Een methode voor de extractie en analyse van lipiden voor het karakteriseren van bodemmicrobollen in experimenten met veel monsters

Het doel van deze video is om een methode te beschrijven die de doorvoer verhoogt terwijl er een balans wordt gezocht tussen inspanning en nauwkeurigheid bij de extractie van lipiden uit celmembranen van micro-organismen, voor gebruik bij het karakteriseren van zowel totale lipiden als de relatieve overvloed aan indicatorlipiden om de structuur van de microbiële gemeenschap in de bodem te bepalen en voor studies met veel monsters. In het veld moet u rekening houden met de heterogeniteit van de bodem door bodemmonsters op een manier te verzamelen die representatief is voor uw locatie. Om de microbiële gemeenschap op het moment van bemonstering te behouden, moeten de monsters vanuit het veld op ijs worden getransporteerd.

Zodra u terug bent in het laboratorium, verwijdert u wortels en stenen en breekt u kluiten op door middel van grove zeving. Dit dient daarnaast om uw monster te homogeniseren. Bereid de vriesdroging voor door submonsters in geschikte containers te plaatsen en vriesdroog deze zo snel mogelijk.

Zodra de bodems zijn gevriesdroogd, moeten ze in een afgesloten container met droogmiddel worden bewaard tot aan de extractie. Het is raadzaam om gevriesdroogde bodems bij -80 °C te bewaren. Ter voorbereiding op de extractie worden de gevriesdroogde bodems uit de opslag gehaald en vermalen. Methoden voor het malen zijn onder meer een kogelmolen, een kogelmeter of een vijzel en stamper.

Homogeniseer na het malen de bodemmonsters opnieuw grondig en bewaar deze in de vriezer. Al het laboratoriumglaswerk moet uiterst schoon zijn. Eventuele resten van detergent, vet of vuil kunnen de resultaten beïnvloeden door als een piek in het uiteindelijke GC-chromatogram te verschijnen.

De extracties worden uitgevoerd in centrifugebuisjes van Teflon van 30 milliliter, die eerst met oplosmiddel gespoeld moeten worden. Voeg twee tot drie milliliter hexaan toe aan de buisjes en vortex deze enkele seconden. Giet de hexaan over in een ander buisje en vortex.

Twee tot drie milliliter hexaan kan worden gebruikt om zes buisjes opeenvolgend te spoelen. Bewaar de met hexaan gespoelde buisjes ondersteboven in de zuurkast en voer het gebruikte hexaan af in een geschikte afvalcontainer. Glaswerk kan vlak voor gebruik worden gekaald of met oplosmiddel worden gespoeld.

Door middel van uitbranden wordt gewaarborgd dat het glaswerk schoon is door oxidatie van residuen bij een hoge temperatuur. Wikkel het glaswerk in twee tot drie lagen aluminiumfolie en plaats dit in de moffeloven. Stel de oven in op 450 °C en bak het glaswerk gedurende minimaal 4 1/2 uur zodra de oven het ingestelde punt heeft bereikt.

Laat de monsters minimaal één uur afkoelen voordat ze uit de oven worden gehaald. Label en weeg met hexaan gespoelde Teflon-buisjes. Voeg grond toe aan de Teflon-centrifugebuisjes en weeg opnieuw om de grondmassa te bepalen.

Maak per batch altijd ten minste twee blanco's en voeg een controlestandaard toe, bij voorkeur een bodem die eerder is geëxtraheerd, als u wilt verifiëren of de extractie correct is verlopen. Lipide-extracties. Bereid drie re-pipetten van vijf tot 10 milliliter voor voor fosfaatbuffer, chloroform en methanol.

Chloroform is een zeer dichte vloeistof met een lage oppervlaktespanning. Zorg ervoor dat de gedoseerde hoeveelheid nauwkeurig en consistent is. Houd de fles voor ten minste de helft gevuld met vloeistof.

Voeg in de zuurkast de reagentia in de volgende volgorde toe aan de bodem in de Teflon-buis: fosfaatbuffer, chloroform en methanol. Dit is de eerste fysieke extractie van lipiden uit uw monstermateriaal. De recepten voor de reagensoplossingen zijn opgenomen in het geschreven protocol.

De solventverhoudingen en de volgorde van toevoeging zijn belangrijk voor een goede scheiding van de organische en waterige fasen. Geef de bodems tijd om te bevochtigen na de toevoeging van de buffer voordat het chloroform wordt toegevoegd. Indien gewenst kunnen de extractiemiddelen worden gecombineerd en als één enkele aliquot worden toegevoegd voor de tweede en alle daaropvolgende extracties.

