Name: Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Leer ijsbindende eiwitten identificeren in planten via ijs-herkristallisatie-inhibitie en ijs-affiniteitszuivering. Deze methode isoleert native IBPs zonder complexe technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een NSERC (Canada) subsidie ​​aan VKW.

1. Inrichting Splat Setup <ol><li> Vul een temperatuur programmeerbare circulerend waterbad met ethyleenglycol (50% v / v in water). LET OP: De groene auto-ethyleenglycol kunnen worden gebruikt. </li><li> De externe kamer monteren Gebruik geïsoleerde kunststofbuis aan het waterbad hechten aan een dubbelwandige glazen kom. Isoleer de glazen schaal met polystyreenschuim en bedekken met een plastic petrischaal deksel. Snijd een 4/3 inch gat in de bodem van het polystyreen kamer, zodat de lichtbron kan worden gezien door de glazen kamer. </li><li> Monteer de externe kamer op een dissectie microscoop, uitgerust met een camera en een poort gepolariseerde 4x objectief met een 10x oculair lens. Plaatsen van een extra stuk gepolariseerde film in de bodem van de externe kamer. </li><li> Een klem 1-1,5 m buis (~ 5 cm diameter) op een retort stand en plaats in een grote polystyreen container, samen met een koelblok geplaatst onder de buis aan de onderzijde van de retort stand. </li></ol> 2. Bereiding van inheemse eiwitextracten van IRI Analysis <ol><li> Om de expressie van IBP in freeze-tolerante grassen of andere freeze-tolerante plantensoorten, koude acclimatiseren planten induceren tot 1 week bij 4 ° C onder omstandigheden met weinig licht (6 uur licht / 18 uur donker). Dit geldt niet voor monsters uit het veld die reeds zijn blootgesteld aan lage temperaturen en perioden acclimatisatie. </li><li> Vinden ongeveer 0,1 g bladweefsel door het snijden aan de basis van de stam en plaats in een 1,5 ml buis. Onmiddellijk knipperen bevriezen het monster in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Om cellen te lyseren, vermalen weefselmonster tot een fijn poeder met behulp van een vijzel onder vloeibare stikstof. Waarborgen dat de vloeibare stikstof niet verdampt tijdens het homogenisatieproces. </li><li> Plaats onmiddellijk gemalen monsters op ijs en kan de vloeibare stikstof volledig verdampen. Voeg 1 ml van een natuurlijk eiwit extractiOp buffer die 10 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl (pH 7,5), met twee EDTA-vrije proteaseremmer tabletten toegevoegd onmiddellijk voor gebruik. Pipet te mengen; niet vortex. LET OP: Extra additieven kan het nodig zijn om te worden gebruikt als de lysaat bevat secundaire metabolieten (zie Discussie). </li><li> Schud monsters overnacht (18-24 uur) bij 4 ° C. Voeren de overige stappen bij 4 ° C. </li><li> Verwijderen celresten door centrifugeren monsters bij ~ 16.000 xg gedurende 5 minuten. Bewaar de oplosbare fractie en centrifugeer gedurende nog 5 min of cellulair afval blijft. Geklaarde monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol> 3. Splat Assay Pre-experiment opzetten <ol><li> Giet 100 ml hexaan in de externe kamer ingesteld met de gepolariseerde film en voeg 5-6 uitdroging korrels geen vocht ophopen op de glijbanen. Voeg een kleine hoeveelheid vacuüm vet aan de plaat die het bad en draait om een ​​goede afdichting te waarborgen en verdamping van het hexaan voorkomen. </li&gt; <li> Koel het hexaanbad tussen -4 ° C en -6 ° C met behulp van het programmeerbare waterbad ongeveer 2-3 uur voordat het experiment wordt gestart. Zorg ervoor dat u de temperatuur van de hexaan met een thermometer controleert voordat u het experiment begint. </li><li> Plaats het koelblok in een polystyreenkast direct onder de plastic buis en bedek het geheel met droogijs, 40 minuten voor het starten van het experiment. </li><li> Zorg ervoor dat de buis gelijk is voordat u de test begint. Om te bepalen waar op het koelblok het monster zal vallen, test