Methoden om te studeren epitheliale Transport Protein functie en de expressie in Inheemse darm en Caco-2-cellen gekweekt in 3D

Het algemene doel van dit protocol is om intestinale Caco-2-cellen in drie dimensies te kweken en het gebruik van de Ussing-kamer aan te tonen in studies naar de regulatie van de serotoninetransporter. De hier getoonde methoden kunnen cruciale vragen in het veld van epitheliaal transport beantwoorden, zoals de wijze waarop de intestinale serotoninetransporter, SERT, wordt gereguleerd. Het belangrijkste voordeel van 3D Caco-2 is dat ze cel-cel- en cel-extracellulaire matrixinteracties nauwkeuriger weerspiegelen dan monoculturen.

En de Ussing-kamertechniek maakt nauwkeurige metingen van de transportfunctie in het darmepitheel mogelijk. De implicatie van 3D-Caco-culturen strekt zich uit tot de ontdekking van therapeutica, aangezien deze modellen screening mogelijk maken van middelen tegen ziekten die geassocieerd zijn met een veranderde transportfunctie. Hoewel deze methode inzicht biedt in de regulatie van de serotoninetransporteur, kan deze ook worden toegepast op studies naar andere elektrolytentransporteurs zoals natrium en chloride.

Een visuele demonstratie van deze technieken is essentieel, aangezien het strippen van de seromusculaire laag en het monteren van het darmslijmvlies in Ussing-kamers moeilijk aan te leren zijn. De procedures voor de 3D Caco-2-cellen zullen worden gedemonstreerd door Ishita Chatterjee, instructeur, en Anoop Kumar, een postdoc-fellow uit onze groep. Het strippen van de seromusculaire laag van het ileum van muizen zal worden gedemonstreerd door Sangeeta Tyagi, een senior onderzoeksspecialist uit mijn laboratorium.

Ook de montage van gestripte mucosa en het plaatsen hiervan in Ussing-kamers zullen worden gedemonstreerd door Shubha Priyamvada en Arivarasu Natarajan, instructeurs uit mijn laboratorium. Begin met het ontdooien van de groeifactor-gereduceerde gelatineuze eiwitoplossing gedurende de nacht op ijs in een koelkast van 4 °C. Bereid na het ontdooien aliquots van 1 mL of 500 µL.

Koel de kamerglaasjes op de dag van de cultuur voor op ijs. Voeg vervolgens 30 microliters van de gelatineuze eiwitoplossing toe aan elke put van het glazen kamerglaasje met acht putten en verspreid dit gelijkmatig. Let bij het uitplaten van het gelatineuze mengsel in het kamerglaasje of de platen goed op dat er geen luchtbellen ontstaan, omdat de cellen anders kunnen loslaten.

Plaats de kweekschaal gedurende 15 tot 30 minuten in een celkweekincubator van 37 °C om de oplossing te laten stollen. Detacheer vervolgens met behulp van trypsine confluente Caco-2-cellen uit een kweekfles. Tel daarna de cellen in een hemocytometer en centrifugeer ze 5 minuten bij 500 ×g bij vier graden Celsius.

Resuspendeer de resulterende celpellet in 3D Caco-2 medium om een suspensie van de gewenste dichtheid te verkrijgen. Zaai met de bereide celsuspensie 4.000 cellen per put uit op de glazen kamerglaasjes en laat deze 12 tot 14 dagen groeien in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 °C. Om de cellen te kleuren, wordt eerst het medium geaspireerd en worden de cellen gefixeerd met 400 µL 2% PFA.

Zet de cellen nog 20 minuten bij kamertemperatuur voor verdere fixatie. Na het tweemaal wassen van de cellen in PBS, worden ze gedurende maximaal 15 minuten gepermeabiliseerd met een 0,5% Triton-oplossing in PBS. Spoel de cellen tweemaal met PBS-glycinebuffer en was de gepermeabiliseerde cellen vervolgens tien minuten in IF-buffer bij kamertemperatuur.

Blokkeer de cellen met 5% normaal geiten serum in IF-buffer. Incubeer de cellen vervolgens gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur met 200 microliters primaire antilichamen, verdund in IF-buffer aangevuld met 1% geiten serum. Was de cellen na incubatie drie keer met IF-buffer.

Incubeer de gewassen cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur met 200 µL secundaire antilichamen, verdund in IF-buffer aangevuld met 1% geitenserum. Was de cellen drie keer gedurende tien minuten met IF-buffer. Om de kamer van de glazen objectglas te verwijderen, plaatst u eerst het objectglas in de houder voor de objectglasbasis en schuift u vervolgens de witte hef door de houder tot deze de rand van de wells raakt.

Trek de kamer voorzichtig los van het objectglas. Gebruik een afgedekte zwarte doos om de objectglazen tegen licht te beschermen. Monteer de objectglazen met een traag anti-fade medium en dek ze af met dekglasjes.

Laat de objectglazen tien minuten drogen bij kamertemperatuur en verzegel ze vervolgens met nagellak voordat u overgaat tot beeldvorming. Isoleer het ileum van de muis volgens de procedure die in het tekstprotocol wordt beschreven. Open de darm vervolgens in de lengterichting met een schaar.

