde SA. Voeg vervolgens 7,5 microliters SCC-oplossing toe aan 72 microliters HRP-oplossing, wikkel dit in aluminiumfolie en incubeer het gedurende anderhalf uur bij kamertemperatuur.Dit resulteert in een maleïmide-geactiveerde HRP die gebonden is door een aminogroep. Meng 17 µL LC-LC biotin-oplossing met 200 µL BSA-oplossing, wikkel de buis in folie en incubeer de monster bij kamertemperatuur gedurende anderhalf uur. Deze stap maakt het mogelijk dat biotine via een amidebinding aan BSA conjugateert.Overbreng de SA-SPDP-oplossing, de HRP-SMCC en de BSA-geconjugeerde biotine-oplossing naar afzonderlijke centrifugale concentratoren in spinbuisjes. Centrifugeer de SA-SPDP bij 10.000 ×g totdat het buisvolume 100 µL bereikt of gedurende 16 minuten, en vul het spinbuisje vervolgens aan tot 500 µL met PBS-EDTA voordat het centrifugeren en het toevoegen van PBS-EDTA nog vijf keer wordt herhaald. Nadat de oplossing is gecentrifugeerd tot 100 µL, dient de voorraad bij vier °C te worden bewaard.Centrifuge voor de HRP SMCC de buizen bij 10.000 ×g totdat het volume 25 µL bereikt of gedurende 16 minuten. Vul de centrifugebuis aan tot 4500 µL met PBS voordat het centrifugeren en het toevoegen van PBS nog vijf keer wordt herhaald. Nadat de oplossing is gecentrifugeerd tot 100 µL, dient de voorraadoplossing te worden bewaard bij 4 °C.Centrifuge voor de BSA-biotine het monster op 10.000 ×g totdat het volume 100 µL bereikt of gedurende 12 minuten, en vul de centrifugebuis vervolgens aan tot 500 µL met PBS. Nadat het centrifugeren en het toevoegen van PBS nog vier keer is herhaald, centrifugeert u de buis totdat het volume 100 µL bereikt of gedurende 12 minuten, voeg dan 100 µL PBS toe aan de buis en bewaar de stockoplossing bij 4 °C. Combineer vervolgens 25 µL van de 10 mg/mL HRP met 25 µL van de 10 mg/mL SA-oplossing en bewaar de buis gedurende de nacht bij 4 °C; bereid daarna twee aliquoten BSA-biotine in PBS voor door 10 µL BSA-biotine stock toe te voegen aan 490 µL PBS.Pipetteer 100 µL van de oplossing in elke put van een 96-wellplaat. Wikkel de plaat in folie en incubeer deze gedurende één uur bij 37 °C. Voeg vervolgens 200 µL van 0,5% Tween 80 en BPS toe aan de putten.Incubeer de plaat gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, aspireer vervolgens de vloeistof en schenk deze af. Na het drie maal herhalen van de wasstap, voegt u 200 µL van de 0,5% casing-oplossing toe aan elke well, waarna de plaat gedurende een uur bij 37 °C wordt geïncubeerd. Na nog een ronde wasbehandelingen zoals hiervoor beschreven, mengt u 12 mL van de 0,5% casing-oplossing met 7,5 µL van 0,5% Tween 80; gebruik deze oplossing vervolgens om de SA-HRP-stamoplossing 1:10.000 te verdunnen.Pipetteer 80 µL van de verdunde SA-HRP in elke put van een 96-wells plaat, voeg vervolgens 20 µL van het voorbereide biotinemonster toe aan elke put van de plaat. Incubeer de plaat één uur bij 37 °C. Deze stap maakt competitieve binding mogelijk tussen vrij biotine en geïmmobiliseerd BSA-biotine voor de SA-HRP-bindingsplaatsen.Was daarna de plaat drie keer zoals voorheen en bereid een oplossing van 20 milliliter bestaande uit 50 millimolair natriumacetaat, 1% TMB en 3% waterstofperoxide in een verhouding van 1.000 tot 10 tot één. Voeg 200 microliter van de oplossing toe aan elke well van de plaat, wikkel deze in folie en incubeer op kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Pipetteer 50 microliter twee molair zwavelzuur in elke well om de reactie te stoppen en gebruik vervolgens een plaatlezer om de OD 450 te meten.Voeg, na het bereiden van de oplossingen volgens het tekstprotocol, 7,5 µL LC-LC biotine toe aan 72 µL HRP. Wikkel de oplossing in folie en incubeer het monster gedurende anderhalf uur bij kamertemperatuur