eerst de procedure met water en geef aan waar het monster met een marker druppelt (zoals hieronder beschreven). </li><li> Verwijder droogijs uit de bovenkant van het koude blok en plaats een glazen microscoopkap op het druppelmerk dat met water is bepaald. </li><li> Onmiddellijk voordat u de test start, zet u de lichtbron aan en schraap ieder ijs dat op de bodem van de glazen kamer is gevormd. Vermijd het aanhouden van de lichtbron tenzij ijskristallenWorden geconfronteerd om verhitting van de hexaan te verhinderen. </li></ol> 4. Uitvoeren van de Splat-analyse <ol><li> Doe de weggooipunt aan een automatische pipet (1-20 μL) in onderdompelolie, doe een papierdoekje uit met een overmatige olie. Deze stap laat het monster toe vallen, in plaats van aan de buitenkant van de pipet te vallen. OPMERKING: Het verwijderen van overtollige olie uit de pipet is cruciaal om ervoor te zorgen dat de oliedruppels niet op de ijskristallen vormen, waardoor de visualisatie moeilijk is. </li><li> Pipet 10 μL monster en plaats pipet direct over plastic buis voordat u het monster loslaat. Een duidelijk &#39;splat&#39;-geluid moet gehoord worden wanneer het monster de glazen deksel glijdt, waardoor een monolaag van ijskristallen wordt gecreëerd. </li><li> Verwijder de microscoopschuif uit het koude blok snel en zorgvuldig met behulp van een pincet en plaats het hexaanbad bovenop de polariserende film. </li><li> Kijk onder de microscoop, zet de microscoop dia in het zichtveld en de advertentiealleen de objectieflens, zodat de kruispolarisatie maakt de visualisatie van hoge contrast ijskristallen. Pas de vergroting 40x. </li><li> Bevestig de camera aan de microscoop en de instellingen op &quot;macro&quot; aan te passen aan duidelijke visualisatie van ijskristallen mogelijk te maken en vastleggen van het beeld. OPMERKING: Wachten tot 1 uur om ijskristallen te groeien kan een duidelijker beeld te geven. </li><li> Herhaal stap 4,1-4,5 voor alle monsters. Kenmerkend plaats tot 6 dia met een ander monster in de kamer hexaan. </li><li> Schakel de lichtbron en een plastic plaat over het bad van hexaan, waardoor een goede afdichting. Toestaan ​​ijskristallen een nacht hybridiseren (12-24 h, consistent blijft gloeiduur binnen een bepaalde assay). Na incubatie foto&#39;s maken van het ijs films zoals hierboven beschreven. OPMERKING: Sommige monsters kunnen sneller rekristalliseren dan anderen. Als er geen herkristallisatie blijkt na 12 uur, laat kristallen versmelten tot 24 uur te voorkomen dat recrystallisatie optreedt. </li></ol> 5. Splat Assay Data Analysis <ol><li> Upload de foto&#39;s naar een computer en direct vergelijken van de grootte van ijskristallen voor en na gloeien. Monsters met ijs herkristallisatie activiteit niet groeien, terwijl monsters zonder enige IRI activiteit herkristalliseren vormen duidelijk groter ijskristallen. Licht interferentie zal maken grote ijskristallen verschijnen in iets andere tinten en zijn dus gemakkelijk te zien. </li></ol> 6. Ice-affiniteit Materiaal van de Reiniging Setup <ol><li> Vul een temperatuur programmeerbare circulerend waterbad met ethyleenglycol. Groen auto ethyleenglycol kan worden gebruikt. </li><li> Sluit het bad een holle, koperen probe behulp geïsoleerde kunststofbuis 15. </li><li> Construct een polystyreen houder waarin een 150 ml bekerglas behaaglijk past. Maak een deksel van de container met een gat in het centrum voor de koperen koude vinger. </li></ol> 7.Bereiding van monsters voor Ice-affiniteitzuivering <ol><li> Koude acclimatiseren plantenweefsel zoals in hoofdstuk 2.1. </li><li> Verzamel ~ 100-150 g van de gemalen biomassa (stap 2.3) in 20 ml buizen en onmiddellijk knipperen bevriezen. Monsters kunnen bij -80 ° C voor gebruik worden bewaard. </li><li> Bereid monster zoals uitgelegd in sectie 2,3-2,5. Met een 1: 1 verhouding (mg weefsel: ml natief proteïne