Sluit de Teflon-buisjes stevig af en dek ze af om ze tegen licht te beschermen. Plaats ze horizontaal op de schudmachine en zorg dat ze goed zijn vastgezet. Schud ze gedurende een uur met een hoge snelheidsinstelling.

Terwijl de buizen schudden, bereidt u voor elk monster twee lange glazen buizen als volgt voor. Label de buis, voeg hetzelfde volume chloroform toe als aan de bodem is toegevoegd en een gelijk volume fosfaatbuffer. Haal de Teflon-buizen uit de schudmachine bij 25 °C en centrifugeer de buizen gedurende 10 minuten bij 2.500 RPM.

Giet vervolgens, in de zuurkast met de lichten uit, het supernatant uit de Teflon-buis in een van de lange buizen. De fasescheiding zou zichtbaar moeten zijn in de glazen buis. De onderste laag bevat het organische oplosmiddel, voornamelijk chloroform, en de lipiden.

Deze extractie wordt herhaald. Giet de supernatant in de tweede buis die eerder is voorbereid. Nu zijn de lipiden fysiek tweemaal uit de bodem geëxtraheerd.

Voor de meeste bodems is dit voldoende. Sluit alle lange reageerbuizen stevig af met Teflon-gevoerde doppen en keer ze 10 keer om om te mengen. Laat de fasen gedurende de nacht door zwaartekracht scheiden.

Laat de monsters gedurende de nacht ongestoord staan zodat de twee fasen volledig gescheiden kunnen worden. Bewaar de monsters hiervoor in een donkere kast of bedekt met aluminiumfolie bij kamertemperatuur. Het is geen probleem om de extracten gedurende het weekend te laten scheiden.

Dag twee: isolatie van lipiden. Op dag twee wordt de waterige fase afgezogen en worden de lipiden geconcentreerd door het oplosmiddel te verwijderen in een vacuümevaporatiesysteem. De monsters kunnen ook worden gedroogd door ze in een water- of zandbad te plaatsen en er een zachte stroom stikstof op te richten.

De vloeistof in de buizen moet nu goed gescheiden en grotendeels helder zijn. Als dat niet het geval is, of als de interface tussen de twee lagen bijzonder dik is, laat de scheiding dan nog een dag voortduren. Plaats een vacuümaspirator in de zuurkast.

Dit is een kolf met zijarm die via Tygon-slang en een Pasteur-pipet is verbonden met een vacuümpomp. Terwijl de pomp draait, wordt de pipet gebruikt om de waterige fase in de kolf op te zuigen. Aspireer de bovenste laag en de interface.

Dit zal ongeveer 2/3 van de weg naar beneden zijn. Doe dit bij de twee tot drie sets glazen buizen. De bovenste laag kan enkele bodemdeeltjes bevatten.

Verwijder deze indien mogelijk. Combineer het extract uit de tweede en/of derde set buisjes met dat in de eerste twee door voorzichtig af te gieten. Probeer te voorkomen dat er vaste stoffen worden meegegoten en spoel de wanden van de buis door deze te roteren.

Gebruik voor elk monster een schone pipet en herhaal dit proces voor de overige monsters. Zodra de chloroformextracten zijn samengevoegd en enkele minuten hebben gestaan, dient het oppervlak van de vloeistof te worden geïnspecteerd. Vaak vormt zich een dunne laag residuwater.

Indien dit aanwezig is, aspirer dan voordat u verdergaat. Resterend water kan de dubbele bindingen van vetzuren aantasten, maar een zeer kleine hoeveelheid zou samen met de oplosmiddelen moeten meeverdampen terwijl de monsters worden gedroogd. Droog alle monsters volledig uit met behulp van het vacuümevaporatieapparaat.

Sluit de buisjes stevig af en bewaar ze in een vriezer bij 80 °C. Dag drie: verzeping en methylering. Zet eerst de waterbaden aan. Controleer het waterniveau en stel bad één in op 95 °C en bad twee op 80 °C. Voeg met een re-pipette één milliliter van het verzepingsreagens, Reagens 1, toe aan de gedroogde lipiden.

Sluit de dop stevig, vortex kort en plaats de buisjes in een rek. Wanneer deze stap is voltooid, plaatst u het rek met buisjes in het waterbad van 95 °C en wacht u vijf minuten. Haal het rek met buisjes uit het bad en controleer de buisjes op lekkages.