Incubeer de resulterende weefselsnijde tien minuten in ijskoud gassing KBR-buffer met één micromolair indomethacine. Zet een darmsectie van ongeveer één centimeter lang, met de slijmvlieszijde naar beneden, vast op een plaat met 0,5 centimeter dikke 7% agarose of uitgehard siliconen elastomeer. Verwijder de seromusculaire lagen met behulp van een dissectiestereomicroscoop met onderverlichting.

Snijd vervolgens de seromusculaire laag door met een veder-scalpelblad. Gebruik fijne pincetten om de rand van de laag langs de longitudinale as van de darm op te tillen. Monteer tot slot de mucosa zorgvuldig op de pinnen van de schuif.

Houd het gestripte slijpvlies bij de randen vast om scheuren te voorkomen. Bij het vastzetten van het gestripte ileale slijmvlies op de pinnen van de slider moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om te voorkomen dat het weefsel bij de pinhoofden scheurt en om beschadiging van de weefselranden te minimaliseren. Bereid vóór de weefselbehandeling Krebs-oplossing voor, verzadigd met 95% oxygen en 5% carbon dioxide.

Giet vervolgens de oplossing in een Ussing-kamer. Voeg 10 micromolars glucose als energiesubstraat toe aan het serosale bad en 10 micromolair mannitol voor het handhaven van de osmotische balans aan het mucosale bad. Plaats daarna de schuif met het gemonteerde mucosa in de kamer om zowel de apicale als de basolaterale zijden van het weefsel bloot te stellen aan de Krebs-oplossing.

Equilibreer het ileumweefsel tien minuten lang in het bad. Behandel vervolgens de apicale zijde gedurende 30 minuten voor met 10 µM fluoxetine voor de meting van de flux van de mucosa naar de serosa. Behandel tenslotte de basolaterale zijde van het weefsel één uur lang met 10 ng/mL TGF beta 1, en incubeer daarna de apicale zijde 30 minuten met 20 nM tritiウム-gemarkeerde 5-HT.

Om de fluxsnelheden van de mucosa naar de serosa te berekenen, verzamelt u aliquots van 0,75 milliliter uit het serosale reservoir en vervangt u deze door identieke volumes van het badmedium om hydrostatische drukverschillen over de mucosa te voorkomen. Om het opgehoopte getritieerde 5-HT in het weefsel te kwantificeren, verwijdert u de mucosa van de slider. Was deze eenmaal met ijskoud KRB-buffer en plaats deze in een glazen kweekbuis.

Incubeer het slijmvlies gedurende een nacht in 0.5 milliliters 10%KOH bij 37 degrees Celsius om het weefsel te lyseren. Meet vervolgens de radioactiviteit in triplo in aliquots van 150 microliter van de lysaten met behulp van een vloeistofscintillatieteller. Meet de proteïneconcentratie in aliquots van drie tot vijf microliter van de lysaten met de Bradford-methode.

Hier worden Caco-2 cysten getoond die in 3D-kweek zijn gegroeid en zijn gekleurd voor actine, en Caco-2 3D-cysten die gelijktijdig zijn gekleurd voor actine, kernen en SERT-eiwit. SERT is zichtbaar in het luminale membraan en in subapicale compartimenten. Om het voordeel van Caco-2 3D-sferen ten opzichte van 2D Caco-2 monolagen verder te bevestigen, werd een western blot-analyse van de SERT-eiwitexpressie uitgevoerd.

De resultaten toonden een verhoogde expressie van het SERT-eiwit aan in Caco-2 3D-sferen vergeleken met 2D Caco-2-cellen. Tot slot werd een Ussing-kamer-systeem gebruikt om aan te tonen dat TGF beta de flux van mucosa naar serosa verhoogt, wat wijst op een toegenomen 5-HT-opname vanuit het luminale membraan en de waargenomen verhoogde 5-HT-accumulatie in de ileale mucosa. Dergelijke bevindingen worden ondersteund door de waargenomen gevoeligheid van de 5-HT-opname voor behandeling met fluoxetine, wat overeenkomt met de SERT-expressie op het luminale membraan.

Zodra deze techniek voor het strippen en monteren van de ileale mucosa onder de knie is, kan deze in 15 minuten worden voltooid. Bij het toepassen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de extravio intestinale preparatie na verwijdering uit het dier een beperkte levensvatbaarheid heeft, die maximaal drie uur kan bedragen. 3D Caco-2 cysten kunnen worden gebruikt voor diverse studies, zoals membraantransportgebeurtenissen, genexpressie of eiwit-eiwitinteracties van epitheliale transporters.

Na de ontwikkeling baant de 3D Caco-2 techniek de weg voor onderzoekers op het gebied van intestinal transport om vloeistofverplaatsing te verkennen en de pathofysiologie van darmziekten te bestuderen. Vergeet niet dat werken met radioactiviteit uiterst gevaarlijk kan zijn, en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van PBM en juiste descontaminatieprocedures. Na het bekijken van deze video zult u in staat zijn om Caco-2 cellen in 3D-culturen te kweken en deze culturen te gebruiken om de expressie van epitheliale transporters te onderzoeken.

U kunt de Ussing-kamer ook gebruiken om de serotoninetransportfunctie in de native muisdarm te bestuderen.