extractiebuffer) te resuspenderen bladweefsel. Gebruik extra proteaseremmer tabletten om de afbraak van IBP voorkomen door endogene proteasen. Opmerking: Als het weefselmonster te geconcentreerd, passen de verhouding 1: 2 of 1: 3 (mg weefsel: ml natief proteïne extractiebuffer). </li><li> Verwijderen van cellulair debrie, zeef lysaat tot 2 lagen kaasdoek, 3 keer. Pellet de afval door centrifugatie bij 30.000 xg gedurende 40 min bij 4 ° C. </li><li> Het volume van het monster tot 120 ml met behulp van natief proteïne extractiebuffer. Met het lysaat direct voor consumptie-affiniteitszuivering tevoorkomen dat het verlies van ijs bindingsactiviteit. </li></ol> 8. uitvoeren Ice-affiniteitzuivering <ol><li> Vóór zuivering stellen de programmeerbare waterbad afkoelen van -0,5 ° C tot -3 ° C met een snelheid van -0,04 ° C / h. OPMERKING: De koelsnelheid kan worden aangepast afhankelijk van het aanvankelijke volume van het monster. </li><li> Koel het ijs vinger tot -0,5 ° C en vervolgens dompel deze in een 50 ml buis met koud gedestilleerd water. Voeg enkele ijsblokjes op ijskiem vergemakkelijken en een dunne laag ijs vormen op de vinger. Dit proces neemt meestal tussen 20 en 30 minuten. OPMERKING: knobbeltjes op het ijs bedekt vinger worden uitgevlakt met een gehandschoende hand voorafgaand aan het plaatsen in de steekproef. Als een ijslaag vormt geen -0,5 ° C, laat de temperatuur tot -0,75 ° C. </li><li> Het monster in een 150 ml glazen beker met een kleine magnetische roerstaaf in een polystyreen container bovenop de magnetische roerder. Zorg ervoor dat het ijs vingergecentreerd en neergelaten ten minste halverwege in het vloeibare monster. Verzegeling van de container. </li><li> Laat het programma te lopen voor ongeveer twee dagen, het controleren van elke 24 uur. Zodra 50% van de steekproef is bevroren, stopt het programma. Incorporatie van IBP in het ijs halfrond resulteert in &quot;ice-etsen&quot;. OPMERKING: Zuivering experimenten kunnen worden uitgevoerd met grotere monstervolumes met de tijd waarop het programma loopt dienovereenkomstig aangepast. </li><li> Om het ijs halfrond de sonde te verwijderen opwarmen tot 4 ° C, spoel de halve bol met gedestilleerd water om niet-gebonden eiwit te verwijderen en vervolgens ontdooien bij 4 ° C. OPMERKING: De meeste IBP niet stabiel in water en een geschikte buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8 en 50 mM ammoniumbicarbonaat, pH 8) moet periodiek worden toegevoegd tijdens het ontdooiproces (ongeveer 1 ml / 2 uur) . Ijs halve bollen kunnen worden in aluminiumfolie gewikkeld en bewaard bij -20 ° C voorafgaande aan ontdooien. </li><li> Als het ijs-halfrond nog steeds bevattens pigment, of om het monster te zuiveren verhogen Herhaal stap 8.1-8.5 2-3 keer. Opmerking Hoewel de concentratie IBP lager kan zijn na meerdere rondes van zuivering, zuiverheid waardevoller dan verkregen wanneer het gezuiverde monsters worden geanalyseerd met MS. Indien voldoende materiaal beschikbaar is drie rondes van consumptie-affiniteitszuivering aanbevolen. </li></ol> 9. Identificatie van de IBP&#39;s <ol><li> Aangezien IBP zijn opgenomen in een groot volume na ontdooien van het ijs hemisfeer, concentreer de monsters. Concentreren monsters die -100 g weefsel tot ~ 1-3 ml gebruikt centrifugale concentratie buizen met een 3000 Da molecuulgewicht cut-off om het verlies van kleine eiwitten voorkomen. </li><li> Voorafgaand aan het verzenden van monsters voor MS Bepaal de eiwitconcentratie onder gebruikmaking van een eiwit kwantificering test zoals een BCA of Bradford assay. Schat de zuiverheid van de monsters door gelelektroforese zoals SDS-PAGE. Test de gezuiverde eiwitten IRI activiteit vóór sending voor MS opdat actief eiwit werd vastgehouden door de zuivering en concentratiestappen. </li><li> Gebruik geconcentreerde monsters direct voor massaspectrometrie analyse 10. </li></ol>

