Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering

Het algemene doel van dit protocol is om nieuwe ijsbindende eiwitten of IBP's uit planten te identificeren door te testen op ijsbindende activiteit en het isoleren van native peptiden met behulp van ijsaffiniteitszuivering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van bevriezingstolerantie bij planten, met name ijsbindende eiwitten. Het grote voordeel van deze techniek is dat het u toestaat om ijsbindende eiwitten te isoleren uit native extracten zonder gebruik te maken van ingewikkelde zuiveringsmethoden.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de opzet van de apparaat kan moeilijk te bevatten zijn. Begin dit protocol met de splat-apparaatsetup zoals beschreven in de tekstprotocol. Om de expressie van ijsbindende eiwitten, of IBP's, te induceren in bevriezingstolerante grassen of andere bevriezingstolerante plantensoorten, koude-acclimatiseer planten gedurende maximaal één week bij vier graden Celsius onder lage lichtcondities.

Verkrijg ongeveer 0,1 gram bladweefsel door aan de basis van de stengel te snijden en vervolgens in een buisje van 1,5 milliliter te plaatsen. Vries het monster onmiddellijk in vloeibare stikstof in en bewaar het bij min 80 graden Celsius tot gebruik. Om de cellen te lyseren, vermaal het weefselmonster tot een fijn poeder met behulp van een mortel en stamper onder vloeibare stikstof.

Zorg ervoor dat de vloeibare stikstof tijdens het homogenisatieproces niet verdampt. Plaats de gemalen monsters onmiddellijk op ijs en laat de vloeibare stikstof volledig verdampen. Voeg vervolgens een milliliter van een native eiwitextractiebuffer toe en pipet om te mengen.

Schud de monsters voorzichtig een nacht bij vier graden Celsius en voer de resterende stappen bij dezelfde temperatuur uit. Verwijder de volgende dag cellulaire debris door de monsters gedurende vijf minuten te centrifugeren bij ongeveer 1.600 keer G. Bewaar de oplosbare fractie en centrifugeer nog eens vijf minuten als er nog cellulaire debris aanwezig is.

Verdunde monsters kunnen bij min 20 graden Celsius worden bewaard tot gebruik. Giet 100 milliliter hexaan in de externe kamer die is ingesteld met het gepolariseerde film en voeg vijf tot zes desiccatie-korrels toe om vochtophoping op de glijbanen te voorkomen. Voeg vervolgens een kleine hoeveelheid vacuümvet toe aan de plaat die het bad bedekt en draai om een strakke afdichting te garanderen en verdamping van het hexaan te voorkomen.

40 minuten voordat u met het experiment begint, plaatst u de koelblok in een polystyreen doos direct onder de plastic buis en bedekt u deze volledig met droogijs. Zorg ervoor dat de buis waterpas staat voordat u met de assay begint. Verwijder vervolgens het droogijs van de bovenkant van het koudeblok.

Test eerst deze procedure met water om te bepalen waar op de koelblok het monster zal vallen. Dompel de wegwerptip die is bevestigd aan een automatische pipet in immersieolie, waardoor het monster kan vallen in plaats van aan de buitenkant van de pipet te hechten. Gebruik een papieren handdoek om eventueel overtollig olie te verwijderen.

Zuig vervolgens 10 microliter water op. Plaats de pipet direct boven de plastic buis voordat u het water loslaat. Er zou een duidelijk splat-geluid te horen moeten zijn wanneer het water de koelblok raakt, waardoor een monolaag van ijskristallen ontstaat.

Plaats vervolgens een glazen microscoopdeksel op de druppelmarkering die met water is bepaald. Schap direct voordat u met de assay begint de lichtbron aan en schraap eventueel ijs dat zich aan de onderkant van de glazen kamer heeft gevormd. Voer vervolgens de splat-assay uit met het monster, zoals gedaan voor het water, door 10 microliter van het monster op het glazen deksel los te laten om een monolaag van ijskristallen te creëren.

Verwijder snel en voorzichtig het microscoopdeksel uit de koudeblok met behulp van een pincet en plaats het in het hexaanbad bovenop de polariserende film. Kijk onder de microscoop, plaats het microscoopdeksel in het gezichtsveld en pas de objectieflens aan zodat de kruispolarisatie de visualisatie van hoogcontrast ijskristallen mogelijk maakt. Bevestig de camera aan de microscoop en pas de instellingen aan naar macro om een duidelijke visualisatie van ijskristallen mogelijk te maken en het beeld vast te leggen.

Herhaal deze stappen voor alle monsters. Plaats doorgaans maximaal zes glijbanen met een ander monster in de hexaankamer. Zodra u klaar bent, zet u de lichtbron uit.

Plaats vervolgens een plastic plaat over het hexaanbad, zorg voor een strakke afdichting en laat de ijskristallen overnacht aanrijpen. Na incubatie, legt u beelden van de ijsfilms vast zoals voorheen. Nadat u het plantenweefsel zoals eerder koud-acclimatiseert, verzamelt u ongeveer 100 tot 150 gram van de gemalen biomassa in buisjes van 20 milliliter.

Vries de monsters onmiddellijk in en bewaar ze bij min 80 graden Celsius voor gebruik. Bereid het monster voor zoals eerder, met behulp van een verhouding van een op een voor de hersuspensie van het bladweefsel. Gebruik extra proteaseremmertabletten om de degradatie van IBP's door endogene proteasen te voorkomen.

Om cellulaire debris te verwijderen, zeef het lysaal door twee lagen kaasdoek drie keer. Pel het debris door centrifugatie bij 30.000 keer G gedurende 40 minuten bij vier graden Celsius. Verhoog vervolgens het volume van het monster tot 120 milliliter met behulp van native eiwitextractiebuffer en gebruik het lysaal onmiddellijk voor ijsaffiniteitszuivering om verlies van ijsbindende activiteit te voorkomen.

Nadat de ijsvinger is afgekoeld tot min 0,5 graden Celsius, dompelt u deze vervolgens onder in een buisje van 50 milliliter met koud gedistilleerd water. Voeg een paar ijsbrokjes toe om ijsnucleatie te vergemakkelijken en laat een dunne laag ijs op de vinger vormen. Dit proces duurt meestal tussen de 20 en 30 minuten.

Plaats het monster in een glazen beker van 150 milliliter met een kleine magnetische roerstaaf, die in een polystyreen container boven