Dit zal zichtbaar zijn door bellen die als schuim in de buis omhoog komen. Draai de doppen van de lekkende buizen opnieuw vast of vervang deze. Verwarm de buizen nog 10 minuten verder in het waterbad.

Verlaag de temperatuurinstelling van het waterbad naar 80 °C en zet de incubatie voort voor nog eens 15 minuten. Verwijder de buizen en koel deze af door het rek in een bak met kraanwater te plaatsen. Gebruik geen ijswater.

Zodra de monsters zijn afgekoeld, voegt u twee milliliter van het methyleringsreagens, Reagent 2, toe aan elk monster. Sluit de dop opnieuw stevig af en vortex gedurende vijf tot 10 seconden. Granulaire zouten kunnen zichtbaar worden als precipitaat in de oplossing, wat soms gebeurt door een overschot aan reagentia.

Plaats het rek in het waterbad van 80 °C en incubeer gedurende 10 minuten. Haal het rek met buisjes uit het waterbad en plaats het in een pan met kraanwater om af te koelen. Schud het rek om het koelingsproces te versnellen.

Voeg met een repipetteerhulpmiddel 1,25 milliliters hexaan en methyltertiairbutylether, Reagens 3, toe aan elke buis om de fase te extraheren. Sluit de doppen stevig af en plaats de buizen 10 minuten op een schudmachine. Laat het rek met buizen na het schudden 10 minuten staan zodat de fasen kunnen scheiden.

Overbreng de organische fase, die nu de bovenlaag vormt, met een pasteurpijpet naar een kort glazen buisje. Het is raadzaam om zoveel mogelijk van de vloeistof te recoverable. Zeer kleine hoeveelheden van de waterige fase zullen de extractie niet beïnvloeden.

Herhaal de extractie van de waterfase door Reagens 3 toe te voegen, te schudden, de fasen te laten scheiden en de bovenste fase over te brengen. Afhankelijk van de conditie van de onderste fase kan dit nogmaals worden herhaald voor een totaal van drie overdrachten. Voeg 3 milliliter van de basiswassing, Reagens 4, wat een verdunde oplossing van natriumhydroxide is, toe aan de extracten in de korte buisjes.

Sluit de reageerbuisjes stevig af, vortex deze gedurende 20 tot 30 seconden en centrifugeer ze vervolgens drie minuten bij 2.000 RPM. Aspireer na het centrifugeren met een schone Pasteur-pipet de bovenste organische fase en breng deze over naar een amberkleurig flesje van vier milliliter. Wees zeer voorzichtig om geen deel van de waterige fase te aspireren.

De volgende stap is het indampen van het oplosmiddel tot droogheid in een vacuümindampingsapparaat. Dag vier: het voorbereiden van de extracten voor GC-analyse. Voeg met de pipetteerder 100 µL van Reagens 3 toe aan elk van de 4 ml vials die de gedroogde fase bevatten.

Vortex het monster en laat het vervolgens 10 minuten staan. Draag de gesuspendeerde FAME's met de tweede pipette voorzichtig over naar een GC-vial. Voeg een weitere aliquot van het oplosmiddel toe aan de vial van vier milliliter en vortex kortstondig.

Rol het flesje om ervoor te zorgen dat de resterende FAME's op de wanden van het flesje zijn opgelost. Gebruik opnieuw de tweede pipette om het oplosmiddel over te brengen naar het GC-flesje. Voltooi de overdracht door een derde aliquot oplosmiddel aan het flesje toe te voegen, te vortexen en over te brengen naar het GC-flesje.

Sluit het GC-viltje af en bewaar dit in de vriezer. Bewaar afgesloten GC-viltjes in de vriezer voorafgaand aan de analyse. GC-analyse.

Om dit systeem te gebruiken, moet de analyse worden uitgevoerd met een specifieke GC-kolom. De gaschromatograaf is uitgerust met een split/splitless-injectiepoort, voorzien van een glazen inletliner met een binnendiameter van 4 mm en een gedeactiveerde glazen wollen plug. De injectiepoort is ingesteld op 250 °C en wordt bediend in een constante drukmodus.

Het dragersgas is waterstof. Stikstof en lucht zijn nodig als ondersteuningsgassen voor de detector. Er wordt een Agilent Ultra 2-kolom gebruikt.