onder agitatie. Deze stap zorgt ervoor dat de biotine via een amidebinding aan HRP wordt geconjugeerd.Breng de oplossing over naar een centrifugale concentrator in een spinbuis en centrifugeer de oplossing bij 10.000 ×g totdat het volume 100 µL bereikt of gedurende 12 minuten; vul de spinbuis vervolgens aan tot 500 µL met PBS en herhaal de centrifugatie en bufferadditie vier keer. Voeg daarna 100 µL SA in PBS (0,17 µg/mL) toe aan elke well van een 96-wells plaat. Wikkel de plaat in folie en incubeer deze een uur lang bij 37 °C.Om de wells van de plaat te wassen, pipetteert u 200 µL 0,5% Tween 80 in elke well. Incubeer de plaat twee minuten bij kamertemperatuur en schenk de vloeistof af. Herhaal deze wasstap nog drie keer en voeg vervolgens 200 µL van de 0,5% casing-oplossing toe aan de wells.Incubeer de plaat gedurende één uur bij 37 °C voordat de wells drie keer worden gewassen zoals voorheen. Gebruik de eerder bereide gewassen en geconcentreerde biotin HRP-oplossing om de biotin HRP-stockoplossing 1:10.000 te verdunnen en voeg vervolgens 80 µL van deze oplossing toe aan de wells van een 96-wells plaat. Voeg 20 µL van het voorbereide biotin-monster toe aan elke well van de plaat en incubeer de plaat gedurende één uur bij 37 °C om competitieve binding mogelijk te maken tussen vrije biotin en biotin HRP voor de geïmmobiliseerde SA-bindingsplaatsen.Nadat de wells drie keer op dezelfde wijze zijn gewassen, wordt een oplossing van 20 milliliter bereid bestaande uit 50 millimolaire natriumacetaat, 1% TMV en 3% waterstofperoxide in een verhouding van 1.000 op 10 op 1. Voeg 200 microliters van deze oplossing toe aan elke well van de plaat, dek de plaat af met folie en incubeer deze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 50 microliters twee molar zwavelzuur toe aan elke well om de reactie te stoppen. Gebruik tot slot een platreader om de OD 450 te meten.De gemanipuleerde induceerbare E.coli MG1655 wildtype cellen werden gekweekt en gemonitord in minimaal medium alsovel als in minimaal medium aangevuld met DTB en/of IPTG. Deze grafieken tonen de gemeten OD 600 waarden elke vijf minuten gedurende 24 uur. In dit experiment werd het fluorescerende eiwit mCherry gebruikt in plaats van het bioB-gen, zodat het inductieprofiel gemeten kon worden wanneer de gemanipuleerde cellen met IPTG werden geïnduceerd.Deze resultaten tonen de effectiviteit van het induceerbare gennetwerk aan. Hier zijn de optische signalen bij OD 450 uitgezet als reactie op variërende concentraties biotine voor zowel de indirecte als de directe functionele oppervlakteschema's. In dit experiment werden producten van geïnduceerde genetisch gemodificeerde cellen gebruikt om het functionele oppervlak chemisch te modificeren.De verschillende biotinconcentraties worden gepresenteerd zoals gemeten door het indirecte controleschema van het gefunctionaliseerde oppervlak voor wild-type cellen, niet-geïnduceerde cellen die het pKE1-lacI-bioB-plasmide bevatten en geïnduceerde cellen die het pKE1-lacI-bioB-plasmide bevatten. Eenmaal beheerst, kunnen cellen in twee dagen genetisch worden gemodificeerd, terwijl de directe en indirecte oppervlaktefunctionalisatietechnieken elk in vijf uur kunnen worden uitgevoerd als ze correct worden uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om contaminatie van de bacteriële celcultuur te vermijden en de oppervlakken tijdens de functionalisatie te afdekken om fotobleken te voorkomen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het functionaliseren van oppervlakken voor zowel de directe als de indirecte controleschema's. Vergeet niet dat werken met ethidiumbromide uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen, bij het uitvoeren van deze procedure.