<ol><li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-stable+antifreeze+protein+from+grass%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256(2000).</li>
<li>Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+and+ice+nucleator+proteins+in+terrestrial+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods.</a> Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).</li>
<li>Davies, P. L., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+fish+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of fish antifreeze proteins.</a> FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).</li>
<li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+antifreeze+protein+activity+in+Antarctic+lake+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria.</a> Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).</li>
<li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+L%22%5BJournal%5D)">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).</li>
<li>Yeh, Y., Feeney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+proteins%3A+structures+and+mechanisms+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function.</a> Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).</li>
<li>Smolin, N., Daggett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+ice-like+water+structure+on+the+surface+of+an+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).</li>
<li>Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine-rich+antifreeze+proteins+from+snow+fleas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas.</a> Science. 310 (5747), 461(2005).</li>
<li>Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+proteins+in+the+Antarctic+springtail%2C+Gressittacantha+terranova%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%22%5BJournal%5D)">Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova.</a> J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).</li>
<li>Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+expand+the+repertoire+of+protein+structures+that+bind+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).</li>
<li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+a+Bacterial+Antifreeze+Protein+as+an+Adhesin+with+Ice-Binding+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity.</a> PLoS One. 7 (11), e48805(2012).</li>
<li>Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+antifreeze+protein+in+a+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperactive antifreeze protein in a fish.</a> Nature. 429 (6988), 153(2004).</li>
<li>Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification+and+antifreeze+activity+of+carrot+antifreeze+protein+and+its+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants.</a> Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).</li>
<li>Gupta, R., Dreswal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+stress+modulated+secretome+analysis+and+purification+of+antifreeze+protein+from+Hippophae+rhamnoides%2C+a+Himalayan+wonder+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant.</a> Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).</li>
<li>Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+antifreeze+proteins+by+adsorption+to+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biphys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice.</a> Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).</li>
<li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+ice-binding+proteins+from+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants.</a> Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).</li>
<li>Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-binding+proteins+confer+freezing+tolerance+in+transgenic+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.</a> Plant Biotechnol. J. , (2016).</li>
<li>Olijve, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+rapid+ice+crystal+growth+through+nonbasal+plane+adsorption+of+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).</li>
<li>Zakharov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice+Recrystallization+in+a+Solution+of+a+Cryoprotector+and+Its+inhibition+by+a+Protein%3A+Synchrotron+X-Ray+Diffraction+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study.</a> J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).</li>
<li>Capicciotti, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+ice+recrystallization+inhibitors+enable+freezing+of+human+red+blood+cells+with+reduced+glycerol+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations.</a> Sci. Rep. 5, 9692(2015).</li>
<li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li>
<li>Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiourea%3A+the+antioxidant+of+choice+for+the+purification+of+proteins+from+phenol+rich+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues.</a> Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).</li>
<li>Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-shell+purification+of+ice-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Ice-shell purification of ice-binding proteins.</a> Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).</li>
<li>Basu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+ice-binding+planes+of+antifreeze+proteins+by+fluorescence-based+ice+plane+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity.</a> J. Vis. Exp. (83), e51185(2014).</li>
<li>Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+a+cold+stress+associated+gene+family+in+cold+tolerant+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses.</a> BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).</li>
<li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor de succesvolle analyse en zuivering van IBP&#39;s, is het belangrijk om de temperatuur-gevoelige aard van sommige van deze eiwitten te begrijpen. Bepaalde plantaardige IBP instabiel bij temperaturen boven 0 ° C, wat resulteert in ontvouwen, neerslag en inactiviteit. Om actieve IBP te verkrijgen, is het vaak belangrijk dat planten worden verwerkt in een koude ruimte (~ 4 ° C) en monsters worden op ijs gehouden tijdens de experimenten. Een andere factor die meespeelt bij gebruik van hele cellen ruwe lysaten is de afb...

