Methoden om te studeren epitheliale Transport Protein functie en de expressie in Inheemse darm en Caco-2-cellen gekweekt in 3D

Het algemene doel van dit protocol is om intestinale Caco-2-cellen in drie dimensies te laten groeien en het gebruik van de Ussing-kamer te demonstreren in onderzoek naar regulatie van de serotoninetransporter. De hier getoonde methoden kunnen belangrijke vragen beantwoorden in het gebied van epitheeltransport, zoals hoe de intestinale serotoninetransporter, SERT, wordt gereguleerd. Het grote voordeel van de 3D Caco-2 is dat ze cel-tot-cel en cel-tot-extracellulaire matrix-interacties nauwkeuriger weerspiegelen dan monolagen.

En de Ussing-kamertechniek maakt nauwkeurige metingen van transportfunctie in het intestinale epitheel mogelijk. De implicatie van de 3D, de Caco-culturen, strekt zich uit naar de ontdekking van therapeutische middelen omdat deze modellen screening mogelijk maken voor middelen tegen ziekten geassocieerd met veranderde transportfunctie. Hoewel deze methode inzicht biedt in de regulatie van de serotoninetransporter, kan het ook worden toegepast op onderzoek naar andere elektrolyttransporters zoals natrium en chloride.

Visuele demonstratie van deze technieken is cruciaal, aangezien het strippen van de seromusculaire laag en het monteren van de intestinale mucosa in Ussing-kamers moeilijk te leren zijn. Het demonstreren van de 3D Caco-2-celprocedures zal worden gedaan door Ishita Chatterjee, instructeur, en Anoop Kumar, een postdoc-fellow van onze groep. Het demonstreren van het strippen van de seromusculaire laag van muis ileum zal worden gedaan door Sangeeta Tyagi, een senior onderzoeksspecialist uit mijn lab.

Ook het demonstreren van het monteren van de gestrippe mucosa en het inbrengen ervan in Ussing-kamers zal worden gedaan door Shubha Priyamvada en Arivarasu Natarajan, instructeurs uit mijn lab. Om te beginnen, ontdooi de groeifactor-gereduceerde gelatineuze eiwit-oplossing een nacht op ijs in een koelkast van vier graden Celsius. Eenmaal ontdooid, bereid één milliliter, of 500 microliter aliquots voor.

Op de dag van de cultuur, prekoel de kamerslides op ijs. Voeg vervolgens 30 microliter van de gelatineuze eiwit-oplossing toe aan elke put van de achtputs-gekamerde glazen slide en verspreid het gelijkmatig. Terwijl de gelatineuze mix in de kamerslide of platen wordt geplaatst, moet erop worden gelet dat er geen bubbels ontstaan, omdat de cellen anders kunnen loskomen.

Plaats de gekweekte schaal in een celcultuurincubator van 37 graden Celsius gedurende 15 tot 30 minuten om de oplossing te laten stollen. Vervolgens, met behulp van trypsine, los confluente Caco-2-cellen van een kweekflacon. Tel vervolgens de cellen in een hemocytometer en centrifugeer ze bij 500 keer g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Re-suspendeer het resulterende celpellet in 3D Caco-2-medium om de suspensie van de gewenste dichtheid te verkrijgen. Gebruik de bereide celsuspensie om 4.000 cellen per put te zaaien op de glazen kamerslides en laat ze groeien gedurende 12 tot 14 dagen in een 5% kooldioxide bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius. Om de cellen te kleuren, aspireer eerst het medium en fixeer de cellen met 400 microliter 2% PFA.

Ga door met het fixeren van de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na het twee keer wassen van de cellen in PBS, permeabiliseer ze met 0,5% Triton-oplossing in PBS gedurende maximaal 15 minuten. Spoel de cellen twee keer in PBS-glycinebuffer en was vervolgens de gepermeabiliseerde cellen in IF-buffer gedurende tien minuten bij kamertemperatuur.

Blokkeer de cellen met 5% normaal geitenserum in IF-buffer. Bepaal vervolgens de cellen met 200 microliter primaire antilichaam verdund in IF-buffer aangevuld met 1% geitenserum gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur. Na incubatie, was de cellen driemaal met IF-buffer.

Bepaal de gewassen cellen met 200 microliter secundair antilichaam verdund in IF-buffer aangevuld met 1% geitenserum gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de cellen driemaal met IF-buffer gedurende tien minuten. Om de kamer voor de glazen slide te verwijderen, plaats de slide eerst in de slide-basishouder, schuif vervolgens de witte lifter door de houder tot het contact maakt met de rand van de putten.

Trek voorzichtig aan de kamer om deze van de slide te verwijderen. Gebruik een afgedekte zwarte doos om de slides te beschermen tegen licht. Monteer de slides met langzaam anti-fade medium en bedek ze met dekglasjes.

Laat de slides tien minuten bij kamertemperatuur drogen, verzegel ze met nagellak voordat ze worden afgebeeld. Isoleer het muizenileum volgens de procedure beschreven in het tekstprotocol. Open vervolgens met behulp van schaars het darm longitudinale richting open.

Bepaal de resulterende weefseldeel in ijskoud KBR-buffer voor gasvorming dat een micromolar indomethacin bevat gedurende tien minuten. Speld een ongeveer een centimeter lange darmsectie, mucosale zijde naar beneden, aan een plaat met 0,5 centimeter dik 7% agarose of uitgehard silicoonelastomeer. Gebruik een dissectie stereomicroscoop met bodemverlichting om de seromusculaire lagen te verwijderen.

Snijd vervolgens de seromusculaire laag met een veersnijmes. Gebruik fijne pincetten om de rand van de laag langs de lengteas van de darm op te tillen. Monteer tenslotte de mucosa voorzichtig op de pennen van de schuif.

Houd het gestrippe mucosale weefsel bij de randen vast om scheuren te voorkomen. Terwijl de gestrippe ilial mucosa op de pennen van de schuif wordt gemonteerd, moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om scheuren van het weefsel bij de pennen te voorkomen en om schade aan de randen van het weefsel te minimaliseren. Bereid voorafgaand aan de weefselbehandeling Krebs-oplossing voor, begast met 95% zuurstof, 5% kooldioxide.

Giet vervolgens de oplossing in een Ussing-kamer. Voeg 10 micromolar glucose toe als energiesubstraat aan het serossale bad en 10 micromolar mannitool voor het handhaven van osmotisch evenwicht aan het mucosale bad. Steek vervolgens de schuif met de gemonteerde mucosa in de kamer om zowel de apicale als de bas