using-synthetic-biology-to-engineer-living-cells-that-interface-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.

Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Hier, wordt een geautomatiseerde workflow voor het uitvoeren van modulaire DNA "apparaat" vergadering met behulp van een modulaire klonen DNA vergadering methode op vloeistof aangestuurde robots gepresenteerd. Het protocol maakt gebruik van een intuïtieve softwaretool voor het genereren van vloeibare handler selectielijsten voor combinatorische DNA apparaat bibliotheek generatie, waaruit we met behulp van twee vloeibare behandeling platforms.

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

Het fabricageproces van een op PDMS gebaseerd, meerlaagse, microfluïdisch apparaat waarmee in vitro transcriptie-en vertalings Reacties (IVTT) gedurende langere perioden kunnen worden uitgevoerd, wordt beschreven. Bovendien wordt een uitgebreid overzicht gegeven van de hardware en software die nodig is voor het automatiseren en onderhouden van deze reacties voor langdurige duur.

Een Multilayer microfluidic platform voor de geleiding van langdurige cel-vrije genexpressie

Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

Goed gekarakteriseerde genetische delen zijn noodzakelijk voor het ontwerp van nieuwe genetische circuits. Hier beschrijven we een kosteneffectieve, high-throughput methode voor het snel karakteriseren van genetische delen. Onze methode vermindert kosten en tijd door celvrije lysaten, lineair DNA om klonen te voorkomen en akoestische vloeistofverwerking te combineren om de doorvoer te verhogen en reactievolumes te verminderen.

Snelle karakterisering van genetische delen met celvrije systemen

Dit protocol beschrijft het Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)-systeem dat wordt gebruikt bij het bouwen van synthetische cellen. Het schetst de belangrijkste fasen met representatieve resultaten in verschillende microcompartimenten. Het protocol heeft tot doel best practices vast te stellen voor diverse laboratoria in de synthetische celgemeenschap, waardoor de vooruitgang in de ontwikkeling van synthetische cellen wordt bevorderd.

Celvrij eiwitsynthesesysteem voor het bouwen van synthetische cellen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het ontwerpen, bouwen en leveren van tetracycline-gecontroleerde geïnduceerbare synthetische schakelingen. Het effect van de synthetische circuits op de eliminatie van parasieten en de expressie van cytokines kan worden bestudeerd door de gepresenteerde pijplijn te kanaliseren. Dit protocol is relevant voor onderzoekers die op synthetische circuits gebaseerde therapieën bestuderen bij infectieziekten.

Immunometabole circuits bij infectie voor het bevorderen van gastheergerichte therapieën

Dit artikel beschrijft een biofabrication benadering: depositie van stimuli reagerende polysachariden in de aanwezigheid van voorgespannen elektroden biocompatibel films kan worden gefunctionaliseerd met cellen of eiwitten te maken. We tonen een bench-top strategie voor de generatie van de films en hun fundamentele toepassingen voor het maken van interactieve biofunctionalized oppervlakken voor lab-on-a-chip toepassingen.

Het overbruggen van de Bio-elektronische interface met Biofabrication

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Leer hoe je E. coli genetisch kunt modificeren om programmeerbare materiaaloppervlakken te manipuleren. Deze methode combineert synthetische biologie met oppervlakfunctionalisatie voor toepassingen in moleculaire geneeskunde.

Met behulp van synthetische biologie levende cellen Engineer die interface met programmeerbare Materials

Meer video's verkennen