Ice-bindingseiwitten (IBP) zijn een diverse familie van beschermende eiwitten die zijn ontdekt in een aantal organismen, waaronder planten 1, 2 insecten, vissen 3 en 4 microben. Het belangrijkste kenmerk van deze eiwitten is hun unieke mogelijkheid om gericht en efficiënt adsorberen aan ijskristallen, het wijzigen van hun groei. IBP meerdere gedocumenteerde eigenschappen, met de twee meest kenmerk dat thermische hysterese (TH) en ijs herkristallisatie inhibitie (IRI). TH activiteit gemakkelijker waargenomen IBP geproduceerd in freeze-intolerant dieren. Deze activiteit leidt tot verlaging van het vriespunt van de bloedsomloop of interstitiële vloeistoffen organismen om bevriezing te voorkomen. Dit in tegenstelling tot freeze-tolerante organismen, wat onvermijdelijk zal bevriezen bij temperaturen onder het vriespunt, IBP&#39;s lijken te laag TH activiteit hebben. Ondanks de lage TH activiteit, een hoge IRI activiteit ijsk beperkenstal groei wordt vaak waargenomen met deze eiwitten. Voor de freeze-tolerante organisme, dit IRI activiteit waarschijnlijk helpt cellen tegen de ongecontroleerde groei van ijs in extracellulaire compartimenten. De &quot;matras toets&quot; model kan worden gebruikt om het mechanisme waarmee IBP de groei van ijskristallen 5 beschrijven. In dit model IBP specifiek te adsorberen aan het ijskristal aanbrengen met tussenafstanden, zodat watermoleculen alleen nemen de groeiende ijs kristalrooster in de ruimte tussen gebonden IBP. Hierdoor ontstaat een kromming die de opname van extra watermoleculen ongunstig maakt, een gebeurtenis die kan worden beschreven door de Gibbs-Thomson effect 6. De verankerde water clathraat hypothese verschaft een mechanisme voor de specifieke binding van IBP aan het ijskristal oppervlak waardoor de aanwezigheid van geladen residuen, in het bijzonder geplaatst op het eiwit bindingsplaats ijs, resulteert in de reorganisatie watermoleculen zodat ze overeenkomen met een of meer vlakken van het ijskristal rooster 7. TH activiteit kan worden gekwantificeerd door het verschil tussen de smelt- en vriespunt van een ijskristal in aanwezigheid van een IBP. Terwijl TH-activiteit is een algemeen aanvaarde methode voor het evalueren van de activiteit van IBP, de lage TH spleet geproduceerd door planten IBP (typisch slechts een fractie van een graad) gewoonlijk een hoge eiwitconcentratie, gespecialiseerde apparatuur en bestuurderservaring. Hoewel niet-IBP ijs kristalgroei beperken, is een eigenschap die door alle IBP en dus testen op IRI Activiteit effectief startscherm voor de aanwezigheid van IBP, met name voor de lage TH activiteit. De gebruikte deze activiteitstest methodologie is bekend als een &#39;splat assay&#39;, waarbij een eiwitmonster wordt snel ingevroren op een monolaag van kleine ijskristallen, die worden gemeten over een tijdsperiode te bepalen of producerenijs kristalgroei beperkt. In tegenstelling tot andere methoden om een ​​bron weefselmonster op de aanwezigheid van IBP screenen Deze techniek is toepasbaar op lage eiwitconcentraties in het traject van 10-100 ng, gebruik gemakkelijk vervaardigde materiaal en genereert data die snel en gemakkelijk wordt geïnterpreteerd. Het is echter belangrijk te benadrukken dat deze test geeft een eerste scherm IBP die moet worden gevolgd door het bepalen van TH en ijskristal vormen. De isolatie van natieve eiwitten is een uitdaging, waarvoor vaak informatie met betrekking tot de structurele en biochemische eigenschappen van een eiwit van belang. De affiniteit van IBP ijs maakt de isolatie van deze eiwitten met behulp van ijs als substraat voor zuiveringsdoeleinden. Aangezien de meeste moleculen vóór het ijswater begrenzing geduwd tijdens de groei van ijskristallen, trage groei van een ijs-halfrond in aanwezigheid van een IBP monster resulteert in een zeer gezuiverd monster, zonder grote quantitven van verontreinigende proteïnen en opgeloste stoffen. Deze werkwijze is gebruikt om IBP identificeren insecten 8, 9, 10, 11 bacteriën, vissen en planten 12 13 14. Daarnaast is de IBP-verrijkte fracties die met deze werkwijze kan ook worden gebruikt voor downstream biochemische analyse. Dit document beschrijft de identificatie van IBP in planten via de inductie en extractie van IBP, analyse van IRI activiteit de aanwezigheid van eiwitten, en de isolatie van eiwitten met behulp van ijs affiniteitzuivering bevestigen.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microcentrifugetubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable lab jack</td><td>Fisher</td><td>S63080</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Desaga MC2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brass probe</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera/camera port</td><td>Canon</td><td></td><td>Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port</td></tr><tr><td>Cheesecloth</td><td>Purewipe/Fisher Scientific</td><td>06-665-25A</td><td></td></tr><tr><td>Concentration tubes (0.5 mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>Concentration tubes (15 mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes (50 mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM12502</td><td></td></tr><tr><td>Cooling block</td><td>VWR</td><td>13259</td><td>Gebruik een metalen verwarmingsblok</td></tr><tr><td>Dehumidifier</td><td>Whirlpool</td><td></td><td>50 pint Energy Star dehumidifier; koop bij lokale leverancier</td></tr><tr><td>Dessciation beads</td><td>t.h.e. Dessicant/VWR</td><td>EM-DX0017-2</td><td>6-8 mesh size; 100% indicating</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus Tokyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double walled glass bowl</td><td>Generic</td><td></td><td>Koop bij lokale leverancier van laboratoriumglaswerk</td></tr><tr><td>Dry ice</td><td>Generic</td><td></td><td>Gebruik lokale leverancier; gevaarlijk&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA-protease inhibitor tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11836170001</td><td>Roche cOmplete mini</td></tr><tr><td>Ethylene glycol</td><td>Generic</td><td></td><td>Groene auto ethyleenglycol kan worden gekocht bij elke lokale bouwmarkt (d.w.z. Home Depot)</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090</td><td>Watervrij, 95%; gevaarlijk</td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56822</td><td></td></tr><tr><td>JA10/20 centrifuge</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large plastic Petri dish</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>Generic</td><td></td><td>Gebruik lokale leverancier; gevaarlijk&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI190M</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover slides</td><td>Fisher</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td>Generic</td><td></td><td>Koop PVC-pijp bij lokale bouwmarkt</td></tr><tr><td>Polarized film</td><td>Edmund Optics</td><td>43-781</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene foam</td><td>Generic</td><td></td><td>Kan worden gebouwd van polystyreen verpakkingsdozen</td></tr><tr><td>Poreclain mortar and pestle</td><td>Fisher</td><td>FB961</td><td></td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77627</td><td>110 &micro;m deeltjesgrootte</td></tr><tr><td>Retort Stand</td><td>Fisher</td><td>12-000</td><td></td></tr><tr><td>Small stir bar</td><td>Fisher</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>Temperature-programmable water bath</td><td>VWR</td><td>13271-118</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum grease</td><td>Dow Corning/Sigma Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Vinyl tubing</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van plant ice-bindende eiwitten through beoordeling van ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van ice-affiniteitszuivering

