Een methode voor de extractie en analyse van lipiden voor het karakteriseren van bodemmicrobollen in experimenten met veel monsters

Het doel van deze video is om een methode te beschrijven die de doorvoer verhoogt terwijl het evenwicht tussen inspanning en nauwkeurigheid wordt gehandhaafd voor de extractie van lipiden uit celmembranen van micro-organismen voor gebruik bij het karakteriseren van zowel totale lipiden als de relatieve abundantie van indicatorlipiden om de structuur van de microbiële bodemgemeenschap te bepalen en studies met veel monsters. In het veld moet u rekening houden met de bodemheterogeniteit door bodemmonsters te verzamelen op een manier die uw locatie vertegenwoordigt. Om de microbiële gemeenschap op het moment van bemonstering te behouden, moeten monsters van het veld op ijs worden getransporteerd.

Eenmaal terug in het laboratorium, verwijdert u wortels en stenen en breekt u klonten open door grof te zeven. Dit dient ook om uw monster te homogeniseren. Bereid u voor op het vriesdrogen door submonsters in geschikte containers te doen en zo snel mogelijk te vriesdrogen.

Zodra de bodems zijn vriesgedroogd, bewaar ze in een verzegelde container met droogmiddel tot extractie. Het is het beste om vriesgedroogde bodems bij 80 graden C te bewaren. Als voorbereiding op extractie verwijdert u vriesgedroogde bodems uit de opslag en vermaalt u ze. Methoden voor het vermalen omvatten een kogelmolen, kogelmeter of mortel en pester.

Na het vermalen van de bodem, homogeniseer uw bodemmonsters opnieuw grondig en bewaar ze in de vriezer. Alle laboratoriummateriaal moet scrupuleus schoon zijn. Eventuele restanten van wasmiddel, vet of vuil kunnen de resultaten beïnvloeden door als een piek in het uiteindelijke GC-chromatogram te verschijnen.

De extracties worden uitgevoerd in 30 milliliter Teflon centrifugebuizen, die met oplosmiddel moeten worden gespoeld. Voeg twee tot drie milliliter hexaan toe aan buizen en vortex gedurende een paar seconden. Decanteer het hexaan naar een andere buis en vortex.

Twee tot drie milliliter hexaan kan worden gebruikt om zes buizen stap voor stap te spoelen. Bewaar de met hexaan gespoelde buizen ondersteboven in de afzuigkap en doe het gebruikte hexaan in een geschikte afvalcontainer. Glaswerk kan onmiddellijk voor gebruik worden gedoofd of met oplosmiddel worden gespoeld.

Het muffling zorgt ervoor dat het glaswerk schoon is door oxidatie van resten bij hoge temperatuur. Wikkel het glaswerk in twee tot drie lagen aluminiumfolie en plaats het in de mofelhaard. Zet op 450 graden C en eenmaal de oven het ingestelde punt heeft bereikt, bak gedurende minimaal 4 1/2 uur.

Laat minimaal een uur koelen voordat u het uit de oven haalt. Label en weeg hexaan gespoelde Teflon buizen. Voeg bodem toe in Teflon gecentrificeerde buizen en weeg opnieuw voor bodemmass.

Maak altijd minimaal twee blanco's per batch en voeg een controlestandaard toe, bij voorkeur een bodem die eerder is geëxtraheerd, als u wilt verifiëren dat de extractie correct heeft gewerkt. Lipide extracties. Bereid drie vijf tot 10 milliliter re-pipettes voor fosfaatbuffer, chloroform en methanol.

Chloroform is een zeer dichte vloeistof met een lage oppervlaktespanning. Wees voorzichtig dat de hoeveelheid die u afgeeft nauwkeurig en consistent is. Houd de fles ten minste half gevuld met vloeistof.

Voeg in de afzuigkap de reagentia toe aan de bodem in de Teflon buis in de volgende volgorde: fosfaatbuffer, chloroform en methanol. Dit is de eerste fysieke extractie van lipiden uit uw monstermateriaal. De recepten voor reagensoplossingen zijn opgenomen in het schriftelijke protocol.

De verhoudingen van het oplosmiddel en de volgorde van toevoeging zijn belangrijk voor de juiste scheiding van de organische en waterige fasen. Geef de bodems tijd om nat te worden na de toevoeging van de buffer voordat u het chloroform toevoegt. Als het handig is, kunnen de extractiemiddelen worden gecombineerd en als een enkele aliquot worden toegevoegd voor de tweede en eventuele volgende extracties.

Doe de Teflon buizen stevig dicht en bedek ze om ze te beschermen tegen licht. Plaats ze horizontaal op de shaker en zorg ervoor dat ze goed vastzitten. Schud met een hoge snelheidsinsteling gedurende één uur.

Terwijl de buizen schudden, bereid u voor elke monster twee lange glazen buizen voor zoals volgt. Label de buis, voeg hetzelfde volume chloroform toe dat aan de bodem is toegevoegd en een gelijk volume fosfaatbuffer. Nadat u de Teflon buizen uit de shaker bij 25 graden C hebt verwijderd, centrifugeert u de buizen gedurende 10 minuten bij 2.500 RPM.

Decanteer vervolgens in de afzuigkap met de lichten uit het supernatant van de Teflon buis in een van de lange buizen. Fasescheiding zou zichtbaar moeten zijn in de glazen buis. De onderste laag bevat de organische oplosmiddel, voornamelijk chloroform, en de lipiden.

Deze extractie wordt herhaald. Giet het supernatant in de tweede buis die eerder is voorbereid. Nu heb je de lipiden fysiek twee keer uit de bodem geëxtraheerd.

Voor de meeste bodems is dit voldoende. Dek alle lange klassebuizen stevig af met Teflon-gelineerde doppen en draai 10 keer om te mengen. Scheid de fasen door zwaartekracht overnacht.

Laat de monsters ongestoord overnacht staan om de scheiding van de twee fasen te voltooien. Om dit te doen, houd de monsters in een donkere kast of bedekt met aluminiumfolie op kamertemperatuur. Het is oké om de extracten het weekend te laten scheiden.

Dag twee, isolatie van lipiden. Op dag twee wordt de waterige laag aangezogen en worden de lipiden geconcentreerd door het oplosmiddel in een vacuümevaporatiesysteem te verwijderen. De monsters kunnen ook worden gedroogd door ze in een water- of zandbad te plaatsen en een zachte stroom stikstof toe te passen.

De vloeistof in de buizen moet nu goed gescheiden en grotendeels helder zijn. Als dat niet het geval is, of als de interface tussen de twee lagen bijzonder dik is, laat de scheiding dan nog een dag doorgaan. Zet een vacuümaspirator op in de kap.

Dit is een zijarmfles verbonden met een vacuümpomp met een Tygon-bladslang en een weidepijp. Gebruik de pijp om de water