De kolom is 25 meter lang met een binnendiameter van 2 millimeter en een dikte van de stationaire fase film van 33 micrometer. De stationaire fase in deze kolom is 5%phenyl, 95%methylpolysiloxaan, ook wel bekend als een DB-5 type kolom. Voor de analyse van de lipidextracten wordt een aliquot van twee microliter geïnjecteerd met een split-ratio van 100:1 bij een oventemperatuur van 170 °C. Na injectie is de oven zo geprogrammeerd dat de temperatuur met vijf graden per minuut stijgt tot 300 °C, waarna deze 12 minuten wordt vastgehouden.

Er wordt een reeks injecties uitgevoerd volgens de MIDI-standaard en de resultaten worden gebruikt om aanpassingen te maken conform de instructies in de MIDI-handleiding. Zodra het systeem op deze manier is gekalibreerd, kunnen er af en toe kleine aanpassingen nodig zijn, maar over het algemeen zouden met deze parameters goede resultaten behaald moeten worden. Het MIDI-systeem genereert voor elk monster een rapport met een tabel die één regel per gerealiseerde piek bevat.

De software rapporteert de retentietijd van de piek, het piekareaal, de piekidentificatie, samen met de ECL of geschatte ketenlengte, een parameter die wordt gebruikt voor piekidentificatie, en een responsfactor, een parameter die wordt gebruikt om variaties en detectorrespons ten opzichte van de retentietijd te normaliseren. De ECL geeft aan waar een onbekende FAME elueert binnen een reeks lineaire FAME's. Als de retentietijd van een onbekende stof bijvoorbeeld halverwege die van een 12- en 13-koolstofketen elueert, wordt de ECL gerapporteerd als een 12,5-koolstofketen.

De software vergelijkt de ECL van elke piek met die van FAME's in een database en wijst bij overeenstemming de corresponderende naam toe aan de onbekende stof. In gevallen waarin twee FAME's in de database ECL's hebben die zeer dicht bij elkaar liggen, vermeldt de software beide namen, waarbij de dichtstbijzijnde eerst wordt opgesomd. De datatabellen uit de rapporten kunnen worden samengevoegd in een spreadsheet of database.

Na correctie voor de responsfactor kunnen de piekgebieden worden vergeleken met het piekgebied van een externe of interne standaard om tot een concentratie van het extract te komen. Door te delen door de massa van de geëxtraheerde bodem, kunnen de gegevens worden uitgedrukt als de massa FAME per gram bodem of, door ook het molecuulgewicht van elke FAME te gebruiken, als nanomoles per gram bodem. Biomarker FAME's kunnen vervolgens worden opgeteld om de biomassa van microbiële gilden te bepalen, waarna deze gilden verder kunnen worden geanalyseerd.

Bijvoorbeeld, hier zien we onbemeste prairies met meer FAME-biomassa dan bemeste prairies. Beide hebben meer biomassa dan nabijgelegen maïsvelden. Daarnaast zijn FAME's geassocieerd met specifieke functionele groepen zoals schimmels of bacteriën.

Deze associaties zijn specifiek voor het ecosysteem, dus het is belangrijk om deze niet te overgeneraliseren. Dit type analyse laat zien of bepaalde groepen overvloediger aanwezig zijn in specifieke omgevingen. Hier zijn schimmels overvloediger aanwezig in de onbemeste prairie dan in het maïsveld.

En tot slot is een andere manier om naar de algemene samenstelling van de microbiële gemeenschap te kijken, door de relatieve abundantie van alle FAME's tegelijkertijd te vergelijken met behulp van ordinatiemethoden zoals non-metrische multidimensionale schaling, NMDS, of principale componentenanalyse, PCA. In een ordinatie zullen microbiële gemeenschappen die meer op elkaar lijken, dichter bij elkaar staan. In onze voorbeeldgegevens liggen maïs en onbemeste prairie dus zeer ver uit elkaar, terwijl sommige bemonsterde bemoste prairiegebieden microbiële gemeenschappen hebben die lijken op die van maïs en andere lijken op de onbemeste prairie.

Microbiële gemeenschappen zijn vaak zeer variabel, zelfs binnen één enkele omgeving, waardoor ze niet altijd eenduidig te scheiden zijn. Na het bekijken van deze video zou men een goed inzicht moeten hebben in het proces waarbij lipide biomarkers uit de celmembranen van micro-organismen uit bodem worden geëxtraheerd. De extractie van fosfolipide-vetzuren is een effectieve, snelle en goedkope manier om microbiële gilden en de totale microbiële biomassa te beoordelen via de identificatie van unieke microbiële biomarkers.