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Ice-bindende eiwitten (IBP) behoren tot een familie van stress-geïnduceerde eiwitten die worden gesynthetiseerd door bepaalde organismen blootgesteld aan temperaturen onder nul. In planten vorstschade ontstaat wanneer extracellulaire ijskristallen groeien, wat resulteert in het breken van plasmamembranen en eventuele celdood. Adsorptie van IBP ijskristallen beperkt verdere groei door een proces dat ijs herkristallisatie inhibitie (IRI), waardoor celbeschadiging verminderen. IBP laten ook de mogelijkheid om het vriespunt van de oplossing beneden het evenwicht smeltpunt, een eigenschap bekend als thermische hysterese (Th) activiteit onderdrukken. Deze beschermende eigenschappen hebben belangstelling voor de identificatie van nieuwe IBP&#39;s verhoogd als gevolg van hun potentieel gebruik in industriële, medische en agrarische toepassingen. Dit document beschrijft de identificatie van planten IBP m 1) de inductie en extractie van IBP in plantenweefsel, 2) de screening van extracten van IRI activiteit en 3) het isoleren en purificatie van IBP&#39;s. Na de inductie van IBP door blootstelling lage temperatuur worden extracten getest op activiteit met behulp van een IRI &#39;splat assay&#39;, waarbij de observatie van de groei van ijskristallen met een standaard lichtmicroscoop maakt. Deze test vereist een lage eiwitconcentratie genereert resultaten verkregen die snel en gemakkelijk te interpreteren, verschaffen een eerste screening voor ijs bindingsactiviteit. IBP kan daarna worden geïsoleerd uit contaminerende eiwitten door gebruik van de eigenschap IBP adsorbeert ijs, via een techniek genaamd &quot;ice-affiniteitzuivering. Gebruik cellysaten vanuit plantenextracten, kan een ijs hemisfeer traag worden gekweekt op een koperen probe. Dit omvat IBP in de kristallijne structuur van de polykristallijne ijs. Waarbij geen a priori biochemische of structurele kennis van de IBP maakt deze werkwijze voor het terugwinnen van actief eiwit. -Ijs gezuiverde eiwitfracties kunnen worden gebruikt voor verdere toepassingen inclusief het bepalen van peptide sequenties door massaspectrometrie en biochemische analyse van natieve eiwitten.

Voor het gemak van de set-up, figuur 1 en Figuur 2 worden als visuele representaties van de voor IRI analyse en ijs-affiniteitzuivering respectievelijk materiaal. IRI resultaten van analyse met extracten vanuit mosterd onkruid met en zonder IBP zijn weergegeven in figuur 3. Deze resultaten tonen aan dat extracten verzameld uit mosterd wiet, die niet bevriezen-tolerant, waren niet ...

Dit document beschrijft de identificatie van ijs bindende eiwitten uit freeze-tolerante planten door de beoordeling van ijs herkristallisatie inhibitie activiteit en daaropvolgende isolatie van natieve IBP gebruik ice-affiniteitzuivering.

Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Het algemene doel van dit protocol is het identificeren van nieuwe ijsbindende eiwitten of IBPs uit planten door het testen van ijsbindende activiteit en het isoleren van natuurlijke peptiden middels ijsaffiniteitszuivering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van vorstbestendigheid bij planten, specifiek met betrekking tot ijsbindende eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om ijsbindende eiwitten uit natuurlijke extracten te isoleren zonder het gebruik van ingewikkelde zuiveringsmethoden.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de opstelling van de apparatuur moeilijk te conceptualiseren kan zijn. Begin dit protocol met het opstellen van de splat-apparatuur zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de expressie van ijsbindende eiwitten, of IBPs, te induceren in vorstbestendige grassen of andere vorstbestendige plantensoorten, moeten de planten tot een week lang worden koudgeacclimatiseerd bij 4 °C onder omstandigheden met weinig licht.Verkrijg ongeveer 0,1 gram bladweefsel door aan de basis van de stengel te snijden en dit vervolgens in een buisje van 1,5 milliliter te plaatse

identification-plant-ice-binding-proteins-through-assessment-ice

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Ice bindingseiwitten (IBP), ook bekend als antivrieseiwitten, remmen ijsgroei en een veelbelovende toevoegingsmiddelen in de cryopreservatie van weefsels. Het belangrijkste instrument dat wordt gebruikt om IBP te onderzoeken is de nanoliter osmometer. We ontwikkelden een huis ontworpen koeling stadium gemonteerd op een optische microscoop en gecontroleerd met behulp van een custom-built LabVIEW routine. De nanoliter osmometer hier beschreven gemanipuleerd het monster temperatuur in een...

LabVIEW bediende Novel nanoliter Osmometer voor Ice Bindend Eiwit Onderzoeken

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Antivrieseiwitten (ACP's) binden zich aan specifieke ijsvlakken om ijsgroei te voorkomen of te vertragen. Fluorescentie-gebaseerde ijsvlakaffiniteitsanalyse (FIPA) is een wijziging van de oorspronkelijke ijsetsmethode voor de bepaling van AFP-gebonden ijsvlakken. AFP's zijn fluorescerend gelabeld, verwerkt in macroscopische enkelvoudige ijskristallen en gevisualiseerd onder UV-licht.

Het bepalen van de IJsbindende Vlakken van Antivries eiwitten door Fluorescentie-gebaseerde Ice Plane Affiniteit

Dit protocol combineert de karakterisering van een eiwitsteekproef door capillaire gelelektroforese en een snel-bindende screening voor geladen liganden door affiniteit capillaire elektroforese. Het wordt aanbevolen voor eiwitten met een flexibele structuur, zoals intrinsiek ongeordende eiwitten, om te bepalen van eventuele verschillen in bindende voor verschillende conformeren.

Analyse van intrinsieke wanorde van de AtHIRD11 en bindende naar metaalionen door capillaire gelelektroforese en affiniteit capillaire elektroforese

Benaderingen voor de biofysische en structurele karakterisatie van glycoproteïnen presenteren wij met de immunoglobuline vouw door biolayer interferometrie, isothermische titratie calorimetrie en röntgendiffractie.

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

We presenteren een protocol voor de real-time optische detectie van één labelloze eiwitten zoals ze worden uitgescheiden uit levende cellen. Dit is gebaseerd op de microscopie interferometrische verstrooiing (iSCAT), die kan worden toegepast op een verscheidenheid van verschillende biologische systemen en configuraties.

Label-Free Imaging van één eiwitten uitgescheiden door levende cellen via iSCAT microscopie

Dit protocol richt zich op de identificatie van eiwitten die binden aan inositol fosfaten of fosfoinositides. Het maakt gebruik van affiniteits chromatografie met biotinyleerd inositol fosfaten of fosfoinositides die zijn geïmmobiliseerd via streptavidine aan agarose of magnetische kralen. Inositol fosfaat of fosfoinositide bindende eiwitten worden geïdentificeerd door Western blotting of massaspectrometrie.

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Hier beschreven is een nabijheid etikettering methode voor de identificatie van interactie partners van de TIR domein van de NLR immuunreceptor in Nicotiana benthamiana bladweefsel. Ook is een gedetailleerd protocol voor de identificatie van interacties tussen andere eiwitten van belang met behulp van deze techniek in Nicotiana en andere plantensoorten.

TurboID-Based Proximity Labeling voor in Planta Identificatie van Protein-Protein Interaction Networks

Dit artikel presenteert een methode om eiwitkristallen te genereren die zijn afgeleid met I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftaalzuur) met behulp van microseeding om nieuwe kristallisatieomstandigheden in schaarse matrixschermen te genereren. De trays kunnen worden opgezet met behulp van vloeibare doseerrobots of met de hand.

De afleiding van eiwitkristallen met I3C met behulp van Random Microseed Matrix Screening

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van het proximity-labeling (PL)-experiment in komkommer (Cucumis sativus L.) met behulp van AT4G18020 (APRR2)-AirID-eiwit als model. De methode beschrijft de constructie van een vector, de transformatie van een construct door agro-infiltratie, biotine-infiltratie, eiwitextractie en zuivering van biotine-gelabelde eiwitten door middel van affiniteitszuiveringstechniek.

AirID-gebaseerde nabijheidsetikettering voor eiwit-eiwitinteractie in planten

Leer ijsbindende eiwitten identificeren in planten via ijs-herkristallisatie-inhibitie en ijs-affiniteitszuivering. Deze methode isoleert native IBPs zonder complexe technieken.

Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering (Video) | JoVE Journal

Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering

Meer video's verkennen